一种利用ssr分子标记引物体系分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的方法

一种利用ssr分子标记引物体系分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用SSR分子标记引物体系分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的方法。所述SSR分子标记引物体系包括33对Las-SSR可用引物，其中18对为SSR核心引物。本发明首次提出了基于SSR分子标记并结合PAGE电泳分析柑橘黄龙病菌亚洲种（Ca.L.asiaticus）菌株多样性的方法，该方法简单、方便、分析效率高，为黄龙病分子流行学的研究奠定了分子基础。
【专利说明】—种利用SSR分子标记引物体系分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学【技术领域】。更具体地，涉及一种利用SSR分子标记引物体系分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的方法。
【背景技术】
[0002]柑橘黄龙病是危及世界和我国多个柑橘产区的最主要的病害。该病害最早在我国广东发现，至今已有近百年历史。目前，黄龙病在亚洲和非洲广泛分布，在大洋洲、南美洲和北美洲的部分柑橘主产区也严重发生，已报道在50多个国家和地区造成了巨大的损失。对黄龙病病原的认识经历了漫长的时间，目前普遍认为黄龙病是由限制于寄主植物韧皮部、不可体外培养的革兰氏阴性细菌Libriacter spp.)引起的。6?.L.spp包含3个亚种:亚洲种H L.asiaticus)、非洲种{Ca.L.africanus)、和美洲种H L.americanus)。其中亚洲种(6?.L.asiaticus)为世界范围内流行范围最广、致病力最强的种群。我国发现的所有黄龙病相关病原均属于亚洲种(fe.L.asiaticus)。
[0003]目前已成功地完成了 2个亚洲种(6?.L.asiaticus)菌株的全基因组测序。2009年公布了一个从携毒柑橘木虱Psy62中获得的大小为1.23 Mb的亚洲种(fe.L.asiaticus)全基因组序列(Genebank ID: gb I CP001677.5);2013 年，Genebank 上又公布了一个来自中国广西的柑橘黄龙病菌亚洲种iCa.L.菌株的基因组(GenebankID: gb I CP004005.1)，大小为1.27 Mb。在Psy62菌株的全基因组序列公布以后，Liu等分析了中国云南和广东两个省的柑橘黄龙病菌亚洲种(Ck L.asiaticus)菌株中的前噬菌体特异引物766F/R的扩增结果，首次报道中国菌株的地区变异性(Liu et al., 2011)。咖/7基因的限制性酶切多态性也证明了菌株的多态性与地域相关(Hu et al., 201 D0Wang等分析262个分别来自中国和美国的菌株某区域(CLIBASIA_ 05640- CLIBA SIA_05650)的电泳条带类型谱，发现2个国家之间及中国的云南和广东两省之间的菌株具有多态性，指出基因的插入和缺失突变是菌株遗传多样性的重要依据(Wang et al., 2012)。Zhou报道了基因组中的另两个高度变异的前噬菌体基因，并利用这两个基因分析来自不同国家的32个菌株，得出菌株多态性与地域差异相关的结论(Zhou et al., 2011)。
[0004]柑橘黄龙病菌株的地区差异性和遗传多样性一方面曾经引起黄龙病起源的争议，另一方面对于该病害在不同地域间的流行和传播也曾一度引起热议。柑橘生产实践者或研究者甚至发现柑橘黄龙病菌亚洲种在曾经流行过美洲种的地区大势流行，造成严重的危害。因此，基于病原分子多样性的病原流行趋势分析具有重要的现实意义。目前常用的遗传多样性分析都是基于常规PCR技术、琼脂糖凝胶电泳及序列测定来实现的。但是常规PCR通常设置较大的(20 μ L ^25 μ L)的体系，浪费大量的试剂和实验材料(尤其是各种PCR酶价格比较昂贵，另外需要从国外取得的实验材料更加珍贵)；并且普通琼脂糖凝胶电泳的分辨率比较低；另外，序列测定需要用到高精度的大型测序仪，批量测序价格昂贵。因此，寻找出一种简单、快速、经济、高效的鉴定柑橘黄龙病菌遗传多样性的方法具有非常重要的理论和实践意义。
[0005]简单串联重复序列(Simple sequence repeat, SSR)也叫微卫星标记(Microsatellite),是基于某一物种已知基因组的、以一定数目核苷酸(1、个碱基对)2次以上重复排列的长达几十到几百个核苷酸的序列。SSR标记因重复性好、稳定性强、多态性高且在基因组中普遍存在的优点被广泛用于植物遗传图谱的构建、品种鉴定、遗传多样性分析和分子标记辅助育种等领域。虽然遗传标记在许多模式植物上已经广泛应用，但在植物病原细菌上还是方兴未艾。植物病原细菌的遗传方式完全不同于植物，细菌的遗传并不涉及菌株的杂交，另一方面，细菌核酸的获得需要克服人工培养的障碍，因此想要利用SSR分子标记的方法来分析植物病原细菌的遗传多样性，还需克服一系列的技术问题。
[0006]柑橘黄龙病菌目前还不能进行体外培养，无法提取纯病菌的核酸。目前还没有简单有效的遗传多样性分析方法。

【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有柑橘黄龙病菌遗传多样性分析的技术不足，提供一套用于柑橘黄龙病菌遗传多样性分析的SSR分子标记引物体系。
[0008]本发明另一目的在于提供一种利用上述SSR分子标记引物体系鉴定和分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的方法。
[0009]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明提供了一种柑橘黄龙病菌遗传多样性分析SSR分子标记引物体系，所述SSR分子标记引物体系包括33对Las-SSR可用引物，分别为Las_ssrf Las_ssr8、Las-ssrlO~Las-ssrl4、Las-ssrl6~Las_ssr20、Las_ssr22~Las_ssr36，引物序列如 SEQ IDN0.1~16、SEQ ID N0.19~28、SEQ ID N0.31~40、SEQ ID N0.43~72 所示；
其中有 18 对为 SSR 核心引物，分别是 Las-ssrl、Las_ssr3、Las_ssr5、Las_ssr7、Las_ssrl2~14、Las_ssrl8、Las_ssr22、Las_ssr27~29、Las_ssr31 ~36，引物序列如 SEQ IDN0.1~2、SEQ ID N0.5~6、SEQ ID N0.9~10、SEQ ID N0.13~14、SEQ ID N0.23~28、SEQ IDN0.35~36、SEQ ID N0.43~44、SEQ ID N0.53~58、SEQ ID N0.61 ~72 所示。
[0010]所述SSR分子标记引物体系构建方法步骤如下:
51.柑橘黄龙病菌亚洲种(CkL.asiaticus)全基因组序列的获得:从Genebank中下载得到2个柑橘黄龙病菌亚洲种(Ck L.asiaticus)菌株序列，Genebank ID分别为gb I CP001677.5和gb I CP004005.1，分别为采自美国佛罗里达州Psy62菌株和中国广西gxpsy菌株的基因组序列；
52.全基因组序列中SSR位点的鉴定:利用SSR检索软件TandemRepeats Finder(version 4.07b)获得了 36个含有SSR位点信息的序列；具体是利用Tandem PepeatsFinder (version 4.07b)在线软件扫描分析候选的SSR位点信息,将得到的结果进行筛选，筛选标准:(I)若匹配率(Percent Matches)为100%，则重复单元的重复长度为2 bp^lObp ;(2)若Percent Matches介于90%和100%之间，则重复单元的最小重复长度为10 bp ；
(3)重复数大于等于2 ;
53.根据S2得到的含有SSR位点的序列,利用引物设计软件PrimerPremier 5.0合成SSR引物，得到36对Las-SSR引物(如表1所示)，引物设计参数主要包括:引物长度为15 bp~25 bp，退火温度为45°C~65°C，GC含量为 40%~65%，PCR扩增产物长度为100 bp~600 bp,其中Las-ssr28位点的序列总长度大于600 bp，其预测的PCR扩增产物长度为1742 bp ；
54.用普通PCR的方法验证S3得到的36对Las-SSR引物的特异性:选取I个黄龙病柑橘叶片样品(阳性)和I个健康柑橘样品(阴性)，剪取0.15 g柑橘叶片中脉，磨碎后用OMEGA公司的植物DNA提取试剂盒(产品号D2485-02)提取基因组总DNA。阳性样品中包含柑橘基因组DNA和柑橘黄龙病菌亚洲种(6?.L.asiaticus)基因组DNA。利用1% (w/v)的琼脂糖凝胶检测提取的DNA的质量。以上述2个DNA样品为模板，分别用所有设计的SSR引物进行筛选；阳性样品能扩增出目的片段而阴性样品不能扩增出该片段的引物为可用引物。筛选得到33对具有高稳定性、高扩增效率和较强特异性的Las-SSR可用引物(如表1中所示的33对可用引物)；
55.利用S4筛选到的33对Las-SSR可用引物对柑橘黄龙病菌亚洲种(CkL.进行遗传多样性分析:以柑橘黄龙病菌亚洲种(Ck L.asiaiicm)阳性DNA样
品为模板进行PCR扩增；预测扩增片段小于500bp的PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳，预测片段大于1500bp的PCR产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，并测序比对；筛选出多态性非常好的18对SSR核心引物，其中17对SSR核心引物的PCR扩增片段均小于600bp，用聚丙烯酰胺凝胶电泳即可分辨。只有Las-ssr28预测的PCR扩增产物长度为1742 bp，还需使用琼脂糖凝胶电泳来分析。
[0011]步骤S3 所述 36 对 Las-SSR 引物为 Las-ssrl~Las-ssr36，序列如 SEQ ID N0.1~ 72所示。
[0012]步骤S4所述33对Las-SSR可用引物分别为Las-ssrl~Las_ssr8、Las-ssrlO~Las-ssrl4、Las-ssrl6~Las_ssr20、Las_ssr22~Las_ssr36，引物序列如 SEQ IDN0.1~16、SEQ ID N0.19~28、SEQ ID N0.31 ~40、SEQ ID N0.43~72 所示。
[0013]步骤S5 所述 18 对 SSR 核心引物分别为 Las-ssrl、Las-ssr3、Las-ssr5、Las_ssr7、Las_ssrl2~14、Las_ssrl8、Las_ssr22、Las_ssr27~29、Las_ssr31 ~36，引物序列如 SEQ IDN0.1~2、SEQ ID N0.5~6、SEQ ID N0.9~10、SEQ ID N0.13~14、SEQ ID N0.23~28、SEQ IDN0.35~36、SEQ ID N0.43~44、SEQ ID N0.53~58、SEQ ID N0.61 ~72 所示。
[0014]本发明还提供了一种上述SSR分子标记引物体系鉴定和分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的方法，其具体步骤是:
51.实验材料的准备:选取典型斑驳症状的柑橘叶片，提取柑橘样品叶中脉总DNA，采用国际上通用的柑橘黄龙病菌特异引物OIl和0I2c扩增16S rDNA片段，检测为阳性的DNA样品用于SSR遗传多样性分析；
52.以SI获得的阳性的DNA为模板，利用本发明的SSR分子标记引物体系进行PCR扩
增；
53.对S2所述PCR扩增得到的PCR产物进行电泳、显色，显色结束后，拍照获取谱带信息，比较同一 SSR标记在不同菌株中的多态性；
54.结果统计及遗传多样性分析:读取S3获得的谱带信息，以条带位置为依据，最小片段的带型为“1”，依次递增；收集所有条带类型信息，使用分析软件分别计算SSR标记的多态性位点频率(PPB)、Nei’ s基因多样性指数(h)和Shannon’s信息指数(I)，反映菌株的遗传多样性；采用相关软件方法进行分析，获得UPGMA聚类图。[0015]其中，步骤S2所述PCR扩增的体系为15 μ L:包括9.9 μ L灭菌ddH20，1.5 μ L含Mg2+ 的 IOXTaq bufferU.5 μ L 的 2.5 mM 的 dNTPs，0.8μ L 的 10 μ M 正反向引物混合液，20 ng样品DNA模板及0.2 μ L的2.5 M/μ L Taq DNA聚合酶；
扩增程序为:94°C预变性5 min ;94°C变性30s、56°C退火40s、72°C延伸45s，循环35次；72°C 延伸 IOmin ；
步骤S3所述电泳优选为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE电泳)，所述显色为银染显色；
步骤S4所述分析软件优选为P0PGENE1.32软件，所述相关软件方法优选为PowerMarkV3.0软件中的N-J聚类方法。
[0016]本发明具有以下有益效果:
本发明提供了柑橘黄龙病菌亚洲种iCa.L.asiaticus)的全套SSR分子标记引物体系并筛选出核心引物，结合PAGE电泳的方法为该病原的遗传多样性研究开辟了新的途径。与现有技术一次只能分析一个遗传位点多样性，本发明一次性涉及全基因组上分布的33个位点，效率大大提高，且足以对菌株遗传多样性进行批量区分，方法简单，步骤少，易于操作，也克服了批量测序价格昂贵的问题。另外，较小的PCR体系(10 μ Π5 μ L)就能实现检测目的，节省成本和实验材料，所用的材料均为常规试剂或装置，耗资少；数据的统计分析借助于已开发的软件，可一次性处理所有数据。同时，首次结合PAGE电泳的方法克服了琼脂糖凝胶电泳分辨率低的问题。
[0017]另外，本发明采用提取感染黄龙病的叶片总DNA的方法，一并提取得到黄龙病菌DNA,设计的黄龙病菌特异性引物能避免柑橘基因组DNA的干扰，克服了黄龙病菌无法获得纯培养等技术缺陷，具有很好的推广应用价值。
【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1为所有36对Las-SSR可用引物的常规PCR筛选结果；其中“ + ”表示携带柑橘黄龙病菌亚洲种(fe.L.asiaticus)的砂糖橘叶中脉DNA，表示健康砂糖橘叶中脉DNA。
[0019]图2为9对Las-SSR核心引物扩增来自不同地区的32个柑橘黄龙病菌亚洲种(CkL.asiaticus)菌株的PAGE电泳多态图。
[0020]图3为9对Las-SSR核心引物扩增来自不同地区的32个柑橘黄龙病菌亚洲种(CkL.asiaticus)菌株的PAGE电泳多态图。
[0021]图4为我国6省的32个柑橘黄龙病菌亚洲种(Ck L.asiaticus)菌株基于SSR分析的条带多样性的聚类图。
【具体实施方式】
[0022]以下结合附图和具体实施例来进一步说`明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备及方法为本【技术领域】常规试剂、设备及方法。
[0023]实施例1本发明Las-SSR分子标记引物体系的筛选
1、利用Genebank数据库中的Genome数据库，查找得到gb I CPOO1677.5和gb I CP004005.1两个柑橘黄龙病菌亚洲种(Ck L.asiaticus)全基因组序列，核苷酸全长分别为1.23 Mb和1.27 Mb。
[0024]本实施例所用分析软件为SSR信息查找软件Tandem Repeats Finder (version
4.07b)在线分析系统(http://tandem, bu.edu/trf/trf.html)和引物合成软件 PrimerPremier 5.0。
[0025]实验方法为常规PCR、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE )。
[0026]2、利用 SSR 检索软件 Tandem Repeats Finder (version 4.07b)查找 2 个基因组中的所有2-500个碱基重复基序的所有SSR位点信息,经筛选后得到36个SSR位点，筛选标准:(I)若匹配率(Percent Matches)为100%，则重复单元的重复长度为4 bp-10 bp ；
(2)若Percent Matches介于90%和100%之间，则重复单元的最小重复长度为10 bp ；(3)重复数大于等于2。
[0027]用Primer Premier 5.0软件对这36个位点设计相应的SSR引物,设计得到36对Las-SSR引物(如表1所示)。引物设计参数主要包括:引物长度为15 bp~25 bp，退火温度为450C~65。。，GC含量为40%~65%，PCR扩增产物长度为100 bp~600 bp，其中Las-ssr28位点的序列总长度大于600 bp，其预测的PCR扩增产物长度为1742 bp。
[0028]表1本发明中设计合成的柑橘黄龙病菌Las-SSR引物序列
【权利要求】
1.一种用于柑橘黄龙病菌遗传多样性分析的SSR分子标记引物体系，其特征在于，包括 33 对 Las-SSR 可用引物，分别为 Las-ssrl~Las_ssr8、Las-ssrlO~Las_ssrl4、Las_ssrl6~Las_ssr20、Las_ssr22~Las-ssr36,引物序列如 SEQ ID N0.1~16、SEQ IDN0.19~28、SEQ ID N0.31~40、SEQ ID N0.43~72 所示。
2.根据权利要求1所述SSR分子标记引物体系，其特征在于，所述33对Las-SSR可用引物中有18对为SSR核心引物，分别是Las-ssrl、Las_ssr3、Las_ssr5、Las_ssr7、Las_ssrl2~14、Las_ssrl8、Las_ssr22、Las_ssr27~29、Las_ssr31 ~36，引物序列如 SEQ IDN0.1~2、SEQ ID N0.5~6、SEQ ID N0.9~10、SEQ ID N0.13~14、SEQ ID N0.23~28、SEQ IDN0.35~36、SEQ ID N0.43~44、SEQ ID N0.53~58、SEQ ID N0.61 ~72 所示。
3.—种权利要求1或2所述SSR分子标记引物体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: S1.柑橘黄龙病菌亚洲种全基因组序列的获得:从Genebank中下载得到2个柑橘黄龙病菌亚洲种菌株序列，Genebank ID: gb I CP001677.5 和 gb I CP004005.1 ； S2.全基因组序列中SSR位点的鉴定:利用SSR检索软件获得了36个含有SSR位点信息的序列； S3.根据S2得到的36个含有SSR位点的序列设计得到36对Las-SSR引物； S4.用普通PCR的方法验证S3得到引物的特异性，筛选得到33对Las-SSR可用引物； S5.利用S4筛选到的33对Las-SSR可用引物对柑橘黄龙病菌亚洲种进行遗传多样性分析，筛选得到18对SSR核心引物； 其中，步骤S3所述36对Las-SSR引物为Las-ssrl~Las_ssr36，序列如SEQ ID N0.1~72所示； 步骤S4所述33对Las-SSR可用引物分别为Las-ssrl~Las_ssr8、Las-ssrlO~Las-ssrl4、Las-ssrl6~Las_ssr20、Las_ssr22~Las_ssr36，引物序列如 SEQ IDN0.1~16、SEQ ID N0.19~28、SEQ ID N0.31 ~40、SEQ ID N0.43~72 所示； 步骤 S5 所述 18 对 SSR 核心引物分别为 Las-ssrl、Las_ssr3、Las_ssr5、Las_ssr7、Las_ssrl2~14、Las_ssrl8、Las_ssr22、Las_ssr27~29、Las_ssr31 ~36，引物序列如 SEQ IDN0.1~2、SEQ ID N0.5~6、SEQ ID N0.9~10、SEQ ID N0.13~14、SEQ ID N0.23~28、SEQ IDN0.35~36、SEQ ID N0.43~44、SEQ ID N0.53~58、SEQ ID N0.61 ~72 所示。
4.一种利用权利要求1或2所述SSR分子标记引物体系分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的方法，其特征在于，包括如下步骤: S1.实验材料的准备:选取典型斑驳症状的柑橘叶片，提取柑橘样品叶中脉总DNA，采用国际上通用的柑橘黄龙病菌特异引物OIl和0I2c扩增16S rDNA片段，检测为阳性的DNA样品进行SSR遗传多样性分析； S2.以SI获得的阳性的DNA为模板，利用本发明的SSR分子标记引物体系进行PCR扩增； S3.对S2所述PCR扩增得到的PCR产物进行电泳、显色，显色结束后，拍照获取谱带信息，比较同一 SSR标记在不同菌株中的多态性； S4.结果统计及遗传多样性分析:读取S3获得的谱带信息，以条带位置为依据，最小片段的带型为“1”，依次递增；收集所有条带类型信息，使用分析软件分别计算SSR标记的多态性位点频率、Nei's基因多样性指数和Shannon’s信息指数，反映菌株的遗传多样性；采用相关软件方法进行分析，获得UPGMA聚类图。
5.根据权利要求 4所述方法，其特征在于，步骤S3所述电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳。
【文档编号】C12R1/01GK103667452SQ201310564327
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】许美容, 邓晓玲, 郑正, 李昕昱, 洪红霞, 朱青 申请人:华南农业大学