具有移动容器且以连续方式生产培养物的连续培养装置制造方法

具有移动容器且以连续方式生产培养物的连续培养装置制造方法
【专利摘要】本发明涉及具有移动容器且以连续方式生产培养物的连续培养装置。用于以连续方式培养植物细胞、动物细胞或干细胞的方法和设置。
【专利说明】具有移动容器且以连续方式生产培养物的连续培养装置
[0001]本申请是国际申请日为2007年7月30日的国际申请PCT / US2007 / 016960进入中国、申请号为200780036125.8的题为“具有移动容器且以连续方式生产培养物的连续培养装置”的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]所述发明提供了允许在液体或半固体培养基中选择具有高生殖率和特殊代谢性质的活细胞的方法和设备。对于选择过程(适应进化)，遗传变异生物(突变体)在群体中产生，并与相同起源的其它变体竞争。具有最快生殖率的那些随时间过去相对比例增加，导致产生具有增加的生殖率的群体(和个别生物)。该过程可以提高用于工业过程或学术目的的生物的性能。本发明利用连续培养装置来实现活细胞(例如，原核生物、古细菌(Archaea)、病毒、真核生物、真菌、藻类、酵母、植物细胞、动物细胞或干细胞)的可行生产。本发明可以用于生产由活细胞生成的活性成分或生物制品。所述活性成分或生物制品又可以用作诊断剂、预防剂或治疗剂。
【背景技术】
[0003]对增加的生殖率(适合度)的选择需要持续的生长，后者通过生长培养物的定期稀释来实现。在现有技术中，这已经通过三条途径来实现:固体培养，系列稀释和连续培养，它们的主要差别在于稀释程度。
[0004]固体培养包含将小体积的生长培养物或细胞从培养皿重复转移至装有新鲜生长培养基的容器中。系列稀释包含将小体积的生长培养物重复转移至装有新鲜生长培养基的大的多的容 器中。当培养的细胞已经在新容器中生长至饱和时，重复该过程° 在文献(Lenski&Travisano:Dynamics of adaptation and diversification:alO，000-generation e xperiment with bacterial populations.1994.Proc Natl AcadSci USA.15 =6808-14)中，该方法已经用于实现持续培养的最长示范，在清楚地证实了生殖率在数年时间段中一致提高的实验中。该过程通常手工进行，相当费劳动力，且通过暴露于外部环境而被污染。如下段所述，系列培养也是低效率的。
[0005]选择速率或生殖率的提高速率依赖于群体大小(Fisher:The Genetical Theoryof Natural Selection.1930.0xford University Press, London, UK)。此外，在类似于
群体大小快速波动的系列转移情况下，选择与群体的调和平均数Oi)成比例(Wright =Sizeof population and breeding structure in relation to evolution.1938.Science87:430-431)，且因此可以通过循环过程中的最低群体估计出来。
[0006]通过连续培养可以维持群体大小，且因此使选择更高效。不同于系列稀释的连续培养包含相对更小的体积，从而用等体积的新鲜生长培养基定期替换小部分生长培养物。通过在循环稀释过程中使它的最小大小增加，该过程使有效的群体大小最大化。允许连续培养的设备称作“恒化器”(如果稀释在指定的时间间隔发生)和“恒浊器”(如果当培养物生长至特定密度时自动发生稀释)。[0007]为了简单，两类设备在下文中将归入术语“恒化器”组。恒化器由2个组在二十世纪五十年代同时发明(Novick&Szilard !Description of the chemostat.1950.Sciencell2:715-716)和(Monod:La technique de la culture continue—Theorie etapplications.1950.Ann.1nst.Pasteur79:390-410)。恒化器已经用于证实生殖率的短时间段快速提高(Dykhuizen DE.Chemostats used for studying natural selection andadaptive evolution.1993.Methods Enzymol.224:613—31)。
[0008]由于耐稀释的(静止的)变体的非计划中的选择，传统的恒化器不能维持长时间段选择高生殖率。这些变体能通过贴壁到恒化器表面上来耐受稀释，且通过这样做，竞争过(outcompete)较低粘性的个体，包括具有更高生殖率的那些，从而消除了设备的预期目的(Chao&Ramsdell:The effects of wall populations on coexistence of bacteria inthe liquid phase of chemostat cultures,.1985.J.Gen.Microbiol.131:1229—36)。 [0009]已经发明了一种方法和恒化设备(the Genetic Engine)来避免连续培养物的稀释抗性(PASTEUR INSTITUT [FR]&MUTZEL RUPERT [DE]提交的专利 US6, 686，194-B1)。该方法使用阀控制的流体转移来在2个恒化器之间定期移动生长培养物，从而允许每个在活性培养生长时间段之间灭菌和冲洗。定期灭菌循环通过破坏耐稀释变体来预防它们的选择。该方法和设备实现了该目的，但是需要在无菌(密封)环境中对几种流体进行独立的复杂操作，包括一种(NaOH)，它是极腐蚀性的和潜在极反应性的，迅速破坏阀，并产生污染和废物处理问题。恒化设备也是有限制的，因为没有采取措施来提供细胞生长的支持物。诸如Genetic Engine的设备和其它已知的技术不允许连续培养非悬浮生长的和/或作为粘附细胞生长的细胞。
[0010]存在一些类型的难以大量培养的细胞，这是由于细胞存活和生长所需的条件。认为这些细胞可以在连续培养方法提供的条件下生长。具体对于真核生物(例如，藻类、酵母、真菌、植物细胞、动物细胞和干细胞)情况是这样。
[0011]例如，通常如下培养人胚胎干细胞:分离干细胞群并将其转移进装有称作培养基的营养肉汤的实验室用塑料培养皿。细胞在培养皿表面分裂和扩散。培养皿的内表面通常涂布有已经处理过从而使它们将不分裂的小鼠胚胎皮肤细胞。该细胞涂布层称作饲养层。在培养皿底部具有饲养层的原因是，给人胚胎干细胞提供它们可以附着的粘性表面。同样，饲养细胞向培养基中释放营养物。最近，科学家已经开始设计不使用小鼠饲养细胞的培养胚胎干细胞的方式。这是重大的科学进步，因为它避免了小鼠细胞中的病毒或其它大分子可能传递给人细胞的危险。
[0012]在几天的过程中，内细胞群的细胞增殖，并开始挤满培养皿。当这发生时，将它们轻轻取出，并铺平板进几个新鲜的培养皿中。重复重新铺平板(replate)细胞的过程多次和多个月，且这称作传代培养。传代培养细胞的每个周期称作传代。6个月或更久以后，细胞群的原始细胞产生数百万个胚胎干细胞。已经未分化地在细胞培养物中增殖6个月或更多个月、是多潜能性的、且遗传上表现正常的胚胎干细胞，称作胚胎干细胞系。
[0013]一旦确立了细胞系，或甚至在该阶段之前，就可以将它们分批冷冻，并运输到其它实验室，用于其它培养和试验。但是，连续培养提供了抑制最大量的对活细胞加压和产生潜在污染源的操作的优点。当开始培养时，连续培养条件允许技术人员利用细胞的连续生产。一旦生成干细胞，就可以不间断地继续生产干细胞，以生成比现在一般使用的方法多得多的干细胞。

【发明内容】

[0014]因此，本发明的目的是，提供用于不受耐稀释变体干扰地连续培养细胞(包括原核生物、细菌、古细菌、真核生物和病毒)的改良的(且完全独立的)方法和设备。象其它恒化器一样，该设备提供用新鲜生长培养基定期稀释生长培养物的工具，用于在培养物和外部环境之间进行气体交换、无菌和作为恒化器或恒浊器自动操作的工具。
[0015]另外，本发明的目的是，提供用于连续培养细胞的改良的且独特的方法和设备，所述细胞不悬浮生长和/或作为粘附细胞生长，例如真核生物(例如，植物细胞、藻类、真菌、酵母、动物细胞或干细胞)和某些原核生物(例如，链霉菌)和可能某些古细菌和病毒。可以利用本发明培养的干细胞包括、但不限于胚胎干细胞、胎儿干细胞、脐带干细胞、胎盘衍生的干细胞和成年干细胞。可以利用本发明培养的成年干细胞包括、但不限于造血干细胞、骨髓干细胞、基质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞(例如，Hematopoietic Stem CellProtocols by C.Klug 和 C.Jordan, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2002,引入本文作为参考)。
[0016]本发明被设计用于没有任何流体转移(包括灭菌和冲洗功能)地实现这些目的。这在下述范围内代表着本发明相对于现有技术的具体优点:它避免了与灭菌和冲洗有关的危害和困难，包括含有腐蚀性溶剂的容器(containment)和复杂流体的转移、污染和由于培养物从一个容器向另一个容器转移引起的生长紊乱。
[0017]在充满了生长培养基的柔性无菌管内实现连续培养。培养基和室表面彼此静止，且通过使管道系统(tubing)蠕动穿过“门”或由防止培养的细胞在管区域之间移动的夹子无菌地细分管的点，定期且同时替换二者。为了进一步的安全，也可以(任选地)在培养容器的上游和下游添加紫外线(UV)门。
[0018]本方法和设备也是在下述范围内优于现有技术的改进:它们连续地、而不是定期地选择克服耐稀释变体对恒化器表面的贴壁，因为替换受影响的表面随着稀释过程串联发生。同样对于悬浮培养的细胞和作为粘附细胞生长的细胞，管道系统提供生长的连续支持物，其优点是不通过将细胞从一个容器向另一个容器转移而干扰细胞。
[0019]以瞬时方式细分管，从而使得存在含有饱和的(充分生长的)培养物的区域、含有新鲜培养基的区域和这二者之间的区域，其中存在一个或多个称作生长室或培养室的室，以形成生长室区域，生长培养物与新鲜培养基在其中混合，以实现稀释。门定期从管上的一个点释放，并在另一个点替换，以便通过从生长室分离去除生长培养物以及它结合的生长室表面和附着的静止细胞，并用新鲜培养基和新鲜的室表面替换。
【专利附图】

【附图说明】
[0020] 非穷尽地和非限制性地，一个可能的普通构型将包括下文所述的几个组分。在下文中，在优选实施方案的基础上示例性地解释本发明，因此参考附图，其中:
[0021]图1显示了设备的可能的构型的全景，其中:
[0022](I)代表含有设备的不同区域的柔性管道系统，所述区域是:上游新鲜培养基
(7)、生长室(10)、取样室(11)和处置的生长培养区域(15)[0023](2)代表允许根据用户确定的条件调节温度的恒温可控箱，且在其中可以放置:
[0024]a.所述生长室(10)，
[0025]b.所述取样室(11)，
[0026]c.限定所述生长室(10)的开始的上游门(3)，
[0027]d.限定所述生长室(10)的结束和所述取样室(11)的开始的下游门(4)，
[0028]e.限定所述取样室(11)的结束的第二个下游门(5)，
[0029]f.允许用户或自动控制系统监控生长培养物的光密度和操作反馈控制系统(13)的浊度计出)，从而在培养物密度(恒浊器功能)基础上控制管道系统(I)的运动，
[0030]g.一个或几个搅拌器(9)。
[0031]应当指出，在a— g中列出的设备元件也可以位于恒温可控箱的外面，或没有恒温可控箱。
[0032](7)代表未使用的柔性管道系统中的新鲜培养基，
[0033](8)代表装载有新鲜培养基填满的管道系统的桶(barrel)，以在操作过程中分配所述新鲜培养基和管道系统。
[0034](12)代表任选的紫外辐射门，
[0035](13)代表控制系统，它可以由与不同的监控或操作界面通讯的工具相联的计算机组成，所述工具如光密度浊度计、温度测量和调节设备、搅拌器和倾斜马达等，它们允许操作的自动化和控制，
[0036](14)代表任选的处置桶，它上面卷挠着装有处置的生长培养物填满的管道系统的管道系统，
[0037](15)代表位于所述取样室下游的处置的生长培养物。
[0038]图2显示了设备的两种可能的位置，它们例示了下述事实，即所述恒温可控箱(2)和与所述培养室有关的所述设备的其它部件可以倾斜至不同的角度，这是为了搅拌目的、气体循环和去除目的、和保证去除可能通过沉降到底部而避免稀释的颗粒化的(聚集的)细胞的目的。在细胞的生长不需要搅拌的情况下，所述设备也可以位于相同位置(例如，平坦位置或有一定角度)。
[0039]图3-9代表位于所述恒温可控箱(2)中适当位置且通过门(3)、⑷和(5)传入的所述柔性管(1)，在所有过程步骤中所述管都通过这些门停留，且所述管将根据它的蠕动运动通过这些门。
[0040]图3-注射之前充满培养基的管-状态TC。在管A、B、C、D和E的每个区域中的新鲜培养基。图3代表设备状态T0，其中在注射预期用于连续培养的细胞之前，所述柔性管的所有区域都装满新鲜培养基。
[0041]图4-刚注射后的室-状态Tl，在第一个周期刚开始时。培养物生长在区域C和B。图4代表在刚注射细胞株后所述柔性管的状态Tl。
[0042]图5-状态T2，在第一个生长周期过程中。培养物生长在区域C和B。图5代表设备状态T2，它是生长时间段，在这期间，培养物在定义为所述门(3)和(4)限定的生长室(10)的区域中生长。
[0043]图6-状态T3，在第二个生长周期刚开始时，紧在第一次管运动之后。培养物生长在区域D和C。图6代表在管和相关的培养基的第一次蠕动刚发生后的设备状态T3，它决定了第二个生长周期的开始，通过门3的运动导入新鲜管和培养基，同时通过门4的运动将等体积的管、培养基和生长培养物转移出生长室区域(10)和进入取样室区域(11)。关键是认识到，管、在管内的培养基和已经在所述培养基中生长的任意培养物都一起运动。流体转移仅通过生长室区域内的搅拌在新鲜培养基和生长培养物混合物一起的范围内发生。
[0044]图7-状态T4，在第二个生长周期过程中。培养物生长在区域D和C。图7代表设备状态T4，它是第二个生长周期；在这个周期过程中，在管蠕动后保留在生长室中的细胞现在可以利用与在该步骤过程中的剩余培养物相混合的新鲜培养基提供的营养物生长。
[0045]图8-状态T5，在第三个生长周期刚开始时，紧在第二次管运动之后。培养物生长在区域E和D。图8代表在管和包含的培养基的第二次蠕动刚发生后的设备状态T5，它决定了第三个生长周期的开始，通过门3的运动导入新鲜管和培养基，同时通过门4的运动将等体积的管、培养基和生长培养物转移出生长室区域(10)和进入取样室区域(11)。
[0046]图9-状态T6，在第三个生长周期过程中。培养物生长在区域E和D。图9代表设备状态T6，它是第三个生长周期；该步骤等价于状态T4，并指示其它操作的重复性质。使用注射器或其它可回收装置，可以在任意时间从取样室区域(11)取出选择的细胞的样品。
[0047]图10显示了决定构型中的门的牙的可能的概况，它由挤捏柔性管的2个堆叠牙组成。门也可以由挤压可移动带的单个牙、可去除的夹子或阻止细胞穿过门的运动的其它机制决定，且其可以沿着管在可变的位置交替放置和取下。
【具体实施方式】
[0048]在图3-9中描述了设备的基本操作。
[0049]在图1中显示了本设备的一种可能的构型，正如其在已经装载无菌培养基的新鲜管后出现的(显示为由所述门(3)、(4)和(5)分成区域A-H)。
[0050]通过注射(图4，区域B)将细胞导入生长室(图3)，可以给设备接种选择的细胞。然后允许培养物生长至需要的密度，并可开始连续培养(图5)。
[0051]通过管的门控区域的重复运动，进行连续培养。这包含门、管、培养基、和管内的任意培养物的同时运动。管总是以相同方向运动；含有新鲜培养基的未使用的管(且在下文中称作在生长室(7)的“上游”)将移动进生长室，并与其中剩余的培养物相混合，从而为其中含有的细胞的进一步生长提供基质。在导入生长室区域之前，通过经上游门(3)与生长室分开，将该培养基和它有关的管维持在无菌条件下。含有生长培养物的用过的管同时“向下游”运动，且经下游门(4)与生长室分开。
[0052]当存在一个或多个生长室时，生长室可以用于相同或不同的目的。例如，活细胞可以在具有相同或不同条件的第一个生长室和第二个生长室中生长。在一个实施方案中，第一个生长室可以用于生长细胞，且第二个生长室则可以用于在不同条件下处理活细胞。例如，可以处理细胞，以诱导所需产物的表达。在培养开始之前或之后，可以加入培养基自身的组分或添加剂。例如，所有组分或添加剂都可以在培养开始之前包含在培养基中，或可以在已经开始培养之后，将组分注射进一个或多个生长室。
[0053]门构型不是本专利申请的特殊点。例如，在给定的构型中，门可以设计成穿过同时运动的多个牙的一条链，或在另一个构型中，如图1所示在不同的同步链中分开。门可以由以如图10所示的堆叠方式挤捏管的2个牙制成的系统组成，从而通过牙之间的接触面的精确，避免管的G和H区域之间的污染。在另一个构型中，可以如下得到无菌门:将一个牙压靠到管的一侧，且由此将管紧密压靠到固定的底盘上，管在它的蠕动过程中沿着该底盘滑动，如图3至9标记3、4和5所示意的。在另一个构型中，使用下述机制来移动管，其中夹子绕着关于该设备的固定轴旋转。
[0054]通过已知的方式得到所述恒温可控箱(2)，例如与加热和冷却设备偶联的温度计。
[0055]当培养的细胞的生长或实验设计需要通气(气体交换)时，通过使用透气管来直接实现，且不使用机械辅助。例如且非限制性地，可以用硅氧烷制成柔性透气管。通气可以通过与环境气氛交换或通过与接触生长室或整个恒化器的人工确定的气氛(液体或气体)交换来实现。当实验要求厌氧生活时，柔性管可以是不透气的。例如且非限制性地，柔性不透气管可以由涂布的或处理过的硅氧烷制成。
[0056]对于厌氧进化条件，也可以将管的区域限制在特定的且受控的气氛区域内，以控制气体交换动力学。这可以如下实现:通过使所述恒温可控箱不透气，且然后向其中注射中性气体，或通过将整个设备置于气氛可控的室内。
[0057]通过与生长培养基一起替换生长室表面，实现静止变体的反选择。
[0058]另外将设备设计成可以以关于重力的多个方向运行，也就是说，如图2所示倾斜，范围最高达360°。
[0059]如果聚集的细胞可以落入上游并从而避免从室去除，则耐稀释变体可以通过彼此粘连而不是粘到室壁上来避免稀释。因此，希望管通常向下倾斜，从而使得聚集的细胞将落向在管移动周期过 程中将从生长室取出的区域。该构型包含使设备倾斜，从而使得下游门就重力而言低于上游门。
[0060]根据实验人员选择的条件，可以使生长室减压或过压。可以使用不同的调节压力的方式，例如通过它的上游末端和穿过生长室给新鲜培养基和管应用真空或压缩空气；通过交替挤捏和锁定在生长室上游或内部的管，可以实现另一种使管减压或过压的方式。
[0061]当在透气管中含有培养基时，可以在培养基内形成气泡。它们将上升到管密封区域的顶部，且在那里被捕获，直到该区域(和限定它的门)的运动将该区域释放进生长室、取样室或恒化器的终点(图6，分别是区域D-C、B或A)。如果设备向下倾斜，这些气泡将积聚在生长室或取样室中，并取代培养物。将设备设计成对于管运动周期定期向上倾斜，从而允许积累的气体从所述室去除。
[0062]设备的倾斜运动和/或外部设备(9)对生长室的摇动，可以用于降低生长室内细胞的聚集。或者，可以在灭菌之前在装满新鲜培养基的管中包含一个或几个搅拌棒，且在培养操作过程中磁力搅拌。在细胞生长不需要搅拌的情况下，机器可保持在相同位置。
[0063]上游门限定的新鲜培养基区域与培养室长度的成比例的长度，将限定在周期过程中达到的稀释程度。
[0064]可以通过定时来确定稀释的频率(例如，恒化器功能)。例如，可以在有限的时间范围收获干细胞，从而在细胞开始分化之前收集干细胞。或者，可以用反馈调节来确定稀释的频率，由此通过浊度计(图1-标记6)测量生长室中培养物的密度，且当浊度达到阈值时，发生稀释循环(恒浊器功能)。管可以是透明的或半透明的，以测量浊度。
[0065]取样室允许取出生长培养物，以分析实验结果、收集具有提高的生长速率的细胞用于进一步培养、保藏或功能执行或其它目的，例如计数群体、检查培养基的化学组成、或测试生长培养物的pH、或大量生产细胞(例如，真核生物例如干细胞、原核生物、古细菌和病毒)。为了实现生长室内PH的持久监控，管可以通过构建包含嵌入/结壳在管壁中的pH指示线。
[0066]任意形式的液体或半固体材料都可以用作本设备中的生长培养基。利用半固体生长基质的能力是胜过现有技术的显著进步。可以由用户选择和限定生长培养基，后者将限定通过选择过程提高的代谢过程。
[0067]如果需要，该设备可以含有多个生长室，从而使得一个生长室的下游门变成另一个的上游门。例如，这将允许一种细胞在第一室中单独生长，且然后用作第二室中第二种细胞(或病毒)的营养源。
[0068]本发明可以用于生产制剂，例如用于药物、疫苗或抗毒素的生物制品，其从本发明培养的细胞或它们的产物合成。所述生物制品可以用作诊断、预防或治疗剂。例如，本发明可以用于生产治疗性蛋白，例如胰岛素。 [0069]在优选的实施方案中，所述设备和/或方法可以以一定方式循环，以连续收集处于它们的未分化状态的干细胞。此外，可以修饰培养条件，以抑制干细胞的分化。例如，可以向培养基中加入干细胞分化抑制剂(例如，醛脱氢酶的抑制剂、磷酸肌醇3-激酶的抑制剂、TGF受体激酶抑制剂、TGF-B受体激酶抑制剂等)。或者，可以升高或降低过程条件，例如递送给培养基的氧的量，以提高某些干细胞的生长和/或减慢或提高干细胞的分化。
[0070]由于有些细胞的生长需要基质，可以向容器培养室中加入物理支持物或结构。在优选的实施方案中，可以在管内加入连续支持物，如由薄连续纤维样支持物结构构成的连续纤维床，可以加入容器培养室中，其允许细胞三维地生长。例如，所述支持物可以是纤维床，其提供细胞生长的支持物，所述细胞例如干细胞、植物细胞和其它类型的偏好这种支持物结构的细胞，或不可以悬浮生长，或作为粘附细胞生长，且在有些特定的条件或条件变化中，以进行靶突变的天然选择。
[0071]在优选的实施方案中，在本文引入作为参考的Huang等人，ContinuousProduction of butanol by Clostridium acetobutylicum immobilized in a fibrousbed reactor, Appl Biochem Biotechnol.2004Spring ;113_116:887.— 98 中所述的纤维状材料。也可以改变管的结构和大小，以无需将支持物结构掺入可移动的容器培养室。在优选的实施方案中，使用具有更小直径的管，从而细胞可以以更天然的方式贴壁，或将管用作天然支持物，无需有些粘附细胞的贴壁。
[0072]该设备和方法允许研究人员和产物开发人员通过持续生长(连续培养)进化出可悬浮培养的活细胞的任意株或在管壁上或在支持物上生长的不可悬浮培养的活细胞的任意株，所述支持物可以是管中的纤维床；得到的改进的细胞可以构成新株或物种。通过培养过程中获得的突变，可以鉴别这些新细胞，且这些突变可以允许新细胞与它们的祖先基因型特征区分开。该设备和方法允许研究人员通过下述选择任意活细胞的新株:通过天然选择过程，分离具有提高的生殖率的个体。本发明也提供了改进的和完全不同的方法和设备，其用于连续培养细胞，例如真核生物，(例如，酵母、真菌、植物细胞、藻类、动物细胞或干细胞)、原核生物、古细菌和病毒。
[0073]在另一个实施方案中，可以用发射体持久地或暂时地使细胞遭受至少一个辐射波、光波、X射线、声波、电磁场、放射性场、放射性介质或它们的组合。下面的出版物引入作为参考:Biof izika.2005.Tul_Aug, 50 (4):689-92:Bioelectromagnetics.2005Sep,26(6):431-9 ； Chem Gomnmri Kamb).20051anl4:, (2): 174—6:Biophys.T.2005Feb,88(2):1496—9:Bioelectromagnetics.1981,2(3):285—9:Sb Lek.1998,99 (4):455—64:Antimicrob Agents Chemother.2004Dec,48 (12):4662-4; T Food Prot.2003Sep,66(9):1712—5:Astrobiology.2006Apr,6(2):332-47:Life Sci Space Res.1970,8:33—8:Adv Space Res.1995Mar,15(3):211-4:Radiat Res.2006May,165(5):532-7 ；Mutagenesis.2004Sep, 19(5):349—54:Cancer Sc1.2006.Tun, 97 (6):535—9:ApplEnviron Microbiol.2006Mav, 72 (5):3608-14 ;和 Pol T Microbiol.2005, 54Suppl -J-11。
[0074]在另一个实施方案中，可以使设备的生长室区域使细胞持久地或暂时地处于不同重力。例如，可以在微重力环境中培养细胞。下面的出版物引入作为参考:.T GravitPhvsiol.2004Mar ；11 (I):75-80 ； Immunol Rev.2005Dec ；208:267-80 ；和 T GravitPhvsiol.2004Tul ；11 (2):P181_3。
[0075]本领域技术人员从本发明的前面的详述，显而易见与装置和方法有关的本发明的修饰和变化。 这些修饰和变化意在落入所附权利要求书的范围内。
【权利要求】
1.用于以连续方式培养活细胞的设备，其包含: 装有培养基的柔性管和表面，活细胞在其中可以悬浮生长或不悬浮生长，粘附或不粘附，其中所述管是透明的或半透明的，以测量浊度；和 夹子系统，各自能处于打开和关闭位置，夹子这样放置从而使得能将管分成: i)装有未使用的培养基的上游区域； ii)装有用过的培养基的下游区域；和 iii)置于所述上游和下游区域之间的用于培养所述细胞的生长室区域； 其中所述夹子系统被构造和排列以打开和关闭，以便打开在管的上游和下游区域之间的管的生长室区域的夹子和限定在管的上游和下游区域之间的管的生长室区域，且周期性地重新限定管的生长室区域，从而使得以前限定的生长室区域的第一部分变成管下游区域的部分，且以前限定的管的上游区域的部分变成管的生长室区域的部分。
2.根据权利要求1的设备，其中所述夹子系统被构造和排列，从而当所述夹子处于关闭位置时，每个夹子不相对于管运动。
3.根据权利要求1或2的设备，其中所述表面是管的内表面。
4.根据权利要求3的设备，其中所述表面是插入管内的连续支持物。
5.根据权利要求4的设备，其中所述表面是连续纤维。
6.根据权利要求1-5之一的设备，其中所述管是透气的。`
7.根据权利要求1-5之一的设备，其中所述管是不透气的。
8.根据权利要求1-7之一的设备，其中所述管包含硅氧烷或任意柔性材料。
9.根据权利要求1一8之一的设备，其中所述设备另外包含压力调节器，所述调节器被构建以改变管的生长室部分相对应环境压力的压力。
10.根据权利要求1-9之一的设备，其中所述管包含pH指示剂。
11.根据权利要求1一10之一的设备，另外包含温度调节器，所述调节器被构建以允许控制管的生长室区域的温度。
12.根据权利要求1-11之一的设备，其中所述设备另外包含搅拌器，所述搅拌器被构建以允许搅拌管的生长室部分。
13.根据权利要求12的设备，其中所述搅拌器包含至少一个搅拌棒。
14.根据权利要求1-13之一的设备，另外包含发射体，所述发射体被构建以使生长培养室区域遭受下述的至少一个:福射波、光波、X射线、声波、电磁场和放射性场。
15.根据权利要求1-14之一的设备，另外包含使生长室区域遭受不同重力的工具。
16.根据权利要求1-15之一的设备，其中所述生长室区域包含一个或多个装有培养基的生长室。
17.根据权利要求1-16之一的设备，另外包含用于测量管内的浊度的浊度计。
18.根据权利要求1-17的设备，其中每个夹子可绕着关于所述设备的固定轴旋转移动，从而能移动管。
19.根据权利要求1-18之一的设备，另外包含在管组合物或衬里中的pH指示剂，以允许测量培养基的pH。
20.根据权利要求1一19之一的设备，另外包含倾斜装置，以使生长室管向下倾斜以去除聚集的细胞，或向上倾斜以去除空气。
21.根据权利要求1-20之一的设备，其中所述设备允许连续培养细胞，其中所述细胞是真核生物、原核生物、古细菌和病毒，其中所述细胞不在培养基中悬浮生长，或不在管中悬浮生长。
22.根据权利要求1一21之一的设备，其中所述设备允许连续培养细胞，其中所述细胞是真核生物、原核生物、古细菌和病毒，且其中所述细胞作为粘附细胞生长。
23.一种以连续方式培养细胞的方法，其包含: a)提供柔性的、透明的或半透明的装有培养基的管和表面，其中活细胞可以在所述管中生长，和夹子系统，每个夹子能处于打开和关闭位置，夹子这样放置从而使得能将管分成: i)装有未使用的培养基的上游区域； ?)装有用过的培养基的下游区域；和 iii)置于所述上游和下游区域之间的用于培养所述细胞的生长室区域； b)用浊度计或测量浊度的其它装置测量管内的浊度； c)关闭选择的管上的夹子，以限定在管的上游和下游区域之间的管生长室区域，和将活细胞引入生长室区域； d)监控管内的浊度，直到得到培养物的有关的需要的生长； e)周期性地关闭和打开所选夹子，以重新限定管的生长室区域，从而使得以前限定的生长室区域的第一部分变成管下游区域的部分，且以前限定的管的上游区域的部分变成管的生长室区域的部分；和 f)重复步骤e)，直到已经培养足够量的细胞。
24.根据权利要求23的方法，其包含从下游区域的所述培养基取出一些活细胞的额外步骤。
25.根据权利要求23或24的方法，另外包含从下游区域分离所述活细胞。
26.根据权利要求23-25之一的方法，其中所述活细胞选自:藻类、真菌、酵母细胞、动物细胞、植物细胞和干细胞。
27.根据权利要求26的方法，其中所述活细胞是干细胞。
28.根据权利要求27的方法，其中所述活细胞选自:造血干细胞、骨髓干细胞、基质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞、脐带干细胞、胎盘衍生的干细胞和成年干细胞。
29.根据权利要求23—28之一的方法，其中细胞生长的表面是管的内表面。
30.根据权利要求23—29之一的方法，其中细胞生长的表面是连续纤维。
31.根据权利要求23—30之一的方法，另外包含在生长室区域中存在的一个或多个生长室中培养细胞。
32.根据权利要求23— 31之一的方法，另外包含在生长室区域培养一个或多个类型的细胞。
33.根据权利要求23—32之一的方法，其中所述管是透气的。
34.根据权利要求23—32之一的方法，其中所述管是不透气的。
35.根据权利要求23—34之一的方法，另外包含调节管的生长室部分相对应环境压力的压力。
36.根据权利要求23—35之一的方法，另外包含测量生长室区域中培养基的pH。
37.根据权利要求23-36之一的方法，另外包含用温度调节器调节生长室区域的温度，所述温度调节器被构建以控制管的生长室区域的温度。
38.根据权利要求23-37之一的方法，另外包含用搅拌器搅拌生长室区域中的培养基。
39.根据权利要求23-38之一的方法，其中所述搅拌器包含至少一个搅拌棒。
40.根据权利要求23-39之一的方法，另外包含使生长培养室区域遭受下述的至少一个:辐射波、光波、X射线、声波、电磁场和放射性场。
41.根据权利要求23-40之一的方法，另外包含使生长室区域遭受不同重力。
42.根据权利要求23的方法，其中步骤e)允许如下稀释:提供特定量的来自上游区域的新鲜培养基进入生长室，同时通过所述生长室的另一个末端，从生长室分离和取出等量的培养物到下游区域。
43.根据权利要求23或42的方法，其中步骤e)另外包含在每个生长周期之间移动管，从而使得生长室管与未使用的培养基的导入一起更新，从而预防耐稀释群体的可能的增殖，同时避免分离的生长室的可能的污染。
44.根据权利要求23—43之一的方法，其中所述细胞不悬浮生长。
45.根据权利要求23—44`之一的方法，其中所述细胞作为粘附细胞生长。
【文档编号】C12N1/14GK103725611SQ201310470441
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2007年7月30日 优先权日:2006年7月28日
【发明者】尤德斯·德克雷西 申请人:尤德斯·德克雷西