凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因及其编码蛋白的制作方法

凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因及其编码蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因及其编码蛋白。所述的凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其编码的钠钙交换子LvNCX蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明首次从凡纳滨对虾中克隆出钠钙交换子LvNCX基因，并通过实验证明该基因能够维持细胞体内钠、钙离子的平衡，为进一步深入分析NCX影响下生物抗逆能力，为NCX基因在凡纳滨对虾抗逆研究中的应用打下理论基础。
【专利说明】凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因及其编码蛋白
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及凡纳滨对虾钠钙交换子LvVCX基因及其编码蛋白。
【背景技术】
[0002]钠钙交换子(Sodium/calcium exchanger, NCX),为维持细胞体内钠、钙离子的平衡方面起着重要的作用，其是一种可逆膜转运蛋白，NCX在细胞膜或者细胞器的膜上都有发现，其功能是将2个Na+移出细胞，I个钙离子带入细胞，也可以以相反方向进行。NCX的功能是钙离子排出，以4:1:1 (Na+/Ga2+/K+)之比例排出，故为Na+/K+依存，是保持细胞内离子
稳定的一类重要通道。 [0003]凡纳滨对虫下(Litopenaeus vannamei),又称白脚对虫下、万氏对虫下、太平洋白虫下，英文俗称Pacific White Shrimp (太平洋白虫下)(McGraw et al.，2002),我国俗称“南美白对虾”。该对虾原产于西半球，主要分布于中南美洲从墨西哥西南沿海，经危地马拉、萨尔瓦多、洪都拉斯、尼加拉瓜、哥斯达黎加、巴拿马、哥伦比亚、厄瓜多尔至秘鲁西部的太平洋沿岸。由于凡纳滨对虾具有繁殖期长；广盐性；广温性；可以密养产量高；抗病力较强；耐干性较强；肉质鲜美；个体较大等优点目前已经成为是全世界产量最大的养殖对虾，也是我国对虾养殖的主导品种。在我国，养殖区域遍布于全国沿海的海水养殖区和内陆的淡水养殖区，养殖面积约25万公顷，年产量超过100万吨，海水养殖区和淡水养殖区产量各约占50%，从2001年以来，我国养殖凡纳滨对虾面积和产量一直居于对虾养殖的首位。2009年凡纳滨对虾养殖产量约110万吨，占对虾总产量的87%，其中广东养殖产量超过四十万吨，所占比例接近40%。2010年我国虾类产品的生产总量126万吨，虾类出口 21.6万吨，出口值近
11.4亿美元，年产值300~400亿元人民币，是我国水产养殖的支柱性产业。我国凡纳滨对虾养殖每年的种苗需求量超过5000亿尾。
[0004]凡纳滨对虾在高低盐环境中都可以养殖，这与该对虾体内存在很强的盐度调节机制以适应外界环境盐度的变化是分不开的。钠钙交换子作为重要的离子通道基因在凡纳滨对虾遗传育种研究中应用潜力很大，然而凡纳滨对虾的NCX基因筛选报道较少，且NCX基因的鉴定、表达分析及聚类情况研究至今未有报道。

【发明内容】

[0005]本发明第一个目的是提供一种凡纳滨对虾钠钙交换子LvVCX基因及其编码蛋白。
[0006]本发明的凡纳滨对虾钠钙交换子LvVCX基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其编码的凡纳滨对虾钠钙交换子蛋白LvVCX的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。
[0007]凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因的分离过程包括以下步骤:
[0008]1、构建凡纳滨对虾抗低盐胁迫抑制缩减杂交文库；[0009]2、经过NCBI数据库分析，筛选到LvNCX基因的部分序列；
[0010]3、逐级设计3’和5’ RACE (快速扩增cDNA末端)引物；
[0011]4、提取凡纳滨对虾腮组织的RNA反转录合成cDNA，以该cDNA为模板，采用步骤3中的引物进行PCR扩增出LvNCX基因的3’和5’序列，采用琼脂糖凝胶电泳回收片段，连接于pMD18-T载体上，测序分析之后利用DNAStar软件对序列进行拼接,其序列如SEQ IDN0.1所示，将此序列命名为凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因，其编码蛋白具有861个氨基酸残基，其序列如SEQ ID N0.2所示，将该蛋白命名为凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX蛋白。将 LvNCX 基因编码的蛋白质在 NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)中米用 Blastx 程序进行序列比对之后，发现该蛋白和Nasonia vitripennis的钠钙交换子序列有72%的同源性(如图1所示)，说明LvNCX基因所编码的蛋白具有钠钙交换子的结构特征。经Blastx比对，LvNCX基因所编码的蛋白序列不与任何先前已公布的蛋白序列完全一致，说明其是一个新发现的蛋白序列。
[0012]提取凡纳滨对虾在高盐胁迫和低盐胁迫下的鳃、消化腺、肝胰腺、上皮组织及肌肉组织，利用实时定量荧光PCR技术分析LvNCX基因在不同组织的表达情况，研究结果表明凡纳滨对虾的各个组织在低盐度胁迫表达量都明显高于对照组，然后在高盐度胁迫中的上皮组织的表达量稍低。与此同时高盐度胁迫下，LvNCX在肝胰腺组织和肌肉组织中明显高于低盐度胁迫下的表达；反之鳃组织和消化腺组织中LvNCX表达量在低盐度胁迫下明显高于高盐度胁迫的表达；利用生物学软件做LvNCX基因的系统进化树，结果表明LvNCX基因是凡纳滨对虾的钠钙交换子基因。
[0013]本发明首次从凡纳滨对虾中克隆出凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因，为进一步深入分析NCX影响下生物抗逆能力，为NCX基因在凡纳滨对虾抗逆研究中的应用打下理论基础。本发明通过对N CX基因cDNA表达调控规律的研究进一步验证LvNCX基因在盐度胁迫下的作用机理，提供了下一步探索和提高凡纳滨对虾抗逆选育的分子标记。同时还可以利用LvNCX基因的表达情况来有针对性的对凡纳滨对虾的抗逆选育提供理论指导。
【专利附图】

【附图说明】
[0014]图1是LvNCX基因编码的蛋白的Blastx对比结果图；
[0015]图2是凡纳滨对虾腮组织RNA电泳图，其中M为DL2000的Marker，I为凡纳滨对虫下腿组织RNA ；
[0016]图3是首次3’ RACE结果，其中M为DL2000的Marker，I为3’ RACE产物；
[0017]图4是首次5’ RACE结果，其中M为DL2000的Marker，I为5’ RACE产物；
[0018]图5是重组载体pMD18-LvNCX5’ RACE转化大肠杆菌后的菌落PCR检测电泳图，其中M为DL2000的Marker, I~24为阳性菌落PCR扩增产物；
[0019]图6 是第二轮 3 ‘RACE 结果，其中 M 为 DL2000DNA 的 Marker，I 为 3’ RACE PCR 产物I用M3-3和UPM引物扩增结果，2为3，RACE PCR产物2用M3-4和UPM引物扩增结果，3为3，RACE PCR产物3用M3-5和UPM引物扩增结果；
[0020]图1 是第二轮 5 ‘RACE 结果，其中 M 为 DL2000 的 Marker，I 为 5’ RACE PCR 产物；
[0021]图8是LvNCX基因的组织特异表达分析步骤中RNA提取结果，其中M为DL2000DNA的Marker，I~5分别为凡纳滨对虾鳃组织、消化腺组织，肝胰腺组织、上皮组织和肌肉的RNA。
[0022]图9是LvNCX基因的组织特异表达分析步骤中cDNA合成结果，其中M为DL2000DNA的Marker，I~5分别为凡纳滨对虾鳃组织、消化腺组织，肝胰腺组织、上皮组织和肌肉的cDNA。 [0023]图10是LvNCX基因的组织表达特异性表达结果；
[0024]图11是LvNCX蛋白的进化树分析；
[0025]图12是LvNCX的全长cDNA扩增结果，M为DL15000，I为全长cDNA扩增结果。
[0026]图13是原核重组表达载体pET-32a_LvNCX诱导表达的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白Marker，I为未经IPTG诱导的原核表达载体pET_32a，2为IPTG诱导2.5小时的原核重组表达载体pET-32a-LvNCX，3为经IPTG诱导5个小时的原核重组表达载体pET-32a-LvNCX。
【具体实施方式】
[0027]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0028]实施例1:
[0029]一、凡纳滨对虾钠钙交换子基因LvNCX的克隆及测序
[0030]1、引物的设计
[0031]以经淡水应激6h后的个体为Tester，盐度30培育的个体为Driver，构建盐度抗性性状相关的缩减cDNA文库，从文库随机挑选24个菌落PCR鉴定，插入片段的长度介于200~599bp。文库的库容量为2500个克隆，随机挑选500个克隆进行测序分析，共获得325个高质量的表达序列标签(ESTs)，得到275个Unigenes (104个Contags和171个Singletons)。经与GenBank数据库进行BLASTx和BLASTn同源性比较，其中79.1%为已知功能基因，与盐度抗性性状相关的基因包括Na-Ca交换子，根据EST序列设计5’和3’ RACE引物，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
[0032]2、RNA 的提取
[0033]以凡纳滨对虾腮组织为材料，使用Trizol法提取总RNA，具体操作如下:
[0034]在养殖场，取凡纳滨对虾腮组织放入离心管中马上放入液氮中速冻。加入ImLTrizol提取液(购自invitrogen公司，货号为15596-026)用小的碾磨棒碾碎，室温放置5min，使其充分裂解，再加入500ml氯仿，上下振荡混匀15min，室温放置15min，4°C 12000g离心15min，取上清，上清中加入Iml无水乙醇混匀，_20°C冷冻10_20min，4°C 12000g离心IOmin,再加入lmL75%乙醇,温和振荡离心管,悬浮沉淀,4°C 8000g离心5min,室温晾干,再加入50 u IDEPC处理水待溶解充分后测OD值定量RNA浓度。RNA电泳结果如图2所示。
[0035]3、cDNA 的合成
[0036]以提取的凡纳滨对虾腮组织的RNA为模板，用Superscript? III反转录酶(购自invitrogen 公司，货号为 18080-051)合成 cDNA，具体步骤为:RNA2u 1(约 5 y g)、01igo(dT)20lu l、10mM dNTPl u I，DEPC水补足总体积至13 y I ;65°C处理5min后，转至冰上IOmin ;再加入5X第一链缓冲液4iil、0.1MDTTl ill、RNA酶抑制剂liil，liil反转录酶，25°C反应5min,然后50°C反应60min ;70°C处理15min使反转录酶失活,得到cDNA序列。[0037]4、RACE 反应
[0038]具体操作步骤如下:
[0039]对ESTs序列进行测序，依据ESTs序列设计5’和3’RACE引物M5_1，M5_2和M3-1，M3-2，引物序列如下:
[0040]M5-1:TTCCCGACGGCGAGGTCCGCTACATCAA
[0041]M5-2: CTCCGTGTTCGCCTACATCTGGCTCTAT
[0042]M3-1:AGAGCCAGATGTAGGCGAACACGGAGAA
[0043]M3-2:GATGTAGCGGACCTCGCCGTCGGGAATG
[0044]Gene Racer 按照 Invitrogen 的 Geiu'Racer? Kit with AMV RT and TOPOTA Cloning? kit for Sequencing说明书进行。5，和3，RACE的反应体系分别为20 u L,其中包含 2 u LlOXAdvantage PCR 缓冲液，I y LlOmM dNTPs，I y LlO y M 引物 M5-1/M3-1，
Iy L Advantage?〗 polymerase mix (Clontech, JAP), 5 u LlO u M 通用引物 UPM (具体序列参照说明书)，I U L cDNA (IOng)，加ddH20补齐至Ij 20 u L。PCR反应程序如下:进入27个循环，94°C 30s, 68°C 30s, 72°C 2min。第二轮巢式扩增反应体系包括:5 y LlO X Advantage PCR缓冲液，2 u LlOmMdNTPs, 2 y LlO y M 引物 M5-2/M3-2，I u L Advantage? 2 polymerase mix,
IU L第一轮扩增产物，5 ii LlO ii M通用引物NUP (具体序列参照说明书)再加ddH20补齐到20ii L，反应程序是 94°C 2min,30 个循环 94°C 30s, 65°C 30s, 68°C 2min ;最后 72 度延伸 10分钟。将PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3和图4所示。使用琼脂糖凝胶回收试 剂盒(购自天根生化科技有限公司，货号为DP209)对琼脂糖凝胶电泳中的目的条带进行回收，具体操作步骤参照产品说明书。
[0045]采用pMD18-T vector kit (购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为D101A)对LvNCX基因进行TA克隆，具体步骤为:向1.5mL离心管中分别加入上述第二轮巢式扩增反应产物2.5111、口]\?18-1'载体1111 (50ng/ill)、Ligation Solution I 3.5yl，用封口膜封好，置于金属浴中16°C过夜连接获得连接产物。
[0046]使用热激法将上述连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞(购自天根生化科技有限公司，货号为CB101)，具体步骤为:将7iU上述连接产物加入到100 ill大肠杆菌E.coli DH5 a感受态细胞中，混合，再将混合液冰浴20min，42°C热刺激45s，再冰浴2min，加入900 u I SOC液体培养基，370C、150rpm摇床培养60min ;在超净台上吸取300 U I菌液于含有Amp、IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上，用无菌三角玻璃棒涂布均匀，37 °C过夜培养。
[0047]在上述过夜培养的LB固体培养基平板上挑取白色菌落，接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，用pMD18-T vector kit载体引物M13-47和RV-M (具体序列见pMD18-Tvector kit说明书)进行菌落PCR检测重组情况，PCR扩增体系和条件与之前扩增LvNCX基因相同。使用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示，由此得到含有重组载体pMD18-LvNCX的阳性克隆，该阳性克隆是将pMD18-T载体与基因LvNCX相连接。委托英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。在测序结果的基础上再设计第二轮5’和3’ RACE引物，具体操作步骤和上述5’和3’ RACE反应相同，第二轮RACE产物再做克隆测序，图6所示为第二轮3’ RACE电泳结果。[0048]第二轮5’ RACE所用引物如下:
[0049]M5-3: CGCCGATGAAGAGCCGCACCATAGCCAC
[0050]M5-4:GCCGCACCATAGCCACGAAATAAACGAT
[0051 ] 以M5-3和M5-4分别结合UPM及NUP引物做巢式扩增的结果如图7所示。
[0052]第二轮3’ RACE所用引物如下:[0053]M3-3:ATCACTTCCTTCTTCTCCGTGTTCG
[0054]M3-4:GTACGGAGTGGTGGAGTTCTGGGAGG
[0055]M3-5:GAGCAAGGAGTACCGTCTGAACAGG
[0056]进行第二次3‘RACE，分别用M3-3，M3_4，M3_5引物结合UPM引物扩增，扩增结果用上述方法克隆测序。把所有的测序结果利用DNAStar软件进行拼接，最终获得LvNCX的全长cDNA序列，长度是为3274bp,其中开放阅读框位于166~2672位核苷酸,这一阅读框编码861个氨基酸残基,包含一个Na-Ca-ex结构域,证明这个蛋白质是钠钙交换子，该氨基酸具有SEQ ID N0.2所示的序列。拼接后序列进行比对之后发现与Pseudopodoces humilis氨基酸序列有72%的同源性(如图1所示)。
[0057]二、LvNCX基因的组织特异表达分析
[0058]1、RNA 的提取
[0059]在养殖场，取经淡水(3ppt)、高盐度(40ppt)应激6h后的凡纳滨对奸个体的组织，包括肌肉、鳃组织、肝胰腺组织、上皮组织和消化腺组织，以及对照的各个组织分别放入1.5ml离心管中，然后放入液氮速冻，以保证RNA不被降解。所有组织拿回实验室之后，使用Trizol法提取总RNA,具体步骤为:加入ImL Trizol提取液(购自invitrogen公司，货号为15596-026)用小的碾磨棒碾碎，室温放置5min，使其充分裂解，再加入500ml氯仿，上下振荡混匀15分钟，室温放置15min，4°C 12000g离心15min，取上清，上清中加入Iml无水乙醇混匀，_20°C冷冻110-20min，4°C 12000g离心lOmin，再加入lmL75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4°C 8000g离心5min，室温晾干，再加入50 u I DEPC处理水待溶解充分后测OD值定量RNA浓度。RNA电泳结果如图8所示。
[0060]2、cDNA 的合成
[0061]分别以提取的凡纳滨对虾肌肉、鳃组织、肝胰腺组织、上皮组织和消化腺组织的RNA为模板，用Superscript? m反转录酶(购自invitrogen公司，货号为18080-051)合成cDNA，具体步骤为:RNA2iU(约 g)、01igo(dT)2Clliil、10mM dNTPl yl，DEPC 水补足总体积至13iU ;65°C处理5min后，转至冰上IOmin ;再加入5X第一链缓冲液4iU、0.1MDTTl U 1、RNA酶抑制剂liil，liil反转录酶，25°C反应5min，然后50°C反应60min ;70°C处理15min使反转录酶失活，得到cDNA序列。cDNA电泳结果如图9所示。
[0062]3、荧光定量PCR扩增
[0063]利用SYBR? Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus) (TaKaRa, JAP)试剂盒和根据已经拼接的LvNCX基因的核心序列设计荧光定量PCR引物。NCX-real F:
[0064]ATCGTTTATTTCGTGGCTATGG, NCX-real R:GCACCACAATAATCTGCGTCTC。(引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成)。在RotorGene3000 (Corbett Research, Australia)进行荧光定量PCR扩增，扩增程序如下:95°C 2min，进入40个循环95°C 30s,60°C 30s, 72°C 30s。以设计好的凡纳滨对虾P -actin作为内参(P -actin F:ACCATCCAGGCTGTGCTTTC ；3-actin R: ACCTTCATAAACGGGGACCA ) ? 反应体系是 20 y L，其中包含上下游引物 0.2, IOu Lof2><SYBR? Premix Ex Taq?, IuL cDNA。每一个反应做三个重复。数据利用 Rotor-geneversione.0进行分析。LvNCX基因的相对表达量利用2_AACT进行统计。所有的数据都利用SPSS Statisticsl7 (Chicago, USA)中的单项方差统计，P〈0.05。最终的表达结果如图10所示。研究结果表明凡纳滨对虾的各个组织在低盐度胁迫表达量都明显高于对照组，然后在高盐度胁迫中的上皮组织的表达量稍低。与此同时高盐度胁迫下，LvNCX基因在肝胰腺组织和肌肉组织中明显高于低盐度胁迫下的表达；反之鳃组织和消化腺组织中LvNCX基因表达量在低盐度胁迫下明显高于高盐度胁迫的表达。
[0065]三、LvNCX的系统进化树构建
[0066]用本发明得到的凡纳滨对虾LvNCX基因全长cDNA及其编码的蛋白质序列，在GeneBank的数据库中进行BLAST程序进行Blastx比对。LvNCX蛋白质的系统进化树依据下载的部分LvNCX蛋白质序列利用MEGA5软件Maximum Likelihood method来构建,结果如图11所示，结果表明所分析的12条蛋白质序列包括凡纳滨对虾的LvNCX蛋白，清晰地按照系统进化顺序归为两类，一类是脊椎动物门包括Xenopus laevis CAA62345,Mus musculusAAL18847, Pseudopodoces humilis XP005525436.1, Squalus acanthias AAZ08577, Homosapiens AAN60792, Meleagris gallopavoXP0032065, Oreochromis niloticusXP00345,Anolis carolinensis XP0032294。另外一类是节肢动物门包括 Ixodes scapularisXP002400531, Aedes aegypti XP001663976, Nasonia vitripennis XP001600652.1, Apismellifera XP393309,Harpegnathos saltator EFN81923,以及依据本专利获得的核酸序列推导出的LvNCX蛋白。因此，LvNCX序列是凡纳滨对虾的钠钙交换子基因。
[0067]四、原核重组表达载体pET-32a_LvNCX的诱导表达
[0068]根据LvNCX 的全长 cDNA 设计上游引物(5，-ACGGGATCCGCCACCATGGTGYGGCTCTTC-3’)(下划线表示酶切位点BamHI) 和下游引物(5’ -AGCAAGCTTTAGAGAGGGGATG-3，)(下划线表示酶切位点Hindlll)，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，利用PrimeSTAR? Max DNA Polymerase (TaKaRa)的扩增全长cDNA序列。PCR 扩增反应体系共 20ii 1:PrimeSTAR Max Premix(2X) 10 y 1、cDNA 模板 I y 1、IOiiM上游引物IiUUOiiM下游引物liil，使用ddH20补足至20 ill。反应条件为:94°C 30,35个循环，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C有延伸lmin30s。将PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图12所示。
[0069]使用BamHI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶对原核表达载体pET_32a (购自天根生化科技有限公司，货号为V1078)分别进行双酶切获得LvNCX基因片段和线型的pET-32a双酶切片段，具体步骤为:向0.5mL离心管中分别加入全长cDNAlO yl、BamHI限制性内切酶0.5iil、HindIII限制性内切酶0.5iil、10XK buffer2iil，使用ddH20补足至20iU，37°C反应8h。使用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收LvNCX基因和原核表达载体pET-32a，将回收的片段进行连接，具体步骤为=LvNCX基因片段
2u I (约 lOOng)、原核表达载体 pET_32al u I (50ng/U I)、Ligation Solution I5iil,加ddH20补足lOiil，金属浴中16°C连接过夜，将原核表达载体pET-32a和LvNCX基因连接，得到原核重组表达载体pET-32a-LvNCX。用热激发转化BL21感受态细胞(购自天根生化科技有限公司，货号CB106)具体步骤同上述热激转化法。[0070]取500 ill原核重组表达载体pET-32a_LvNCX的BL21菌液和原核表达载体pET-32a菌液置于20mL LB液体培养基中，37°C、200rpm摇床培养2h，培养结束后，分别取出lml，测定菌液0D600值，当0D600达到0.6，再分别取出2管(2ml/管)菌液，作为未经IPTG诱导的样品和未经IPTG诱导的阴性对照，再分别向剩余的两种菌液中加入终浓度为1.0mM的IPTG进行诱导，30°C、180rpm摇床培养2.5h和5.0h,分别取出2管(2ml/管)菌液，作为经IPTG诱导的样品。
[0071 ] 未经IPTG诱导的阴性对照、经IPTG诱导2.5h的样品、经IPTG诱导5.0h样品各取一管(2ml/管),用于总蛋白分析。具体步骤如下:4°C、12000rpm离心2min,弃上清,加入IOOiU细菌蛋白抽提缓冲液，再加入25iU5X蛋白上样缓冲液(Loading Buffer)，然后煮沸 5min，-20°C保存。
[0072]对上述2种样品和I种对照进行SDS-PAGE电泳检测分析。具体步骤如下:制备分离胶、浓缩胶，各上样10 yl，电泳后，取出分离胶，置于固定液中，摇床固定30min，弃固定液，加入染色液染色30min，弃染色液，加入脱色液，脱色60min ;弃脱色液，加入ddH20，摇床45rpm过夜，取出胶体，置于胶板上扫描，结果如图13所示。[0073]由此可见，经IPTG诱导2.5h和5h的样品均诱导出LvNCX蛋白，其中2.5h的表达量明细高于5h的表达量，而经IPTG诱导的阴性对照则没有诱导出LvNCX蛋白。
【权利要求】
1.一种凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种由权利要求1所述的凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因编码的凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX蛋白， 其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
【文档编号】C12N15/12GK103614383SQ201310573692
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】王艳红, 任春华, 胡超群, 张吕平, 罗鹏 申请人:中国科学院南海海洋研究所