一种用于转录组测序的建鲤肌肉rna的提取方法
【专利摘要】发明涉及一种用于转录组测序的建鲤肌肉RNA的提取方法，尤其是一种提取纯度高、完整性好、得率高的用于转录组测序的建鲤肌肉RNA的方法，属于分子生物学【技术领域】。包括如下步骤：将建鲤肌肉组织在液氮中研磨成粉末，加入变性液、匀浆后，加入含有蛋白酶K的RNAse-Free的水，振荡混匀，离心取上清液，加氯仿混匀后，离心取上清液；再加入高盐溶液和异丙醇后，得到沉淀，用乙醇洗涤、干燥，即可。采用本发明方法提取的肌肉RNA得率高，并且纯度高、完整性好、可以用于转录组测序。
【专利说明】—种用于转录组测序的建鲤肌肉RNA的提取方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种用于转录组测序的建鲤肌肉RNA的提取方法，尤其是一种提取纯度高、完整性好、得率高的用于转录组测序的建鲤肌肉RNA的方法，属于分子生物学【技术领域】。
[0003]
【背景技术】
[0004]转录组即某个物种特定组织在某一功能状态下产生的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。转录组测序(RNA-Seq)是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种在某一状态下的几乎所有转录本，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。而用于转录组测序的RNA在纯度、完整性、浓度三方面要求较高，所以RNA的提取就显得尤为重要，是转录组测序的关键步骤。
[0005]建鲤肌肉组织含水量接近70%，蛋白质含量达到18%，富含胶原蛋白、粘多糖，但细胞含量少，组织RNA含量低，采用常规的RNA提取方法很难完全匀浆，而且获得的产物常含有粘多糖等胶状不溶物，得率低，纯度不高，完整性差，达不到用于转录组测序的RNA质量的要求，以致后续的实验无法开展。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种用于转录组测序的建鲤肌肉RNA的提取方法，它适用于肌肉总RNA提取，采用本发明方法提取的肌肉RNA得率高，并且纯度高、完整性好、可以用于转录组测序。技术方案如下:
一种用于转录组测序的建鲤肌肉RNA的提取方法，包括如下步骤:
(1).取建鲤肌肉组织l(T50mg，投入装有液氮的研钵中，边加液氮边研磨，将组织研磨至粉末状；
(2)将粉末转移至离心管A中，向其加入400~600iU变性液，用匀浆机在冰上匀浆10~40s ；
(3)向离心管A中加550~650ill DEPC水，振荡混匀；然后加5~15^1含有蛋白酶K的RNAse-Free的水,振荡混匀；再在50~60°C下水浴8~12min,其间需要上下颠倒离心管；
(4)室温下12000~14000r/min离心3~7min,转移上清液到离心管B中；
(5)向离心管B中加入150~250u I氯仿，摇动15~20s，室温静置3~5min ；4°C的温度下用12000~14000 r/min离心8~12min,转移上清液到离心管C中；
(6)向离心管C中加200~300ill高盐溶液及200~300 异丙醇，混匀，室温放置8~12min，所述的高盐溶液包括有0.8mol/L柠檬酸三钠和1.2mol/L氯化钠，溶剂是水；
(7)4°C温度下用12000~14000r/min离心l(T20min，弃上清液；
(8)沉淀用体积浓度为70~80%乙醇水溶液洗涤两次，7000~8000rpm/min离心2~4min,弃去上清；
(9)室温干燥沉淀2~5分钟，加15~30u I DEPC水溶解RNA，-7(T-9(TC度保存。
[0008]所述的变性液的组成配比可以是:
异硫氰酸胍23.6320g、柠檬酸三钠0.3676g、十二烷基肌氨酸钠0.25g、3 -巯基乙醇lml、其余为去离子水，总量50ml。折算后，即:异硫氰酸胍472.64 mg/ml、柠檬酸三钠7.252mg/ml、十二烷基肌氨酸钠5 mg/ml、(6-巯基乙醇20 U 1/ml,溶剂是水。
[0009]所述的DEPC水的质量浓度可以是0.05~0.15% ；
所述的含有蛋白酶K的RNAse-Free的水中，蛋白酶K的质量浓度是20mg/ml ；
本发明的主要实现原理:利用高盐溶液来去除粘多糖等胶状物。先用液氮研磨，避免RNA降解，再利用匀浆机匀 浆，能完全匀浆。加蛋白酶K主要是消化胶原蛋白以及核蛋白等蛋白。此方法组织量、变性液量比例合适，匀浆充分，避免RNA降解，能提取到肌肉中的RNA。
[0010]有益效果
采用本发明方法提取的肌肉RNA纯度高、完整性好、可以用于转录组测序。
[0011]【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是实施例1提取并纯化的肌肉RNA的Agilent 2100检测图 图2是对照例I中RNA琼脂糖电泳图
【具体实施方式】
[0013]实施例1
1.取建鲤肌肉组织30 mg，立即投入装有液氮的研钵中，边加液氮边研磨，将组织研磨至粉末状。
[0014]2.将粉末转移至离心管A中，向其加入500 ill变性液，用匀浆机在冰上匀浆30s。
[0015]3.向离心管A中加590 ill DEPC水(0.l%w/w)稀释匀浆液，振荡混匀。然后加10 u I含有蛋白酶K的RNAse-Free的水，蛋白酶K的浓度是20mg/ml，振荡混匀。55°C水浴lOmin，其间上下颠倒离心管两次。
[0016]4.室温下13000r/min离心5min,转移上清到离心管B中。
[0017]5.向离心管B中加入200 氯仿，剧烈摇动18s，室温静置4min。4°C温度下用13000r/min离心IOmin,转移上清到离心管C中。
[0018]6.向离心管C中加250111高盐溶液(含有0.811101/1柠檬酸三钠和1.211101/1氯化钠，溶剂是水)及250iU异丙醇，混匀，室温放置IOmin。
[0019]7.4°C温度下用 13000r/min 离心 15min,弃上清。
[0020]8.沉淀用体积 浓度为75%乙醇水溶液洗漆两次,7500 rpm/min离心3 min,小心弃
去上清。
[0021 ] 9.室温干燥沉淀4分钟，加20 ill DEPC水溶解RNA，-80 V度保存。[0022]变性液的组成配比是:异硫氰酸胍23.6320g、柠檬酸三钠0.3676g、十二烷基肌氨酸钠0.25g、(6-巯基乙醇lml、其余为去离子水，总量50ml。
[0023]DEPC水质量浓度是0.1%。
[0024]经检测，本实施例中提取得到的RNA的0D26Q/28Q值在1.98±0.04之间，说明样本纯度好。另外，通过Aglient Technologies 2100 Bioanalyzer检测，如图1, RNA浓度达到207 ng/u I, RIN值为8.5，说明提取的RNA样品质量合格，完整度好，总量和浓度满足两次及两次以上的转录组测序实验需求。
[0025]对照例I 传统的RNA提取方法:
1.取建鲤肌肉组织50 mg，置入1.5ml离心管中。向其加入lml Trizol变性液，用匀浆机匀浆30s。 [0026]2.向离心管中加入200 U I氯仿，振荡15s，静置2min。
[0027]3.4°C, 12000r/min 离心 15min,取上清。
[0028]6.在上清中加入500 U I异丙醇，混匀，室温放置lOmin。
[0029]7.再在4°C的温度下，12000r/min离心lOmin,弃上清。
[0030]8.加入Iml体积浓度为75%乙醇水溶液,洗漆沉淀。7500 rpm/min离心3 min,
弃上清。
[0031 ] 9.晾干，室温干燥沉淀4分钟，加20 ill DEPC水溶解RNA，-80 °C度保存。
[0032]经检测，本实施例中提取得到的RNA的0D26(i/28(i值在1.6±0.08之间，说明RNA纯度不高。另外，从琼脂糖电泳图上(图2)看，条带有弥散状，说明RNA有降解。总之，通过常规的Trizol法提取的建鲤肌肉RNA质量达不到转录组测序的要求。
[0033]对照例2
与实施例1的区别在于没有通过高盐溶液对离心上清液进行去除粘多糖等胶状物的操作，具体而言，该对照例的步骤如下:
1.取建鲤肌肉组织30 mg，立即投入装有液氮的研钵中，边加液氮边研磨，将组织研磨至粉末状。
[0034]2.将粉末转移至离心管A中，向其加入500 ill变性液，用匀浆机在冰上匀浆30s。
[0035]3.向离心管A中加590 ill DEPC水(0.l%w/w)稀释匀浆液，振荡混匀。然后加
10u I含有蛋白酶K的RNAse-Free的水，蛋白酶K的浓度是20mg/ml，振荡混匀。55°C水浴lOmin，其间上下颠倒离心管两次。
[0036]4.室温下13000r/min离心5min,转移上清到离心管B中。
[0037]5.向离心管B中加入200 ill氯仿，剧烈摇动18s，室温静置4min。4°C温度下用13000r/min离心IOmin,转移上清到离心管C中。
[0038]6.向离心管C中加250 U I异丙醇，混匀，室温放置lOmin。
[0039]7.4°C温度下用 13000r/min 离心 15min,弃上清。
[0040]8.沉淀用体积浓度为75%乙醇水溶液洗漆两次,7500 rpm/min离心3 min,小心弃
去上清。
[0041 ] 9.室温干燥沉淀4分钟，加20 ill DEPC水溶解RNA，-80 V度保存。
[0042]变性液的组成配比是:异硫氰酸胍23.6320g、柠檬酸三钠0.3676g、十二烷基肌氨酸钠0.25g、(6-巯基乙醇lml、总量50ml，余量是去离子水。
[0043]DEPC水质量浓度是0.1%。
[0044]经检测，本实施例中提取得到的RNA的0D26Q/28Q值在1.65±0.08之间，说明样本纯度不高。通过 Aglient Technologies 2100 Bioanalyzer 检测，RNA 浓度约为 112 ng/U 1，RIN值为6.0，说明提取的RNA样品质量和完整度都较为一般。
[0045]对照例3
与实施例1的区别在于没有通过蛋白酶K对胶原蛋白等进行处理的操作，具体而言，该对照例的步骤如下:
1.取建鲤肌肉组织30 mg，立即投入装有液氮的研钵中，边加液氮边研磨，将组织研磨至粉末状。
[0046]2.将粉末转移至离心管A中，向其加入500 ill变性液，用匀浆机在冰上匀浆30s。
[0047]3.向离心管A中加590 U I DEPC水(0.l%w/w)稀释匀浆液，振荡混匀。
[0048]4.室温下13000r/min离心5min,转移上清到离心管B中。
[0049]5.向离心管B中加入200 U I氯仿，剧烈摇动18s，室温静置4min。4°C温度下用13000r/min离心IOmin,转移上清到离心管C中。
[0050]6.向离心管C中加250111高盐溶液(含有0.811101/1柠檬酸三钠和1.211101/1氯化钠，溶剂是水)及250iU异丙醇，混匀，室温放置IOmin。
[0051]7.4°C温度下用 13000r/min 离心 15min,弃上清。
[0052]8.沉淀用体积浓度为75%乙醇水溶液洗漆两次,7500 rpm/min离心3 min,小心弃
去上清。
[0053]9.室温干燥沉淀4分钟，加20 ill DEPC水溶解RNA，-80 V度保存。
[0054]变性液的组成配比是:异硫氰酸胍23.6320g、柠檬酸三钠0.3676g、十二烷基肌氨酸钠0.25g、(6-巯基乙醇lml、总量50ml，余量是去离子水。
[0055]DEPC水质量浓度是0.1%。
[0056]经检测，本实施例中提取得到的RNA的0D26Q/28Q值在1.55±0.04之间，说明样本纯度不高。通过 Aglient Technologies 2100 Bioanalyzer 检测，RNA 浓度约为 107 ng/U 1，RIN值为5.5，说明提取的RNA样品质量和完整度都较为一般。
【权利要求】
1.一种用于转录组测序的建鲤肌肉RNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)取建鲤肌肉组织l(T50mg，投入装有液氮的研钵中，边加液氮边研磨，将组织研磨至粉末状； (2)将粉末转移至离心管A中，向其加入400~600iU变性液，用匀浆机在冰上匀浆10~40s ； (3)向离心管A中加550~650ill DEPC水，振荡混匀；然后加5~15^1含有蛋白酶K的RNAse-Free的水,振荡混匀；再在50~60°C下水浴8~12min,其间需要上下颠倒离心管； (4)室温下12000~14000r/min离心3~7min,转移上清液到离心管B中； (5)向离心管B中加入150~250u I氯仿，剧烈摇动15~20s，室温静置3~5min ；4°C的温度下用12000~14000 r/min离心8~12min,转移上清液到离心管C中； (6)向离心管C中加200~300ill高盐溶液及200~300 异丙醇，混匀，室温放置8~12min，所述的高盐溶液包括有0.8mol/L柠檬酸三钠和1.2mol/L氯化钠，溶剂是水； (7)4°C温度下用12000~14000r/min离心l(T20min，弃上清液； (8)沉淀用体积浓度为70~80%乙醇水溶液洗涤两次，7000~8000rpm/min离心2~4min,弃去上清； (9)室温干燥沉淀2~5分钟，加15~30u I DEPC水溶解RNA，-7(T-9(TC度保存。
2.根据权利要求1所述 的用于转录组测序的建鲤肌肉RNA的提取方法，其特征在于:所述的变性液中包括有:异硫氰酸胍472.64 mg/ml、柠檬酸三钠7.252 mg/ml、十二烷基肌氨酸钠5 mg/ml、^ -巯基乙醇20 u 1/ml，溶剂是水。
3.根据权利要求1所述的用于转录组测序的建鲤肌肉RNA的提取方法，其特征在于:所述的DEPC水的质量浓度是0.05~0.15%。
4.根据权利要求1所述的用于转录组测序的建鲤肌肉RNA的提取方法，其特征在于:所述的含有蛋白酶K的RNAse-Free的水中，蛋白酶K的质量浓度是20mg/ml。
【文档编号】C12N15/10GK103642793SQ201310535183
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月1日 优先权日:2013年11月1日
【发明者】唐永凯, 李红霞, 李建林, 俞菊华 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心