一种热稳定性改良的碱性木聚糖酶及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种热稳定性改良的碱性木聚糖酶及其编码基因和应用。本发明以Bacillus?subtillis?B230木聚糖酶xyn-B230的晶体结构为出发的结构，选择的突变位点为S23H和I129Y。与木聚糖酶xyn-B230相比，突变后的酶的热稳定性得到了明显的提高，在70℃保温120min仍能保留90%的酶活性。在75℃处理30min酶活性仍然能保持65%以上的活性。木聚糖酶xyn-B230-m具有比较好的性质，可以满足在造纸行业的使用。
【专利说明】一种热稳定性改良的碱性木聚糖酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种热稳定性改良的碱性木聚糖酶及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002]木聚糖是植物半纤维素的重要成份，是陆生植物细胞壁中最普通的半纤维素，除纤维素外，木聚糖是自然界中最丰富的多糖。在阔叶材和一年生禾本植物中木聚糖占植物原料干重的20%-30%，针叶材中木聚糖含量较少，一般为原料干重的7%-10%。
[0003]木聚糖酶是降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称，它主要包括作用于主链的内切-1，4-β-木聚糖酶和β-木糖苷酶以及其它辅酶。自从发现木聚糖酶可以用于纸浆的漂白以后，国内外对木聚糖酶研究和开发非常关注，它可以应用于生物制浆、纸浆漂白、废纸二次纤维回收、废纸脱墨处理及纸张表面处理等，特别是其在纸浆生物漂白中的巨大应用潜力早已引起各界同行的高度关注。无论是阔叶材还是针叶材硫酸盐浆及其它化学浆；无论是与传统的氯漂序相配合还是与先进的无氯漂序相配合，采用木聚糖酶处理均可以促使纸浆中残余木质素的降解和溶解性木质素的抽除，不但可以提高纸浆的白度和白度稳定性，改善纤维的滤水性和造纸性 能，而且可大大减少后续漂白过程中氯化物的用量，从而大大降低制浆和造纸工业对环境造成的污染。
[0004]和其它的酶制剂不同，用于造纸上的酶制剂，需要经历一个高温强碱的处理过程，因为制浆过程是在碱性的条件下，用高温蒸煮的方法除去木屑中的木质素。因此，用于纸浆漂白的木聚糖酶应是耐热和耐碱的。而到目前为止，工业上用于纸浆漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最适反应温度大多在45°C以下，这就要求在加酶之前先将纸浆的pH和温度调到适合木聚糖酶作用的范围，这是一个费时和费力的过程。
[0005]要解决以上问题，就需要获得适合在造纸工业条件下使用的耐热和耐碱的木聚糖酶。要获得特殊性质的木聚糖酶，可以考虑从以下几个方面展开工作:首先，可以从极端环境中分离具有嗜极微生物菌种，并从中克隆耐热耐碱的木聚糖酶。同时，还要积极加强包括传统微生物育种在内的诱变育种和分子育种，不断提升菌种木聚糖酶基因的表达量和产品的性能。其次，通过基因工程和蛋白质工程等现代生物技术手段对木聚糖酶基因进行分子改造，提高木聚糖酶的稳定性和对不良外界条件的抗逆性，筛选出符合不同应用领域要求的木聚糖酶基因。因此提高该木聚糖酶的热稳定性，使其能够有效地在各领域上获得更好的应用。
[0006]目前通过蛋白质工程的手段在酶分子改造方面已经有很多成功的例子，特别是在提高酶的热稳定性。定点突变即理性设计是在已知酶的结构与功能的基础上有目的、有针对性地改变酶的某一活性基团或模块，最终获得特定氨基酸残基得具有性质得到预期改变的蛋白质，该技术已被广泛用于酶分子的改造。
[0007]本发明以目前在纸浆和造纸上已经使用的来源于芽孢杆菌的木聚糖酶xyn-B230为出发材料，通过系列定点突变，最终得到了一个热稳定性提高的木聚糖酶xyn-B230-m。与木聚糖酶xyn-B230相比，突变后的酶的热稳定性得到了明显的提高，在70°C保温120min仍能保留90%的酶活性。在75°C处理30min酶活性仍然能保持65%以上的活性。木聚糖酶xyn-B230-m具有比较好的性质，可以满足在造纸行业的使用。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是通过对来源于芽孢杆菌的木聚糖酶xyn-B230的改造，使改造后的木聚糖酶xyn-B230-m在高温时稳定性提高，使其能够更好在高温强碱性的纸浆生物漂白中发挥降解原料中木聚糖的作用，促使纸浆中残余木质素的更好降解和溶解性木质素的抽除。
[0009]本发明的目的是提供一种优化改良的木聚糖酶xyn-B230_m[0010]本发明的再一目的是提供优化改良的木聚糖酶基因。
[0011]本发明的再一目的是提供包含上述的木聚糖酶基因的重组载体。
[0012]本发明的再一目的是提供包含上述的木聚糖酶基因的重组菌株。
[0013]本发明的再一目的是提供上述木聚糖酶xyn-B230_m的应用。
[0014]以Bacillus subtillis B230 木聚糖酶 xyn_B230 的晶体结构(PDB:1IG0)为出发的结构，选择的突变位点，为了提高来源于芽孢杆菌的木聚糖酶xyn-B230的热稳定性，利用生物计算和蛋白质工程手段对xyn-B230中可能影响其热稳定性的关键氨基酸进行了突变研究，这些氨基酸分别是第23位的S突变为H、第45位的N突变为1、第55位的D突变为P、第60位的H突变为Y、第61位的S突变为D、第65位的N突变为D、第75位的N突变为T、第129位的I突变为Y、第149位的T突变为D、第185位的Y突变为F，以及进一步对热稳定性有所提高的第23位的S突变为H和第129位的I突变为Y，进行组合突变。最后经过优化改良的木聚糖酶xyn-B230-m在75°C的热稳定性得到了明显的提高，可在造纸应用中显示出巨大的应用潜力。
[0015]通过对每个突变体进行酶学性质的分析，最终获得了热稳定性明显提高的木聚糖酶xyn-B230-m。本发明的木聚糖酶xyn-B230_m和原有芽孢杆菌木聚糖酶xyn_B230相比，有两个氨基酸发生了突变，突变位点为S23H和I129Y (突变位点以斜体和下划线标示)。突变后的氨基酸序列(不包括信号肽序列)如SEQ ID N0.1所示:
[0016]ATTlTSNQTGTHDGYDYELffKDHGNTSMTLNSGGAFSAQffSNIGNALFRKGKKF DSTKTHSQLGNISINYNATFNPGGNSYLCVYGWTKDPLTEYYIVDNWGTYRPTGT PKGTFTVDGGTYDIYETTRYNQPSIIGIATFKQYffSVRQTKRTSGTVSVSEHFKKff ESLGMPMGKMYETALTVEGYQSNGSANVTANVLTIGGKPLAA
[0017]本发明还提供了上述改良的耐高温木聚糖酶xyn-B230-m的基因序列，其碱基序列如SEQ ID N0.2所示:
[0018]gctaccaccatcacatctaatcagacaggaacacacgacggttatgactatgaactttggaaggaccatggaaacacctctatgac tttgaactctggtggagctttttcagcccaatggagtaacattggtaacgcattgtttagaaagggaaagaaattcgattctaccaaaa ctcattcccagcttggtaacatctctatcaactacaacgctactttcaacccaggtggaaattcctacttgtgtgtttatggttggacaa aggatcctcttaccgaatactatattgtcgacaactggggaacttatagaccaacaggtacccctaaaggaacttttacagttgatgg tggaacatacgacatctacgagactacaagatataatcaaccatcaattatcggtatcgccacttttaagcaatactggtcagtcaga cagaccaaaagaactagtggaacagtttctgtctccgaacacttcaagaaatgggagagtttgggtatgcctatgggaaagatgta cgaaaccgctcttactgttgagggttatcagtcaaacggaagtgctaatgttactgctaatgtccttacaatcggtggaaaacctcttt aa
[0019]本发明还提供了包含上述优化改良的木聚糖酶xyn-B230-m的重组载体，将本发明的优化改良的木聚糖酶Xyn-B230-m插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶xyn-B230-m插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xyn-B230_m。
[0020]本发明还提供了包含上述木聚糖酶xyn-B230-m的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株GSl 15。
[0021 ] 本发明还提供了上述木聚糖酶xyn-B230-m在纸浆处理中的应用，主要涉及木聚糖酶在使用酶预处理改善纤维性能、纸浆的漂白和废纸脱墨。在这些过程中采用木聚糖酶处理，均可以促使纸浆中残余木质素的降解和溶解性木质素的抽除，不但可以提高纸浆的白度和白度稳定性，改善纤维的滤水性和造纸性能，而且可以大大减少后续漂序化学的用量，从而降低纸浆漂白对环境产生的污染。
[0022]本发明利用基因工程手段对来源于芽孢杆菌的木聚糖酶xyn-B230的进行改良，以解决该木聚糖酶在纸浆处理过程中高温酶活性损失过多的缺陷，经过优化改良的木聚糖酶xyn-B230-m在75°C条件下的热稳定性得到了很大的提高，进一步满足了造纸用酶的要求，因此，本发明的优化改良的木聚糖酶xyn-B230-m可在造纸工业中显示出巨大的应用潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1、木聚糖酶xyn_B2 30和xyn-B230_m纯化的蛋白SDS-PAGE电泳图
[0024]图2、木聚糖酶xyn_B230和xyn-B230_m的pH稳定性。
[0025]图3、木聚糖酶xyn_B230和xyn-B230_m的最适温度。
[0026]图4、木聚糖酶xyn_B230和xyn-B230_m在70°C的热稳定性。
【具体实施方式】
[0027]实验条件:
[0028]1、菌株与载体
[0029]大肠杆菌菌株ToplO、Escherichia coli BL21 (DE3)、表达载体 pET_22b (+)(购自Novagen公司)。毕赤酵母GS115、载体pPIC9 (购自Invitrogen公司)。
[0030]2、酶类及其他生化试剂
[0031]Fast pfu购自全式金公司，内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。X-Gal、IPTG、桦木木聚糖等底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂。
[0032]3、培养基
[0033]大肠杆菌培养基为LB (1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%似(:1，？!17.0)。酵母培养基为YPD (1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)。酵母筛选培养基为MD (葡萄糖20g/L，琼脂粉 20g/L，生物素 4X 10_4g/L，YNB13.4g/L)。[0034]酵母诱导培养基BMGY (I %酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% ΥΝΒ、0.00004 %Biotin、l%甘油(V/V))和BMMY (除以1%甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。
[0035]本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括:Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3版.2001) ；Kriegler, GeneTransfer and Expression:A Laboratory Manual (1990)；和 James M.Cregg, PichiaProtocols (第一版，1998)。
[0036]实施例1、木聚糖酶xyn-B230基因合成、表达载体构建及突变体构建
[0037] ( I)结构优化
[0038]以Bacillus subtillis B230 木聚糖酶 xyn_B230 (其氨基酸序列如 SEQ ID N0.3所示)的晶体结构(PDB:1IG0)为出发的结构，选择的突变位点为:S23H、N451、D55P、H60Y、S61D、N65D、N75T、I129Y、T149D、Y185F，。
[0039]Bacillus subtillis B230 木聚糖酶 xyn_B230 的氨基酸序列如 SEQ ID N0.3 PJf示:
[0040]ATTITSNQTGTHDGYDYELWKDSGNTSMTLNSGGAFSAQWSNIGNALFRKGKKFDSTKTHSQ LGNISINYNATFNPGGNSYLCVYGWTKDPLTEYYIVDNWGTYRPTGTPKGTFTVDGGTYDIYE TTRINQPSIIGIATFKQYffSVRQTKRTSGTVSVSEHFKKWESLGMPMGKMYETALTVEGYQSN GSANVTANVLTIGGKPLAA
[0041](2)基因优化合成
[0042]将来自于枯草芽抱杆菌Bacillus subtillis B230的木聚糖酶基因xyn_B230,按照毕赤酵母的偏爱性，在不改变其氨基酸序列的前提下进行序列改造。改造中避免GT……AG这一形式的位点,注意不能影响mRNA的稳定性。将改造设计好的基因序列送南京金瑞斯公司进行全基因合成。
[0043](3)表达载体的构建
[0044]根据合成基因的序列设计PCR引物5’端含有Nco I内切酶位点，3’端含EcoR I内切酶位点，引物序列如下:
[0045]5 ’ 端引物 pET-xyn-F: GCACCCATGGGCTACCACCATCACATCTAATCA ; 3 ’ 端引物 pET-xyn-R:GCACGAATTCTTAAAGAGGTTTTCCACCGATTG ；以合成基因为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体pET-22b (+)上，得到重组载体pET-22b (+) -xyn_B230。
[0046](4)突变体的构建
[0047]米用TransGen 公司的 Fast Mutagenesis System 对 Bacillus subtillis B230的木聚糖酶基因xyn-B230基因进行定点突变，包含突变位点的部分重叠引物(表1)，按照该产品说明书的要求进行设计，PCR等相关操作按该产品的说明书进行。对筛选得到的突变体，经测序确定突变基因序列的正确性。
[0048]表1突变引物
[0049]
【权利要求】
1.一种热稳定性改良的木聚糖酶突变体xyn-B230-m，其特征在于，对氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示的木聚糖酶进行S23H和I129Y突变，获得所述热稳定性改良的木聚糖酶突变体 xyn-B230-m。
2.根据权利要求2所述的热稳定性改良的木聚糖酶突变体xyn-B230-m,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.热稳定性改良的木聚糖酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述的热稳定性改良的木聚糖酶突变体xyn-B230-m。
4.根据权利要求3所述的热稳定性改良的木聚糖酶突变体基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
5.包含权利要求3所述热稳定性改良的木聚糖酶突变体基因的重组载体。
6.包含权利要求3所述热稳定性改良的木聚糖酶突变体基因的重组载体pPIC9-xyn-B230_mo
7.包含权利要求3所述热稳定性改良的木聚糖酶突变体基因的重组菌株。
8.包含权利要求3所述热稳定性改良的木聚糖酶突变体基因的重组毕赤酵母菌株GS115。
9.一种制备热稳定性改良的木聚糖酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤: (O以权利要求4所述的重组载体转化宿主细胞； (2)培养所述宿主细胞；· (3)分离纯化热稳定性改良的木聚糖酶。
10.权利要求1所述的热稳定性改良的木聚糖酶突变体Xyn-B230-m的应用。
【文档编号】C12R1/125GK103525793SQ201310519982
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】姚斌, 黄火清, 罗会颖, 王亚茹, 石鹏君, 柏映国, 孟昆, 杨培龙 申请人:中国农业科学院饲料研究所