一种甜叶菊毛状根诱导和培养生产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，具体涉及一种采用发根农杆菌遗传转化甜叶菊建立毛状根培养体系生产绿原酸及二咖啡酰奎宁酸的方法。内容包括甜叶菊外植体制备、发根农杆菌活化培养、悬浮培养及绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的生产。经PCR检测，证明甜叶菊毛状根为转化产生，HPLC检测表明甜叶菊毛状根能够生产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸。由于所使用的毛状根具备在无激素培养基上快速生长的特性，因此该方法操作简单、成本较低、不受气候、土地等自然条件的限制等优点。为利用毛状根培养生产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸提供了一种稳定、可持续的新型药源和食品功能因子，为今后应用生物反应器进行绿原酸和二咖啡酰奎宁酸规模化生产提供可靠的来源和物质基础。
【专利说明】一种甜叶菊毛状根诱导和培养生产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种采用发根农杆菌侵染甜叶菊诱导产生毛状根的方法，并用此毛状根生产次生代谢产物绿原酸和二咖啡酰奎宁酸。
【背景技术】
[0002]植物能够产生天然药用成分，但随之也带来植物资源大量消耗的局面。利用植物生物工程生产药用植物有效成分，能有效保护自然资源、节约土地，对于现代社会可持续发展意义重大。植物遗传转化发根农杆菌载体系统具有遗传和生物合成的稳定性以及毛状根生长快、易于培养、有效成分高等独特优势，为植物次生代谢物的工业化生产提供了广阔的前景。
[0003]目前，虽然国内外采用发根农杆菌遗传转化植物获得次生代谢产物的毛状根的相关研究较多，但对遗传转化甜叶菊获得产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸毛状根研究仍为空白。甜叶菊(Stevia rebaubiana),双子叶植物纲,属菊料斯台维亚属的一种小型多年生草本植物，又名甜草、甜菊、甜茶等。原产南美洲亚热带地区，巴拉圭和巴西交界的阿曼拜山脉。我国自1976年开始由南京中山植物园、中国农业科学院等科研单位先后从日本引进甜叶菊试种成功。80年代初向全国各地推广种植，生产的甜叶菊干叶主要出口日本。甜叶菊植物体内含有很多种物质，包括挥发油，二、三萜类，香豆素类，咖啡酸以及绿原酸等。其中，甜菊糖苷(Stevioside, St)是甜叶菊叶子中的二職类化合物,是天然的高甜度的甜味物质,甜度是蔗糖的200~300倍，一直受到人们的关注。甜叶菊中还含有一类很有价值的成分绿原酸和二咖啡酰奎宁酸，但含量较低，目前尚未得到有效利用。绿原酸，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、升高白细胞、免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血脂等作用。同时有研究结果表明，绿原酸是很有希望的抗艾滋病毒(HIV)的先导化合物。二咖啡酰奎宁酸是一类由奎宁酸与数目不等的咖啡酸通过酯化反应缩`合而成的酚酸类天然成分，广泛存在于植物界如金银花、旋覆花等中药及茶叶、山楂等果树中，具有抗肝纤维化及脂质过氧化作用。随着生物工程技术的不断提高，利用毛状根进行离体培养快速生产有效成分，已成为药用植物资源可持续发展的有效途径之一。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于，提供一种转基因技术遗传转化甜叶菊获得产药用成分绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的毛状根的方法，该方法将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入甜叶菊中，获得甜叶菊毛状根，为有效利用甜叶菊资源提供一条新途径。
[0005]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0006]1、甜叶菊种子置于MS、B5、WPM等培养基培养；
[0007]2、采用转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA至甜叶菊叶片中，包括以下步骤:[0008]a.发根农杆菌接种在YEB培养基活化；
[0009]b.用发根农杆菌侵染甜叶菊无菌外植体；
[0010]c.发根农杆菌与甜叶菊外植体共培养；
[0011]d.外植体在羧苄西林钠、头孢噻肟钠等抗生素除菌培养。
[0012]3、甜叶菊毛状根获得与继代培养；
[0013]4、甜叶菊毛状根的分子检测，方法如下:
[0014]a.提取甜叶菊毛状根DNA ;
[0015]b.获得含有rolB和rolC引物的PCR反应体系；
[0016]c.PCR反应扩增毛状根特有基因rolB和rolC ；
[0017]d.电泳检测目标条带。
[0018]5、甜叶菊毛状根中绿原酸的含量检测。
[0019]6、甜叶菊绿原酸和二咖啡酰奎宁酸提取和纯化
[0020]本发明中涉及的缩写术语、培养基:
[0021]1.外植体一甜叶菊无菌苗切成的茎段以及子叶节；
[0022]2.发根农杆菌培养基:YEB、LB ；
[0023]3.植物基本培养基:MS (Murashige and Skoog, 1962)、B5、WPM、White ;
[0024]4.抗生素:利福平Rif(Rifampicin)、卡那霉素(kan)、头孢噻I亏钠Cef (Cefotaxime)、羧节西林钠 Cb(Carbenicillin)等抗生素。
[0025]本发明方法的有益的效果体现在::
[0026]1、在本发明中，利用转基因技术，将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入甜叶菊细胞获得毛状根，通过筛选优良无性系，获得绿原酸和二咖啡酰奎宁酸含量相对较高而稳定的毛状根无性系，为甜叶菊的生产提供一种新型优质的可持续药源和食品功能因子；
[0027]2、与田间栽培甜叶菊相比，甜叶菊毛状根可获得稳定质量和产量，不受自然条件的限制，不占用耕地面积，可以工业化连续生产；
[0028]3、通过人工调控优化培养条件，可显著提高毛状根的生长和次生代谢产物的积累，具有可调节性；
[0029]4、该技术在毛状根培养过程中，不添加任何激素，因此，可以大大降低成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]附图1为甜叶菊无菌苗照片。
[0031]附图2为发根农杆菌诱导产生的毛状根照片。
[0032]附图3为毛状根在固体培养基上快速生长照片。
[0033]附图4为毛状根rol基因的PCR检测照片。
[0034]附图5为液体培养的甜叶菊毛状根照片。
[0035]附图6为甜叶菊毛状根中绿原酸含量。
【具体实施方式】
[0036]以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所属【技术领域】的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
[0037]实施例1甜叶菊无菌外植体的获得
[0038]人工去除甜叶菊种子上的冠毛，在20_40°C水浴锅内保温1-28小时，滤纸吸干，将甜叶菊种子用70%酒精消毒20-60S，用无菌水冲洗2-3次，再用0.1 %的汞液消毒2-20min，用无菌水冲洗5-6次。接种在固体培养基上，该培养基配方为:MS基本培养基，10~60g/L蔗糖，0.01~lmg/LNAA和O~lmg/L BA,再添加7_8g/L的琼脂粉。温度25±2°C条件下培养，黑暗培养10-20d，然后移至光室，光照强度为20001x，光照时间为12h/d，得到无菌苗。
[0039]实施例2发根农杆菌遗传转化甜叶菊获得毛状根
[0040]1、发根农杆菌的活化
[0041]将发根农杆菌接种于含利福平等抗生素的YEB固体培养基，挑取单菌落，接种在含利福平等抗 生素YEB液体培养基中，温度28~30°C，转速50~400r/min，震荡过夜培养，再取活化后的菌液10-500 μ L加入到10~50mL含Rif等抗生素的YEB(LB)液体培养基中，温度28°C，50~400rpm震荡暗培养至OD值为0.5-1.0。
[0042]2、发根农杆菌的重悬浮
[0043]室温10000~5000rpm离心2_20min,弃上清,菌体用等体积的1/2MS重悬浮,在25-35°C，50-200rpm震荡暗培养半小时，使菌液浓度达到0D600 = 0.2-1.5左右，用于侵染。
[0044]3、外植体的预培养
[0045]剪取培养在MS固体培养基上的甜叶菊无菌苗叶片和茎段外植体，接种到含有AS的MS培养基中，25°C暗培养2d。
[0046]4、发根农杆菌于甜叶菊共培养
[0047]将上述经预培养的甜叶菊叶片外植体(如幼嫩叶片)，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的1/2MS悬液中浸泡IOmin (轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触)后，取出浸染后的叶片用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基1/2MS中，暗培养2-6d。
[0048]5、甜叶菊的除菌培养
[0049]将共培养3d后的甜叶菊叶片用无菌水冲洗数次后用无菌吸水纸吸干叶片表面水分，置于除菌培养基l/2MS+100-500mg/LCb上除菌培养，7_10天后，转接到1/2MS+400~600mg/L头孢噻腭钠(Cef)上，在此期间，甜叶菊叶片的伤口处将会陆续出现白色毛状根；1-2周后将其转接到1/2MS+100~300mg/L头孢噻腭钠(Cef)上，1_2周后再转到1/2MS+100~300mg/L头孢噻腭钠(Cef)上，两周后基本除菌完毕后，转移至不含抗生素的1/2MS培养基上。培养条件为25±2°C，黑暗培养。
[0050]6、毛状根优质株系的筛选
[0051]挑选除菌彻底、经过PCR检测的毛状根，将分枝多、生长快速的毛状根转移至1/2MS培养液中，进行继代培养。
[0052]实施例3甜叶菊毛状根的分子检测
[0053]1、甜叶菊毛状根基因组DNA的提取，方法如下:
[0054]I)取幼嫩甜叶菊毛状根100-200mg，加入液氮磨成粉末；
[0055]2)将磨成粉末的甜叶菊毛状根装入1.5mlEppendorf的离心管中，加入600 μ I经60°C预热的2XCTAB以及10μ I的巯基乙醇，混匀后置于60°C水浴锅中40_50min，期间不时颠倒混匀；
[0056]3)待裂解液冷却至室温后加入等体积苯酚(pH8.0)，轻柔翻转混匀，静置IOmin ；
[0057]4) 12000rpm，离心20min后吸取乳白色上清至新管中，吸取时记下体积；
[0058]5)加入等体积酚:氯仿(1:1)，轻柔翻转混匀，静置IOmin ；
[0059]6) 12000rpm,离心20min后吸取乳白色上清至新管中，吸取时记下体积；
[0060]7)加入等体积氯仿，轻柔翻转混匀，静置IOmin ；
[0061]8) 12000rpm,离心20min后吸取乳白色上清至新管中，吸取时记下体积；
[0062]9)加入两倍体积遇冷的无水乙醇，析出絮状沉淀；
[0063]10)用吸头将白色絮状沉淀挑到EP管中，75%乙醇清洗两次，烘干；
[0064]11)加入无菌水充分溶解后再加入Rnase置于37°C水浴锅中30min，置于_20°C中备用。
[0065]2 X CTAB提取液(1000ml)的配方如下:
【权利要求】
1.一种获得产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的甜叶菊毛状根的方法，特征在于采用转基因技术，用发根农杆菌侵染甜叶菊外植体，包括如下步骤: (1)甜叶菊无菌苗的获得； (2)采用转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA至甜叶菊叶片中，包括以下步骤: a.发根农杆菌接种在YEB培养基活化； b.用发根农杆菌侵染甜叶菊无菌外植体； c.发根农杆菌与甜叶菊外植体共培养； d.外植体在羧苄西林钠、头孢噻肟钠除菌培养。 (3)甜叶菊毛状根获得与继代培养； (4)甜叶菊毛状根的分子检测，方法如下: e.提取甜叶菊毛状根DNA; f.获得含有rolB和rolC引物的PCR反应体系； g.PCR反应扩增毛状根特有基因rolB和rolC ； h.电泳检测目标条带。 (5)甜叶菊毛状根中绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的含量检测； (6)甜叶菊毛状根中绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的提取和纯化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中的外植体，是由甜叶菊种子经过无菌培养获得的叶片，并将叶片切成0.1~IOcm2的小块。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d中的羧苄西林钠、头孢噻肟钠浓度分别为 O ~500mg/L 和 O ~1000mg/L。
4.根据权利要求1所述的方法，利用甜叶菊毛状根提取、纯化获得绿原酸和二咖啡酰奎宁酸，其特征在于生产过程不添加激素，提取和纯化过程简便、成本低。
【文档编号】C12N15/84GK103695462SQ201310603423
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】陈继光, 上官新晨, 尹忠平, 吴少福, 付晓, 张清峰, 洪艳平 申请人:江西农业大学