苹果酸酶(nadp-me)基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了苹果酸酶(NADP-ME)基因及其应用，本发明提供的新型NADP-ME基因可在小麦中稳定表达与遗传，光合效率较受体材料明显提高，为利用C4型高光效基因改良C3作物的光合效能，选育产量水平大幅度提高的高光效转基因小麦品种提供了重要的基因来源和亲本材料支撑。
【专利说明】苹果酸酶(NADP-ME)基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体的涉及一种苹果酸酶(NADP-ME)基因及其应用。
【背景技术】
[0002]小麦是我国主要的粮食作物，其生产能力及供需状况始终关系到我国国民经济发展和粮食安全等重 大战略问题。从世界范围来看，世界粮食生产状况始终与各国政治、经济发展状况紧密联系，粮食生产量和储备量一有下降，国际粮价就大幅攀升，恐慌情绪就大势蔓延，对各国的政治经济形势造成重大影响；从国内来看，随着我国人口的增长，工业化和城镇化的快速发展，对粮食的需求将持续加大。同时，由于我国粮食作物种植面积不可能大幅度恢复增长，因此要保障我国粮食安全，唯一的出路是持续提高单产，这就要求在小麦、水稻等主要粮食作物的产量性状遗传改良方面获得跨越性的进展。
[0003]光合作用是一切绿色植物物质生产的基础，据估计，植物地上部干物质的90%来自于光合作用。因此，提高作物产量的关键是提高光能利用效率，从而提高单位面积的产量。而要大幅度提高光能利用率和实现超高产，必须采取合理株型(外在光合效率)和高光效(内在光合效率)相结合的技术路线。目前小麦、水稻等农作物单产水平的提高，主要是由于品种产量潜力遗传改良和生产条件改善的结果，而产量潜力的遗传改良主要是通过形态性状的改良和杂种优势等途径来实现的，在现有小麦、水稻等农作物品种产量水平已相对较高，且都已具有良好的形态结构，叶面积指数和收获系数都已接近极限的情况下，再单纯依靠上述途径已很难实现产量潜力的跨越式提高。在此背景下，国内外许多学者把目光纷纷投向光能利用效率的遗传改良研究，希望通过提高光合效率来实现生物学产量的大幅度提高，进而获得产量潜力改良的突破性进展。
[0004]根据光合作用途径的不同，植物可分为C3型，C4型和CAM(景天酸)型。C4和CAM植物是在逆境下经过长期驯化，从C3植物进化而来的。与小麦、水稻、大豆等C3植物相比，玉米、高粱、甘蔗等C4植物具有CO2浓缩机制，光补偿点高，CO2补偿点低，光呼吸弱，特别在高温、干旱等逆境条件下具有明显的光合优势。由于C4植物具有高光合、高水分、高氮素利用效率以及高生物学产量，因此将C4途径引入C3植物以提高其光合效率和籽粒产量，一直是国内外生物学研究领域的重大科学命题。以前此方面的研究主要途径是同室筛选、细胞融合和远缘杂交等方法，但一直未获得突破性进展。近年来日趋成熟的转基因技术由于可以打破物种间的生殖隔离，实现基因在不同物种中的交流，因此已成为解决农作物重要性状遗传改良瓶颈问题的主要技术途径。
[0005]目前将C4途径关键酶基因已有一些报道，但C4途径高光效关键基因导入C3作物后，其作用机理一直尚未明确。因此，以导入C4型高光效基因的C3作物为研究材料，深入研究〇4闻光效基因的导入对受:体材料相关代谢途径广生的影响，揭不C4途径关键基因在C3作物中的作用机理，可为利用C4途径关键基因改良C3作物的光合效能与产量潜力提供坚实的
理论基础。[0006]叶绿体内的NADP-苹果酸酶是C4型光合途径中的关键酶之一，它存在于维管束鞘细胞的叶绿体中。目前，在玉米、高粱、黄花菊属、拟南芥等多种植物中已克隆分离了 C4型nadp-me的cDNA均已被克隆。玉米nadp-me的cDNA全长2184bp,编码636个氨基酸残基，前体蛋白分子量为69.8KD,除去转运肽后，成熟蛋白分子量为60或63KD，翻译起始点在转录起始点的下游115bp处。高粱中克隆出的nadp-me基因的cDNA全长2139bp，含有1911bp的开放阅读框，编码636个氨基酸和一个终止密码子，其N末端含有一段转运肽序列，负责将ME的蛋白前体转运至叶绿体内部，剪接生成成熟蛋白。 [0007]在C4型nadp-me基因的基因工程研究方面，Honda等(2000)将CAM植物A 1earborescens的nadp-me基因转入水稻中，在转基因水稻植株中检测到有生物活性的NADP-ME。1991年Ku等研究指出，NADP-ME活性与光呼吸活性呈负相关关系。两个日本研究小组分别独立地将水稻Cab启动子与玉米C4型nadp-me基因全长cDNA构成的融合基因转入水稻。免疫电镜研究显示，超量表达的NADP-ME定位于叶绿体中，且转基因植株的叶绿体无基粒，类似C4植物维管束鞘细胞的叶绿体，因而叶绿体内NADP-ME的高活性可能是影响叶绿体发育的重要因素。
[0008]nadp-me基因的活性与光呼吸的速率呈负相关，将nadp-me基因转入C3植物，应该是降低C3植物的光呼吸，提高其光合效率的一个有效途径。但是目前研究工作表明，NADE-ME活性的提高对提高植物的光合效率似乎没有多大作用，有些研究报道还指出它的表达与光合效率呈负相关。Chi等(2004)将高粱的nadp-me转入水稻，转基因植物中酶的活性提高了 1-7倍，丙酮酸上升20%，苹果酸降低30%，但Rubisco，PPDK，NADP-MDH和PEPC活性均没有明显变化，光合作用也没有提高。Takeuchi等(2000)将玉米的nadp-me转入水稻，在转基因植物的叶片中NADP-ME酶活增加了 20-70倍，但转基因植物的叶绿体生长畸形，没有类囊体膜垛叠在一起而构成的基粒。而且，叶绿素的含量和光系统的活性与NADP-ME的含量成反比。因此，克隆新的，具有良好功能的C4型nadp-me基因对于改良C3植物的光合效能具有重要意义。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种苹果酸酶(NADP-ME)基因，在本发明的另一方面，还涉及一种能够提高小麦光合作用的苹果酸酶(NADP-ME)基因。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案:
[0010]本发明一方面涉及一种苹果酸酶(NADP-ME)基因，其特征在于所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1，或者与SEQ ID N0.1具有95%以上同源性的基因序列。
[0011]本发明另一方面还涉及一种苹果酸酶(NADP-ME)，所述的苹果酸酶(NADP-ME)的氨基酸序列为SEQ ID N0.1核苷酸序列所对应的氨基酸序列。
[0012]本发明另一方面还涉及一种载体，所述的载体含有上述苹果酸酶(NADP-ME)基因核苷酸序列。
[0013]在本发明的另一方面，本发明还涉及上述苹果酸酶(NADP-ME)基因、苹果酸酶(NADP-ME)或者载体在提高小麦光合作用中的应用。
[0014]在本发明的一个优选实施方式中，所述的载体通过基因枪介导法、农杆菌介导法或花粉管通道法导入小麦中。[0015]本发明提供的新型nadp-me基因可在小麦中稳定表达与遗传,光合效率较受体材料明显提高，为利用C4型高光效基因改良C3作物的光合效能，选育产量水平大幅度提高的高光效转基因小麦品种提供了重要的基因来源和亲本材料支撑。
【专利附图】
【附图说明】 [0016]图1a-1d:转基因小麦与对照在不同生育时期的净光合速率日变化。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
[0018]1、高光效nadp-me基因表达载体的构建
[0019]本发明所涉及的玉米自交系材料由河南省农业科学院粮食作物研究所提供或者采用河南当地普遍采用的玉米自交系材料。实验用RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自天为时代公司，MLV反转录试剂盒购自Promega公司，LA-TaqDNA聚合酶、PMD-19T克隆载体、大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5 α感受态细胞制备试剂盒均为TaKaRa公司产品，植物表达载体pC0MBIA3301为本实验室保存，限制性内切酶为MBI公司产品，氨苄青霉素为Amersco公司产品，其余试剂为进口或国产分析纯。
[0020]根据已报道的玉米nadp-me基因cDNA序列(GenBank登录号:ΝΜ_001111843.I),运用Primer5.0软件设计一对特异性引物:
[0021 ] PMl: 5’ -GTCCATGGTCCGAAGAGGGAGGAGGACGAC-3，，含有 NcoI 酶切位点，PM2:5’ -AAC
酶切位点；引物由上海Sangon公司合成。
[0022]玉米总RNA提取及cDNA合成参照Promega公司RNA提取试剂盒和MLV反转录试剂盒说明书进行。以玉米总cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系:10_50ng / ul基因组模板；10μΜ 的 Pl 和 P2 各 0.5μ I ;2.5μ IlOXReaction Buffer ；4μ I dNTP mix(2.5mM)；0.5μ I LA-Taq酶，加水至25 μ I。 反应程序:94°C预变性3min ;94°C变性45s，68。。复性30s，72°C延伸2.5min，30个循环；然后72°C延伸lOmin。PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收2kbp目的片段，通过T / A克隆法连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH5 α，涂平板过夜培养，挑取阳性克隆委托北京博尚生物公司测序，验证为正确的克隆命名为pMD19-me。将pMD19_me和双元表达载体pC0MBIA3301分别用NcoI和Pml I双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收2kb目的条带和表达载体片段，16°C连接过夜，转化大肠杆菌DH5 α，经PCR和双酶切鉴定为正确的克隆命名为p3301-me。
[0023]以小麦品种周麦23的幼胚为受体材料。取开花后12 — 14d的穗中部、大小一致的未成熟种子，用70%的酒精表面消毒lmin，无菌水冲洗3次后用0.1 %的HgCl2消毒IOmin,无菌水冲洗3—4次。无菌条件下剥出幼胚(Imm左右)，于MS诱导培养基(MS+2mg /L2，4-D+0.4%琼脂+3%蔗糖，pH6.2)上暗培养4_5d后，置于高渗培养基(MS+2mg /L2, 4-D+0.7%琼脂+甘露醇+3%蔗糖，pH5.8)上渗透处理4_6h，利用含有p3301-me载体的基因枪金粉微粒轰击后在高渗培养基上继续处理16h，转至愈伤诱导培养基。培养2周后转至草丁膦抗性筛选再生培养基(I / 2MS+0.5mg / L NAA+2.0mg / L ΚΤ+0.4%琼脂+3%蔗糖+4% ΡΡΤ, pH6.2)，连续筛选2代，每代2周，经过筛选的抗性苗转至生根培养基(I /2MS+0.2mg / L ΝΑΑ+0.4%琼脂+3%蔗糖，pH6.5)中，至再生苗根系较健壮时，即可进行炼苗1-2天。生根、壮苗后移入花盆中，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得再生植株125株。
[0024]提取所有再生植株的基因组DNA,根据已克隆的nadp-me基因序列利用 Primer5.0 软件设计了一对特异性引物 P3 (ATGGTCTTGTTGCCCTCGCTCTT)和P4 (GATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGT)，利用该引物对再生植株进行PCR检测，以鉴定阳性植株。PCR 程序:10-50ng / ul 基因组模板；10μΜ 的 Ρ3 和 Ρ4 各 0.5 μ l ；2.5 μ llOXReactionBuffer ；4μl dNTP mix (2.5mM) ；0.5μ I Taq 酶，加水至 25 μ l。PCR 反应条件为:94°C 预变性3分钟；94°C 45秒，57°C 45秒，72°C 50秒，35个循环；72°C延伸10分钟，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。有78株可以扩增出521bp的目的条带，鉴定为阳性植株。
[0025]对来自于TO代阳性植株的Tl代所有植株进行PCR检测，利用英国HANSATECH公司生产的CIRAS-1型便携式光合仪，在晴朗少云的天气测定小麦抽穗期(4月23日)、开花期(5月4日)、花后第7天(5月12日)和花后第15天(5月19日)的气体交换参数的日变化。光合日变化测定时间为 6:00,7:00,8:00,9:00U0:00U1:00,12:00、13:00、14:00、15:00,16:00,17:00、18:00每个时间持续40_45min，重复测定3次，往返测量，减少因太阳辐射的变化产生的影响。测定结果(参见附图1a-1d)表明，转nadp-me基因植株净光合速率明显高于对照周麦23，说明nadp-me基因在转基因小麦中能够正常表达和行使功能，对于小麦光合特性具有明显的提升作用。本发明获得了净光合速率明显提高的转基因植株，为高光效转基因小麦育种研究提供了材料支撑。
[0026]以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种苹果酸酶(NADP-ME)基因，其特征在于所述的基因的核苷酸序列为SEQ IDN0.1，或者与SEQ ID N0.1具有95%以上同源性的基因序列。
2.一种苹果酸酶(NADP-ME)，所述的苹果酸酶(NADP-ME)的氨基酸序列为SEQ ID N0.1核苷酸序列所对应的氨基酸序列。
3.一种载体，所述的载体含有权利要求1所述的苹果酸酶(NADP-ME)基因核苷酸序列。
4.上述苹果酸酶(NADP-ME)基因、苹果酸酶(NADP-ME)或者载体在提高小麦光合作用中的应用。
5.所述 的载体通过基因枪介导法、农杆菌介导法或花粉管通道法导入小麦中。
【文档编号】C12N9/04GK103614396SQ201310573920
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】许为钢, 王玉民, 张磊, 王会伟, 李艳, 胡琳, 齐学礼, 董海滨 申请人:河南省农业科学院小麦研究所