一种代谢产鼠李糖脂的培养基及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物采油的培养基，特别是涉及一种代谢产鼠李糖脂的培养基及其应用。培养基中以甘油作为碳源，NaNO3作为无机氮源。本发明提供的培养基，可以有效地促进厌氧产鼠李糖脂菌种在缺氧条件下快速代谢生产鼠李糖脂，并为激活油藏原位的相关功能菌种进行微生物驱油，提供有效的营养激活剂配方。
【专利说明】一种代谢产鼠李糖脂的培养基及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物采油的培养基，特别是涉及一种代谢产鼠李糖脂的培养基及其应用。
【背景技术】
[0002]鼠李糖脂是由微生物代谢产生的一种生物表面活性剂，在微生物提高原油采收率(MEOR)【技术领域】有重要的应用潜力。对鼠李糖脂好氧发酵条件优化已有很多研究，但对相关菌种在厌氧条件下代谢生产鼠李糖脂所用的培养基还缺少研究。
[0003]目前，油田在利用鼠李糖脂提高采收率的技术中，大都采用地上发酵生产鼠李糖月旨，然后再注入油藏，然而有氧发酵设备的运行与维护和产物的提取与运输的成本较高；而地下有氧发酵，则需向油藏注入空气，这又带来操作性差，安全性差，设备要求较高，注空气管线易氧化腐蚀等问题。因此，获得一种代谢生产产鼠李糖脂的培养基，将能够解决上述瓶颈问题。
【发明内容】
[0004]为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种代谢产鼠李糖脂的培养基及其应用。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]一种代谢产鼠李糖脂的培养基，培养基中碳源为甘油，无机氮源为NaNO3作。
[0007]所述培养基按质量分数为:甘油3-4%，NaNO30.2-0.4%, K2HPO4.3H200.35-0.45%,KH2PO40.4-0.5%, MgSO4.7H200.003-0.005%, CaCl20.01-0.02%, KC10.08-0.14%,NaCl0.08-0.14%，酵母粉 0.1-0.2%，余量为水。
[0008]进一步的说，所述培养基按质量分数为:甘油3.6%，NaNO30.3%，K2HPO4.3Η200.42%，KH2PO40.47%, MgSO4.7Η200.004%, CaCl20.013%, KC10.1%，NaCl0.1%，酵母粉 0.16%，余量为水。
[0009]一种代谢产鼠李糖脂的培养基的应用，所述培养基作为代谢生产鼠李糖脂表面活性剂的培养基。
[0010]厌氧条件下利用所述培养基代谢生产鼠李糖脂表面活性剂。
[0011]本发明所具有的优点:
[0012]将产鼠李糖脂菌种于本发明培养基中，在厌氧条件下快速地代谢生产鼠李糖脂，培养基中利用水溶性好且极易被微生物代谢利用甘油为碳源，缩短了厌氧产鼠李糖脂菌种细胞生长和鼠李糖脂合成所需的时间，在一定程度上弥补了在缺氧条件下细胞代谢缓慢的缺陷。同时能够激活油藏缺氧生境中存在的厌氧产鼠李糖脂类功能菌，从而提高原油采收率，进而对油藏原位的微生物驱油，减少基础设施和生产设备费用；降低采油成本。
[0013]本发明培养基可以促进厌氧产鼠李糖脂菌种在缺氧条件下快速地代谢生产鼠李糖脂，缩短发酵周期。其中培养基提供有效的营养激活剂，能够激活本源的厌氧产鼠李糖月旨，同时厌氧条件下发酵生产鼠李糖脂，可以避免好氧发酵过程中的诸多不利因素。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明实施例提供的鼠李糖标准曲线。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
[0016]培养基按质量分数为:甘油3.6%, NaNO30.3%, K2HPO4.3Η200.42%, KH2PO40.47%,MgSO4.7Η200.004%, CaCl20.013%, KC10.1%，NaCl0.1%，酵母粉 0.16%，余量为蒸馏水，pH 自然。即培养基配完后无需调pH。
[0017]上述培养基中选取NaNO3作为无机氮源，保证产鼠李糖脂的厌氧功能菌在厌氧条件下进行硝酸盐呼吸获取生长代谢所需的能量。
[0018]实施例2
[0019]利用上述培养基在厌氧瓶中发酵生产鼠李糖脂:
[0020]I)菌株为 Pseudomonas sp ANB10SURF-1 (Pseudomonas sp ANB10SURF-1 中的相关记载参见 Albino et al.2011Partial characterizat1n of b1surfactant producedunder anaerobic condit1ns by Pseudomonas sp ANB1SURF-1)。
[0021]2)厌氧培养基制备方法:将上述配制好的培养基煮沸约15min，至刃天青指示剂由蓝色变淡红色；然后在高纯氮气保护下，分装到厌氧瓶中；121°C，灭菌20min;注入过滤除菌的2.5%(w/v)Na2S.9H20还原剂至终浓度0.02%，去除残余氧。
[0022]3)发酵条件:将200mL上述灭菌后的培养基于250mL厌氧瓶中，再将上述菌株按6%的接种量接种，在80r/min的转速、40°C的恒温培养箱中，培养7d, pH自然。
[0023]4)发酵液中鼠李糖脂的定量测定:
[0024]采用苔黑酚-硫酸法，糖基分子在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，与苔黑酚反应可以生成带色物质，在421nm处有最大吸收。
[0025]样品制备:发酵液先10，000 X g，离心20min，以去除菌体细胞；取0.5mL上清液用
ImL乙醚萃取三次，然后合并上层有机相至干净试管中；将试管置于通风厨内，使乙醚完全挥发掉；加入0.5mL蒸懼水。
[0026]标准品的制备:配制一系列浓度(0-0.05g/L)的L-鼠李糖溶液，取L-鼠李糖在105°C烘干至衡重，称取25mg溶于蒸馏水，定容至250mL，得到质量浓度0.10g/L鼠李糖脂标准溶液。分别取 2.5mL, 5.0mL, 7.5mL, 10.0mL, 12.5mL, 15.0mL, 17.5mL, 20.0mL, 22.5mL, 25.0mL鼠李糖标准溶液，至蒸馏水中定容至50mL，得到质量浓度分别为0.005,0.010,0.015，
0.020,0.025,0.030，0.035,0.0400.045,0.050g/L 的系列鼠李糖溶液。
[0027]将上述获得的标准溶液或样品与苔黑酚溶液按照1:9的体积比(ml)进行混合置于试管中；其中，苔黑酚溶液为0.19% (质量浓度)的苔黑酚溶于53% (体积浓度)的H2SO4中。
[0028]将上述试管于80°C水浴30min，室温下冷却15min ;测定其OD421。标准品溶液的空白以蒸馏水代替鼠李糖标准品，发酵液的空白对照以未接种的培养基代替发酵液。根据标准曲线得到鼠李糖的质量浓度(见图1)，乘以相关系数3，得到鼠李糖脂的质量浓度，最终得出发酵液中鼠李糖脂质量浓度。
[0029]在厌氧瓶培养条件下，利用该厌氧产鼠李糖脂培养基，鼠李糖脂产量为
3.12±0.llg/L。
[0030]实施例3
[0031]上述厌氧产鼠李糖脂培养基的物理模拟岩芯驱油实验评价:
[0032]I)人造岩芯处理:抽真空饱和地层水，饱和油，老化。计算孔隙体积PV=岩心湿重-岩心干重；人造岩芯孔隙体积PV=2338.7g-2233.3g)/Ig^mr1=1S.4mL。
[0033]2) —次水驱:利用地层水对岩芯进行一次水驱，至含水率达98%以上，计算水驱采收率；计算水驱采收率=出油量/饱和油量X 100% ；
[0034]具体水驱采收率=(43mL/68mL)X 100%=63.6%。
[0035]3)将上述实施例培养基注入岩芯:将0.3PV灭菌且除氧的该厌氧产鼠李糖脂培养基注入岩芯中，其中，对照岩芯注入0.3PV的地层水。
[0036]4)培养:关闭岩心两端,模拟地层温度培养一个月。
[0037]5) 二次水驱:方法同一次水驱。计算二次采收率及提高的采收率；其中，
[0038]二次采收率=(二次水驱出油总量/饱和油量)X 100% ；
[0039]提高的采收率=(实验岩芯的二次采收率-对照岩芯的二次采收率)
[0040]经二次水驱的二次采收率及提高的采收率分别为:
[0041]二次采收率=(8mL/68mL) X 100%=11.7%
[0042]提高的采收率=11.7%-0.9%=10.8%。
[0043]在模拟地层温度培养的过程中，该厌氧产鼠李糖脂培养基在人造岩芯内激活地层水中相关的厌氧产鼠李糖脂功能菌，并促进其产生鼠李糖脂表面活性剂，作用于岩芯中的原油，从而在一次水驱基础上提高原油采收率达10.8个百分点。
【权利要求】
1.一种代谢产鼠李糖脂的培养基，其特征在于:培养基中碳源为甘油，无机氮源为NaNO30
2.按权利要求1所述的代谢产鼠李糖脂的培养基，其特征在于:所述培养基按质量分数为:甘油 3-4%, NaNO30.2-0.4%, K2HPO4.3Η200.35-0.45%, KH2PO40.4-0.5%,MgSO4.7Η200.003-0.005%, CaCl20.01-0.02%, KC10.08-0.14%, NaCl0.08-0.14%,酵母粉0.1-0.2%，余量为水。
3.按权利要求2所述的代谢产鼠李糖脂的培养基，其特征在于:所述培养基按质量分数为:甘油 3.6%, NaNO30.3%, K2HPO4.3H200.42%, KH2PO40.47%, MgSO4.7H200.004%,CaCl20.013%, KC10.1%，NaCl0.1%，酵母粉 0.16%，余量为水。
4.一种权利要求1所述的代谢产鼠李糖脂的培养基的应用，其特征在于:所述培养基作为代谢生产鼠李糖脂表面活性剂的培养基。
5.按权利要求4所述的代谢产鼠李糖脂的培养基的应用，其特征在于:厌氧条件下利用所述培养基代谢生产鼠李糖脂表面活性剂。
【文档编号】C12P19/44GK104232708SQ201310558200
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】张颖, 赵峰, 史荣久, 韩斯琴 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所