一种利用蓝藻高效利用太阳能生产生物燃气的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用蓝藻高效利用太阳能生产生物燃气的方法，是将蓝藻光合产氢过程与蓝藻生物质厌氧降解产沼气过程进行耦合，最大程度地转化蓝藻细胞光合作用过程中转化的太阳能。通过对藻细胞光合作用放氧活性的调控，光合产氢能力被提高200倍左右，而结束产氢过程的蓝藻生物质在通过活性污泥的厌氧降解过程进一步转化为富含甲烷和氢气的清洁能源-沼气。本发明解决了蓝藻对太阳能转化效率低的问题。
【专利说明】ー种利用蓝藻高效利用太阳能生产生物燃气的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及ー种利用蓝藻高效利用太阳能生产生物燃气的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]蓝藻(Blue green algae)是ー种能进行光合自养作用的原核生物,其光合作用的过程和机理与高等植物类似，可利用光能产生O2并通过固定CO2来合成有机物。蓝藻是一种细胞结构简单，遗传背景清晰的光合生物，随着两株模式蓝藻基因组序列測定完成，人们开始普遍从分子生物学水平研究蓝藻代谢相关的机理。
[0003]近年来，随着能源危机和环境污染给人类社会带来的压カ愈演愈烈，蓝藻的另ー个重要代谢一光合产氢也受到人们的重视。
[0004]前人的研究表明蓝藻光合产氢是一种经济的，可再生的产氢方式，获得更高的产氢效率是应用蓝藻光合产氢的必经途径。同时，微藻细胞生物质被证明是ー种高效，低成本的厌氧发酵产甲烷的底物。因此，将光合产氢后的藻细胞进行进ー步的资源再利用无疑是一条创新性的，可有效提高太阳能转化效率和降低蓝藻产氢成本的途径。
[0005]因此，一直以来，蓝藻光合产氢被视为低碳、经济的产氢方式。目前认为，蓝藻的光合作用效率是高等植物 的十几倍至上百倍，即便如此，其光合产氢过程中的光能转化效率依然低下，无法满足生产应用的要求。为此，我们首先选择从光合作用机制上对蓝藻的光合产氢的能量传递过程进行调控，通过提高藻细胞对太阳能的转化效率，促进蓝藻光合产氢能力。根据调控的情况，我们在分子生物学水平对藻细胞光合产氢的关键代谢途径进行监测，然后依据监测的结果，我们希望通过基因工程的手段定向的改造蓝藻细胞，从而获得高产氢能力的工程藻种，为蓝藻光合产氢的工程化应用提供基础材料和调控手段。
【发明内容】
[0006]本发明提供了ー种利用蓝藻高效利用太阳能生产生物燃气的方法，解决蓝藻对太阳能转化效率低的问题。
[0007]为了解决上述问题，本发明的技术方案如下:(I)藻种的培养；(2)光合产氢的诱导；(3)收集氢气。
[0008]上述光合产氢的诱导剂为一种光合抑制剂二氯苯基二甲脲(DCMU)。
[0009]上述诱导剂的添加量为I U Mo
[0010]本发明的步骤如下:(I)藻种的培养；(2)光合产氢的诱导；(3)收集氢气；(4)厌氧发酵产沼气。
[0011]上述蓝藻为鱼腥藻7120，在中科院水生生物研究所的编号为FACHB-418。
[0012]上述步骤(4)是利用产氢结束的藻细胞进行厌氧发酵降解产生沼气的。
[0013]一种蓝藻高产氢气的方法的步骤如下:
[0014]I)鱼腥藻7120的培养，恒温并持续光照，液体通气培养，藻种保存在固体琼脂BGII (+N)培养基平板上；
[0015]2)用培养基培养使得藻细胞生长到一定浓度，分装到玻璃样品管中，然后保持厌氧环境进行诱导，密闭试管；
[0016]3)收集完成光合产氢过程的藻细胞，再取藻泥和种泥，加入一定量的蒸馏水和PBS缓冲液，密闭后置于37°C水浴中进行持续发酵降解产沼气过程。
[0017]为了实现上述目的，本发明要用以下技术措施:藻种的保存和培养、藻细胞光合产氢诱导、种泥发酵菌群活性的诱导、蓝藻生物质厌氧降解产沼气、氢气的检测和定量、沼气主要成分的检测和定量。主要流程如图1所示，由三部分构成:藻细胞的培养，光合产氢的诱导，以及厌氧发酵产沼气。 [0018]本发明在调控蓝藻光合产氢的基础上，创造性地将蓝藻的自身光合产氢过程与藻细胞生物质厌氧发酵产甲烷过程进行结合，在国际上首次尝试开发蓝藻光合产氢和厌氧降解产甲烷偶联工艺。这对于提高太阳能转化效率，开发低成本的蓝藻光合产氢新工艺具有重大意义。本发明与现有工艺技术相比具有以下优点和效果:
[0019]1、见效快，效果显著，效率高。一般在几小时之内就能起到促进蓝藻光合产氢的效果，并且能够持续长时间产氢，十分有效地提高了氢气的产量；
[0020]2、沼气生产过程能耗低。使用废水处理厂污泥作为种泥，使用光合自养的微藻生物质作为底物；
[0021 ] 3、步骤简易、过程清洁环保。
[0022]说明书附图
[0023]图1本发明的流程图。
[0024]图2蓝藻一级种子液培养器皿示意图。
[0025]图3蓝藻二级种子液培养器皿简图。
[0026]图4氢气产量定量分析标准曲线图。
[0027]图5产氢蓝藻-鱼腥藻40倍光学显微镜照片
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
[0029]实施例1藻种的保存与培养:
[0030]A).藻种的来源:工艺所选蓝藻藻种为鱼腥藻7120，购自中科院水生生物研究所，编号为 FACHB-418。
[0031]B).鱼腥藻7120藻种的保存:藻种保存在琼脂浓度为1.5%的固体BGII (+N)培养基平板上。保存条件为恒温30°C，持续30 μ mol photon m^2s^(Model MQ-100)光照强度以及空气环境中，如图5所示。
[0032]C).培养基的配置:⑴所用培养基:BGII (-N)及BGII (+N)培养基，其成分如下:
[0033][A] BGII (-N):
[0034]Stock I (1000mL):NaCl-20.6g; K2HPO4.3H20—0.8g; Na2CO3-0.4g;
[0035]Stock II (IOOmL):柠檬酸一0.3g;柠檬酸铁铵一0.3g ；EDTA- 二钠一0.005g
[0036]Stock III (IOOmL):CaCl2—1.36g;[0037]Stock IV (IOOmL): MgSO4 ? 7H20—3.75g
[0038]Stock V (1000mL):H3BO3-2.86g;MnCl2.4H20—1.81g;
[0039]ZnSO4.7H20—3.75g;Na2MoO4.2H20—0.391g;
[0040]CuSO4.H2O-0.0079g; Co (NO3) 2.6H20—0.0494g。
[0041][B]BGII(+N):
[0042]Stock I (1000mL):NaCl-30.0g; K2HPO4 ? 3H20—0.8g; Na2CO3-0.4g;
[0043]Stock II (IOOmL):柠檬酸一0.3g;柠檬酸铁铵一0.3g ；EDTA- 二钠一0.005g
[0044]Stock III (IOOmL):CaCl2—1.36g;
[0045]Stock IV (IOOmL): MgSO4 ? 7H20—3.75g
[0046]Stock V (1000mL):H3BO3-2.86g;MnCl2.4H20—1.81g;
[0047]ZnSO4.7H20—3.75g;Na2MoO4.2H20—0.391g;
[0048]CuSO4.H2O-0.0079g; Co (NO3) 2.6H20—0.0494g。
[0049]具体配置方法如下:在约800mL双蒸水中一次加入50mL Stock 1、2mL Stock I1、2mT,Stock IIL2mL Stock IV、ImL Stock V 以及 0.61g Tris 喊，定容至 1000mL,调 pH 到 8.0，
然后高温高压灭菌，冷却后备用。
[0050]D).鱼腥藻7120培养:在如图2所示的通气试管中装入一定体积的BGII (-N)培养基，接入一定量的藻种，将新鲜藻液置于30°C温度和30 ii mol photon m_2s ^ ^ModelMQ-100)光照强度下，并通以C02:Air=2:98(V:V)混合气体进行培养。
[0051]实施例2鱼腥藻7120产氢的诱导
[0052]A).诱导:取上述培养条件下生长至对数期的藻液，转接入含有一定体积BGII (-N)培养基的通气试剂瓶中，如图3所示，将叶绿素浓度定到0.15iig/mL，然后将藻液置于30 °C温度和30 ii mol photon nT2s-1(Model MQ-100)光照强度下，并通以C02:Air=2:98(v:v)混合气体进行培养；
[0053]B).分装:72h的连续诱导培养之后，将藻液分装于60mL规格的玻璃样品管中，每管按40mL藻液的量进行分装；
[0054]D).厌氧诱导:用纯度为(99.99%)的纯氩气将管内剩余空间的空气全部排尽，以确保管内气体环境为厌氧状态。将处理好的样品管置于30°C温度和IOOiimol photonHf2,1 (Model MQ-100)光照強度下诱导藻细胞光合产氢。
[0055]实施例3产氢速率的测定:
[0056]A).氢气含量的检测:以实例3中所描述的处理条件持续特定时间后，用微量进样器从样品管上部空间取500 u L的气体样品，使用山东鲁南厂生产的SP6890型高压气相色谱仪进行检测和分析；
[0057]B).产氢速率的定量:使用外标法绘制氢气含量与峰面积之间的标准曲线，如图4所示。使用该标准曲线将所测得样品峰面积数值換算为氢气的物质的量，然后在样品叶绿素浓度以及产氢积累时间的基础上最终换算出鱼腥藻7120的产氢速率，氢气产率达到约17mL/mg。
[0058]实施例4蓝藻生物质厌氧降解产沼气
[0059]将结束光合产氢过程的藻细胞进行收集，取鲜重15g左右的藻泥(包含约0.3g干重的蓝藻生物质)，加入IOg左右的种泥，加入一定量的蒸馏水和PBS缓冲液。密闭后置于37°C水浴中进行持续发酵降解产沼气过程。
[0060]实施例5沼气组分的分析
[0061]沼气主要成分的检测和定量基本过称为:使用瑞典自动检测系统来监测发酵过程的产气体积，并用高效气相色谱对其他成分进行测定，以含有已知量的混合标准气体来对所测定的气体样品进行定性和定量的分析。
[0062]实施例6
[0063]一种可提高蓝藻太阳能转化效率的方法的步骤如下:
[0064]I)对鱼腥藻7120的培养条件是:以BGII (-N)作为培养基进行液体培养，藻液置于30 °C的恒温和30 μ mol photon nT2sd的持续24小时的光照强度下，并通以C02:Air=2:98(v:v)混合气体；菌种鱼腥藻7120采用持续继代的方保存在琼脂浓度为1.5%的固体BGII(+N)培养基平板上，保存条件为恒温30°C，持续30 μ mol photon π 2^1光照强度以及空气环境中；
[0065]2)将藻液分装到厌氧诱导试管中，加入光合放氧抑制剂，然后持续向藻液中通以高纯氩气，达到厌氧环境，密闭试管，将处理好的样品管置于30°C温度和lOOymol photonm-2s^(Model MQ-100)光照强度下诱导藻细胞光合产氢过程；
[0066]3)将结束光合产氢过程的藻细胞进行收集，取鲜重15g左右的藻泥(包含约0.3g干重的蓝藻生物质)，加入IOg左右的种泥，加入一定量的蒸馏水和PBS缓冲液。密闭后置于37°C水浴中进行持续发酵降解产沼气过程。
[0067]本发明通过对藻细胞光合作用放氧活性的调控，光合产氢能力被提高200倍左右，而结束产氢过程的蓝藻生物质在通过活性污泥的厌氧降解过程进一步转化为富含甲烷和氢气的清洁能源-沼气。光能转化效率是微藻生物质能源能否实现应用的根本决定因素。通过计算，整套工艺的光能转化效率超过3%，达到国际先进水平。
【权利要求】
1.一种利用蓝藻高效利用太阳能生产生物燃气的方法，其特征在于，步骤如下:(1)藻种的培养；(2)光合产氢的诱导；(3)收集氢气。
2.根据权利要去I所述方法，其特征在于，光合产氢的诱导剂是二氯苯基二甲脲。
3.根据权利要去2所述方法，其特征在于，诱导剂的添加量为Iμ M。
4.根据权利要去I所述方法，其特征在于，(I)藻种的培养；(2)光合产氢的诱导；(3)收集氢气；(4)厌氧发酵产沼气。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述蓝藻为鱼腥藻7120，在中科院水生生物研究所的编号为FACHB-418。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)是利用产氢结束的藻细胞进行厌氧发酵降解产生沼气的。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤如下: O鱼腥藻7120的培养，恒温并持续光照，液体通气培养，藻种保存在固体琼脂BGII (+Ν)培养基平板上； 2)用培养基培养使得藻细胞生长到一定浓度，分装到玻璃样品管中，然后保持厌氧环境进行诱导，密闭试管； 3)收集完成光合产氢过程的藻细胞，再取藻泥和种泥，加入一定量的蒸馏水和PBS缓冲液，密闭后置于37°C水浴中进行持续发酵降解产沼气过程。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，具体步骤如下: O对鱼腥藻7120的培养条件是:以BGII(-N)作为培养基进行液体培养，藻液置于30 °C的恒温和30 μ mol photon πiV1的持续24小时的光照强度下，并通以C02:Air=2:98(v:v)混合气体；菌种鱼腥藻7120采用持续继代的方保存在琼脂浓度为1.5%的固体BGII(+N)培养基平板上，保存条件为恒温30°C，持续30 μ mol photon π2^1光照强度以及空气环境中； 2)将藻液分装到厌氧诱导试管中，加入光合放氧抑制剂，然后持续向藻液中通以高纯氩气，达到厌氧环境，密闭试管，将处理好的样品管置于30°C温度和100 μ mol photonnf2S-1光照强度下诱导藻细胞光合产氢过程； 3)将结束光合产氢过程的藻细胞进行收集，取鲜重15g左右的藻泥，加入IOg左右的种泥，加入一定量的蒸馏水和PBS缓冲液。密闭后置于37°C水浴中进行持续发酵降解产沼气过程。
【文档编号】C12R1/89GK103571876SQ201310478449
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月14日 优先权日:2013年10月14日
【发明者】李十中, 陈明, 李纪红, 仉磊 申请人:清华大学