鸡传染性喉气管炎病毒的鸡胚培养方法
【专利摘要】本发明提供鸡传染性喉气管炎病毒的鸡胚培养方法，将鸡传染性喉气管炎病毒株用病毒稀释液做5倍稀释，作为原液，再按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的梯度稀释，分别取0.2mL经绒毛尿囊膜接种10日龄SPF鸡胚；鸡胚于37℃、56%相对湿度孵化148h，无菌收集72～148h死亡鸡胚，3500r/min离心20min，取上清液，用于下次传代，共传3代。无菌收集72～148h死亡鸡胚，将病变的尿囊液及绒毛尿囊膜置于研磨器，逐渐加入尿囊液，充分研磨，4000r/min离心30min，上清液即为病毒液，-20℃保存。本技术具有取材容易、效率高、速度快、简便易行等优点。
【专利说明】鸡传染性喉气管炎病毒的鸡胚培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)，特别涉及一种鸡传染性喉气管炎病毒的鸡胚培养方法，属于生物【技术领域】。
[0002]
【背景技术】
[0003]鸡传染性喉气管炎(Avianinfectious laryngotracheitis, AILT)是一种急性、高度接触传染性呼吸道疾病，该病由疱疹病毒科-α疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(ILTV)引起，传播快，临床特征是伸颈、张口呼吸、咳血痰，死亡率增高和产蛋下降。天然感染的主要途径是上呼吸道和眼结膜。自然感染的潜伏期6~12d。气管内接种2~4d即可发病。病程一般为10~14d。易感鸡群发病率可达90%~100%，死亡率达20%~30%，有合并感染时可高达50%以上，造成养鸡业的严重损失。
[0004]目前病毒的培养方法主要有自然宿主、实验动物(易感动物)接种、传代培养、鸡胚接种或细胞培养等。其中鸡胚接种培养技术比组织培养容易成功，也比接种动物的来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，因此是常用的一种培养病毒的方法，此方法可用于某些病毒的分离、增殖、毒力滴定、中和试验及生产疫苗等。
【发明内容】
[0005]本发明技术为鸡传染性 喉气管炎病毒(ILTV)的鸡胚培养方法，包括以下步骤: 将鸡传染性喉气管炎病毒株用病毒稀释液(为每ImL灭菌生理盐水含盐酸环丙沙星
进行5倍稀释，作为原液，再按10' 10_2、10' 10_4、IO-5的梯度稀释，然后把5个梯度稀释的0.2mL病毒液经绒毛尿囊膜，分别接种于10日龄SPF鸡胚。以及
鸡胚在数字智能化孵化机中37°C、56%相对湿度下孵化，3h翻蛋一次。48小时弃去死亡鸡胚，观察至148小时，详细记录死亡与存活数。无菌收集72~148小时死亡鸡胚，3500r/min离心20 min，取上清液，用于下次传代培养。
[0006]如此重复三次，共传3代。无菌收集72~148小时死亡鸡胚。将发生病变的尿囊液及绒毛尿囊膜置于组织研磨器中，逐渐加入尿囊液，充分研磨，4000r/ min离心30 min,取上清液，即为ILTV病毒液(种子液)，-20°C保存。
[0007]其主要特点是:
(1)鸡胚的来源比自然宿主、实验动物(易感动物)和细胞等材料更容易获得，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般，培养的成本低；
(2)接种方法简便易行，SPF鸡胚无杂菌，无病毒隐性感染，培养纯度高，培养时间短。
[0008](3)病毒繁殖速度快，扩增量大。
[0009]总之，本技术发明具有取材容易、效率高、速度快、简便易行等优点。可用于鸡传染性喉气管炎病毒的分离、增殖、毒力滴定、中和试验及生产疫苗等。【专利附图】
【附图说明】
图1是本技术发明鸡传染性喉气管炎病毒的鸡胚培养方法的流程图
[0010]【具体实施方式】
1.病毒稀释
将鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)标准株用病毒稀释液进行5倍稀释，作为原液。再按10' 10_2、10' 10' 10_5的梯度稀释后接种鸡胚。
[0011]2.鸡胚接种与培养条件
采用FT-K数字智能化孵化机。所用SPF鸡胚为自行孵化，取10日龄鸡胚35枚，分为7组。每个鸡胚分别接毒10_1、10_2、10_3、10_4、10_5梯度的病毒稀释液0.21^，每个稀释梯度用5枚鸡胚，其余5枚鸡胚作为对照组接种生理盐水。37°C、56%相对湿度下孵化，3h翻蛋一次。弃去48h内死亡鸡胚，观察148h，详细记录死亡与存活数。无菌收集72~148h死亡鸡胚，3500r/min离心，取上清液，作为种子液，_20°C保存待用。
[0012]3.鸡胚半数致死量(ELD50)
按Reed-Menuch氏法计算ILTV的鸡胚半数致死量(ELD50)。
[0013]距离比值=(66.7%-50%) / (66.7%_33.3%) =0.50。
[0014]Lg EID50=-2+0.50 X (-1) =-2.50。
[0015]EID50=I(T2 5ciA).2mL。
[0016]该毒株的毒价为ID50 = 10_2 5°/0.2mL,可以引起鸡胚148小时内半数发生死亡，据此确定该病毒对鸡胚的感染剂量为每只IO-1UO-2U(T3A)J mL。
[0017]剖检鸡胚可见绒毛尿囊膜(CAM)水肿、增厚，有数量不等、大小不一、不透明的灰白色痘斑，胚体表面出血等ILT的特征性病变。
[0018]4.效价测定
病毒种子液用灭菌生理盐水(每Iml含青霉素和链霉素各2000u)做ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'Κ3稀释，接种10日龄鸡胚，进行鸡胚传代培养，孵化条件同上，离心后取上清液，_20°C保存。
[0019]重复上述过程，进行第二次传代培养，离心后取上清液，用于下次传代培养，如此重复三次，共传3代 。弃去48h内死亡鸡胚，观察148h，详细记录死亡与存活数。无菌收集72~148h死亡鸡胚，将发生病变的尿囊液及绒毛尿囊膜置于组织研磨器中，逐渐加入尿囊液，充分研磨，4000r/ min离心30 min，取上清液，即为ILTV病毒液(种子液)，_20°C保存。
[0020]分离病毒的滴度为1(T5_7ID50。
【权利要求】
1.本技术发明“鸡传染性喉气管炎病毒的鸡胚培养方法”，包括以下步骤: 将鸡传染性喉气管炎病毒株用病毒稀释液(稀释液为每IrnL灭菌生理盐水含盐酸环丙沙星IOyg)进行5倍稀释，作为原液；再按ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—5的梯度稀释，然后把5个梯度稀释的0.2mL病毒液经绒毛尿囊膜，分别接种于10日龄SPF鸡胚。
2.以及鸡胚在数字智能化孵化机中37°C、56%相对湿度下孵化，3h翻蛋一次；48小时弃去死亡鸡胚，观察至148小时，详细记录死亡与存活数；无菌收集72~148小时死亡鸡胚，3500r/min离心20 min，取上清液，用于下次传代培养，共传3代；无菌收集72~148小时死亡鸡胚，将发生病变的尿囊液及绒毛尿囊膜置于组织研磨器中，逐渐加入尿囊液，充分研磨，4000r/ min离心30 min，取上清液，即为ILTV病毒液(种子液)，-20°C保存。
【文档编号】C12R1/93GK103614343SQ201310570209
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月16日 优先权日:2013年11月16日
【发明者】魏锁成, 巩转娣, 张继瑜 申请人:魏锁成, 巩转娣, 张继瑜