一种检测猪蓝耳病活疫苗jxa1-r株的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪蓝耳病活疫苗JXA1-R株的方法及试剂盒。检测方法是采用RFLP分析法，设计合成扩增JXA1-R株ORF1a3195～3682位核苷酸片段的引物，提取待检样品中的RNA，通过RT-PCR扩增JXA1-R株ORF1a3195～3682位核苷酸片段，扩增产物经限制性核酸内切酶SacⅡ切割后，产物进行琼脂糖凝胶电泳，出现长度487bp的条带时判断为该待检样品中含有猪蓝耳病活疫苗JXA1-R株。所述试剂盒主要包括上述的引物及限制性核酸内切酶SacⅡ。本发明应用普通PCR和一些常规仪器即可完成检测，步骤简单，缩短了检测时间，也显著降低了检测成本。
【专利说明】—种检测猪蓝耳病活疫苗JXA1-R株的方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学检测【技术领域】，具体涉及一种检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]高致病性猪蓝耳病是由高致病性的猪蓝耳病毒(又称猪繁殖与呼吸综合征病毒，porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起的母猪严重繁殖障碍、断奶猪生长迟缓及死亡的传染性疾病。该病自06年爆发以来，给国内养猪业造成了巨大的经济损失，目前绝大多数猪场使用PRRSV变异株(JXAl-R)弱毒疫苗(即猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株，或简称JXAl-R疫苗株)对该病进行预防。高致病性猪蓝耳病和普通猪蓝耳病可用RT-PCR (逆转录聚合酶链式反应)进行鉴别检测，但JXAl-R疫苗株与野毒株无法用现有的PCR (聚合酶链式反应)方法进行鉴别检测。JXAl-R疫苗株可在猪体内繁殖并产生病毒血症，这给高致病性猪蓝耳病的实验室诊断造成很大干扰，难以确定检测到的高致病性猪蓝耳病毒是疫苗毒还是野毒。
[0003]当前已有的JXAl-R疫苗株鉴别检测方法有以下两种:
方法一是使用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXAl-R株)实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，以荧光定量PCR技术为基础，在荧光定量PCR仪上进行反应，当有特定的扩增曲线时，则判定为高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒(JXAl-R疫苗株)阳性，否则判定为阴性，一般需要3个小时完成实验。该方法的核心技术包括反应体系和反应程序两部分，反应体系的关键是引物和探针的核苷酸序列及其与酶类和盐类的配制比例， 各种试剂必须按其推荐的比例进行配制；反应程序的关键是控制好最佳退火和延伸时间。该方法虽然准确快速，但由于实验所需的检测试剂盒及荧光定量PCR仪比较昂贵，导致检测成本较高。
[0004]方法二是采用测序法，以核苷酸的克隆和序列检测技术为基础，为常规序列分析方法。该方法需要的试剂包括特异性扩增引物、核酸提取试剂盒、通用的PCR试剂盒、核酸纯化试剂盒、PMD-18T载体试剂盒及DH5 α大肠杆菌，需要的仪器包括PCR仪、离心机、紫外透射仪、恒温培养箱，具体操作步骤是先用特异性引物扩增待检样品核酸的特异基因片段，将目的基因片段纯化后克隆入PMD-18T载体，再将克隆好的载体送往测序公司进行测序，最后将测得序列与高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒(JXAl-R疫苗株)进行比对，与疫苗毒核酸同源性较高，且特殊位点未发生变异的，则判定为JXAl-R株，检测一次一般需要7~10天时间。同样存在成本高的问题，另外检测周期也较长。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种简单快速的检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的方法。
[0006]PRRSV的基因组全长约15kb，含有9个开放阅读框(ORFs)，顺序依次为5’ -0RF1a-0RFlb-0RF2a-0RF2b-0RF-(3-7)3’。每个阅读框与相邻的阅读框均有少量的重叠。通过BLAST软件将JXAl-R疫苗株与2010年前(2010年开始使用JXAl-R株弱毒疫苗)NCBI上发表的PRRSV的其他毒株核苷酸序列进行比对，发现JXAl-R疫苗株在其ORFla 3195~3682位基因序列中特异缺失限制性核酸内切酶fee II的酶切位点，本发明利用限制性内切酶片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)分析技术原理，通过这一特殊缺失的酶切位点，结合 RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction，逆转录PCR)方法，对高致病性的猪蓝耳病JXAl-R疫苗株进行鉴别检测，即能准确鉴别JXAl-R疫苗株与其他PRRSV感染样品。[0007]本发明的具体技术方案如下:
一种检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的方法，是采用RFLP分析法，设计合成扩增猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株ORFla 3195~3682位核苷酸片段的引物，提取待检样品中的RNA，通过RT-PCR，用所述引物扩增JXAl-R株ORFla 3195~3682位核苷酸片段，扩增产物与限制性核酸内切酶fee II进行酶切反应，酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳后出现长度487bp的条带时判断为待检样品中含有猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株。
[0008]作为一种优选方案，上述检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的方法中，所述RT-PCR为一步法RT-PCR，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~2所示。
[0009]本发明还提供了一种检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的试剂盒，该试剂盒包括SEQID NO: 1~2所示的引物核苷酸序列和限制性核酸内切酶5^ II。
[0010]作为一种优选方案，上述检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的试剂盒，由一步法RT-PCR反应液和酶切反应液两组试剂组成，其中:
一步法RT-PCR反应液:10倍稀释的PCR缓冲液5PL，5U/^L的DNA聚合酶?μ?，200υ/μ?的反转录酶 lKL，IOmM 的 dNTPslPL，200υ/μ? 的 RNA 酶抑制剂 ?μ?，25mM 的 MgCl2 8μ?, 20μΜ的SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2所示的引物核苷酸序列各?μ?，以及无RNA酶灭菌水28μ? ;
酶切反应液:0.l%(w/v)BSA (牛血清白蛋白)2μ?, 10倍稀释的酶切反应缓冲液2μ?，限制性核酸内切酶fee II IμL，灭菌双蒸水5PL;
所述PCR缓冲液由Tris-HCl (三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐)、KCl和MgCl2的混合水溶液组成，pH值为8.5，其中Tris-HCl浓度为IOOmM, KCl浓度为500nM, MgCl2浓度为15nM ；所述酶切反应缓冲液由醋酸镁、二硫苏糖醇和醋酸钾的混合水溶液组成，其中醋酸镁的浓度为IOOmM, 二硫苏糖醇的浓度为5mM，醋酸钾的浓度为660mM。
[0011]本发明还提供用上述检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的试剂盒检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的方法，是将待检样品提取RNA后使用所述一步法RT-PCR反应液进行扩增，RT-PCR反应程序为:50°C 30分钟；94°C 2分钟；94°C 45秒，55°C 45秒，72°C I分钟，共40个循环；72°C，延伸8~10分钟；取部分扩增产物加入到酶切反应液中，37°C下反应I小时；终止反应取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过拍照观察电泳条带，如果出现487bp长度的片段判断为待检样品中含有猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株。
[0012]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
与荧光定量PCR方法相比，本发明主要采用了普通PCR方法，最终通过特殊位点的酶切反应鉴别检测野毒和疫苗度，所用试剂耗材相对价格便宜，检测成本较低。
[0013]与测序方法相比较，本发明在PCR反应后不需要再对PCR产物进行克隆测序，只需要应用酶切方法即可得到结果，操作简便高效，成本低。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为不同病毒株的RT-PCR产物经限制性核酸内切酶fee II的酶切电泳图，其中“阴”为阴性对照，I为高致病性蓝耳病JXAl野毒株，2为勃林格猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(VR-2332株)，3为猪繁殖与呼吸综合征毒株SB株，4为猪瘟疫苗(猪瘟威)，5为猪传染性胃肠炎病毒KY毒株，6为JXAl-R疫苗株，M为TAKARA宝生物公司生产的DL2000的标准核酸标记，从下至上分别是100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp核酸条带。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例进一步解释本发明，以使本领域技术人员能更好地理解本发明并能予以实施，但实施例并不作为对本发明的限定。除特殊说明外，均为本领域常规技术手段。
[0016]实施例中所述的“NX ”表示稀释N倍，其中N为自然数。
[0017]实验材料及试剂来源:JXAl-R疫苗株、猪瘟疫苗(猪瘟威)购自广东大华农动物保健品股份公司；勃林格猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(VR-2332株)购自广州市柏林农产品有限公司；高致病性蓝耳病JXAl野毒株核酸由广东大华农动物保健品股份公司馈赠；猪传染性胃肠炎病毒KY株由本实验室分离培养。限制性核酸内切酶fee II购自TAKARA宝生物公司。
[0018]实施例1
完成JXAl-R疫苗株鉴别检测`主要分为两个步骤实现。
[0019]第一步:疫苗和病毒液RT-PCR (O疫苗和病毒液的处理及核酸提取:
疫苗用5mL灭菌双蒸水稀释后备用；病毒液用灭菌双蒸水5倍稀释后备用。
[0020]处理好的疫苗和病毒液用体液病毒DNA/RNA柱子法小量抽提试剂盒(购自TAKARA宝生物公司，也可用其他核酸提取方法)提取核酸，保存备用。
[0021](2)核酸 RT-PCR:
RT-PCR的扩增引物如下:
上游引物 S66:5’ -TCTCCCAAAGATGATTCTCGAG-3’ (SEQ ID NO:1)；
下游引物 S88:5’ -AATCACCCGGAGAATAACCAC-3’ (SEQ ID NO:2)。
[0022]一步法RT-PCR反`应液:10倍稀释的PCR缓冲液5PL，5U/^L的DNA聚合酶?μ?，200υ/μ? 的反转录酶 lPL，IOmM 的 dNTPslPL，200U/^L 的 RNA 酶抑制剂 lPL，25mM 的 MgCl28μ?, 20μΜ的引物S66和S88各?μ?，抽提的RNA 3μ?,以及无RNA酶灭菌水28μ?。其中PCR缓冲液由Tris-HCl、KCl和MgCl2的混合水溶液组成，pH值为8.5，其中Tris-HCl浓度为IOOmM, KCl 浓度为 500nM，MgCl2 浓度为 15nM。
[0023]或者按TAKARA宝生物公司生产的一步法RT-PCR试剂盒(PrimeScriptwOneStep RT-PCR Kit Ver.2，目录号为DRR055A)使用说明进行配制，反应体系25μ?，具体为:PrimeScript I Step Enzyme Mix IM-L, 2X1 Step Buffer 12.5KL,浓度为 ΙΟμΜ 的上游引物 S66 lPL，浓度为 ΙΟμΜ 的下游引物 S88 ?μ?，抽提的 RNA 3μ?，RNase Free dH20 6.5μ?。[0024]以上反应体系配制好后置于PCR仪上进行RT-PCR反应，反应程序为:50°C 30min反转录；94°C 2min反转录酶灭活；94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 60s，共40个循环；72°C延伸8^10min ;最后8°C降温，反应结束。
[0025]第二步:PCR产物的酶切鉴定
酶切反应体系的配制:第一步获得的PCR产物10μ?，0.l%(w/v)BSA 2μ?,10Χ缓冲液(由醋酸镁、二硫苏糖醇和醋酸钾的混合水溶液组成，其中醋酸镁的浓度为IOOmM, 二硫苏糖醇的浓度为5mM，醋酸钾的浓度为660mM) 2μ?,限制性核酸内切酶fee II ?μ?,灭菌双蒸水5μL。
[0026]酶切反应体系配制好后轻轻混匀，置于37°C水浴锅(或恒温培养箱)中作用Ih (I小时)。
[0027]酶切反应结束后，加入2PL IOXloading buffer，混匀以终止反应，取5μ?酶切反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像系统中拍照。结果出现487bp目的条带，判定为JXAl-R疫苗株阳性；出现244bp条带，判定为非JXAl-R疫苗株(其他毒株在ORFla 3195~3682位核苷酸片段有fee II酶切位点)，如图1。由于其他毒株ORFla相应扩增片段经过fee II酶切后的片段长度为244bp，远小于487bp，在电泳条带上很容易区分开来，且电泳DNA分子量标准的梯度差值通常在IOObp以上，因此可粗略判断为分子量在460bp飞IObp左右的即为含JXAl-R疫苗株的样品。
【权利要求】
1.一种检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的方法，其特征在于，采用RFLP分析法，设计合成扩增猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株ORFla 3195~3682位核苷酸片段的引物，提取待检样品中的RNA，通过RT-PCR，用所述引物扩增JXAl-R株ORFla 3195~3682位核苷酸片段，扩增产物与限制性核酸内切酶fee II进行酶切反应，酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳后出现长度487bp的条带时判断为待检样品中含有猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株。
2.根据权利要求1所述的检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的方法，其特征在于，所述RT-PCR为一步法RT-PCR，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。
3.—种检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括SEQ IDNO: 1-2所示的引物核苷酸序列和限制性核酸内切酶II。
4.根据权利要求3所述的检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的试剂盒，其特征在于，该试剂盒由一步法RT-PCR反应液和酶切反应液两组试剂组成，其中: 一步法RT-PCR反应液:10倍稀释的PCR缓冲液5PL，5U/^L的DNA聚合酶?μ?，200υ/μ?的反转录酶 lKL，IOmM 的 dNTPslPL，200υ/μ? 的 RNA 酶抑制剂 ?μ?，25mM 的 MgCl2 8μ?, 20μΜ的SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2所示的引物核苷酸序列各?μ?，以及无RNA酶灭菌水28μ? ; 酶切反应液:0.l%(w/v)BSA 2μ?, 10倍稀释的酶切反应缓冲液2μ?，限制性核酸内切酶Sac II 1ML,灭菌双蒸水5PL ; 所述PCR缓冲液由Tri s-HCl、KCl和MgCl2的混合水溶液组成，pH值为8.5，其中Tris-HCl 浓度为 lOOmM，KCl 浓度为 500nM，MgCl2 浓度为 15nM ； 所述酶切反应缓冲液由醋酸镁、二硫苏糖醇和醋酸钾的混合水溶液组成，其中醋酸镁的浓度为IOOmM, 二硫苏糖醇的浓度为5mM，醋酸钾的浓度为660mM。
5.用权利要求4所述的检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的试剂盒检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的方法，其特征在于，待检样品提取RNA后使用所述一步法RT-PCR反应液进行扩增，RT-PCR反应程序为:50°C 30分钟；94°C 2分钟；94°C 45秒，55°C 45秒，72°C I分钟，共40个循环；72°C，延伸8~10分钟；取部分扩增产物加入到酶切反应液中，37°C下反应I小时；终止反应取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过拍照观察电泳条带，如果出现487bp长度的片段判断为待检样品中含有猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株。
【文档编号】C12Q1/68GK103498008SQ201310455113
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】宋志军, 祝卫国, 王东东, 罗小飞, 宋延华 申请人:广东温氏食品集团股份有限公司