表面展示花生过敏原的重组乳酸乳球菌的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明阐述了表面展示花生过敏原Arah2的重组乳酸乳球菌的构建方法及其应用。本发明对花生过敏原Arah2的天然基因序列进行密码子优化得到优化基因nArah2，构建了针对nArah2的细胞壁锚定表达方式的重组载体和乳酸乳球菌工程菌。本发明涉及的重组菌株作为口服疫苗免疫小鼠，可有效调节小鼠过敏性的免疫反应。因此，本发明可被开发为粘膜疫苗用于花生过敏的预防和治疗。
【专利说明】表面展示花生过敏原的重组乳酸乳球菌的制备方法及其应用
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及表面展示表达花生过敏原Arah2的重组乳酸乳球菌菌株，其构建方法及应用，属于生物工程【技术领域】。
【【背景技术】】
[0002]花生过敏是最严重而且常见的食物过敏反应之一，具有发病快、致死率高及
[0003]终生性等特点。近些年来，花生过敏的发病率在全球范围内有逐年上升的趋势。在美国，有1.1%的人口对花生过敏，其发病率在1997年至2002年间增长了近一倍。诱导特异性口服耐受，即在一段时间内通过给予患者逐渐增加剂量的过敏原以诱导患者对此种食物抗原产生免疫耐受的治疗方法，是目前比较有效的花生过敏治疗方法。
[0004]高纯度过敏原的获取是进行免疫耐受性诱导的前提和基础。花生过敏原共有11种，其中Arah2是一种分子量为17_19KDa的糖蛋白，可被超过90%的患者血清中IgE特异性识别，是目前研究最广泛也是最重要的花生过敏原之一。近些年来，分子生物学技术的发展使利用生物合成方法获取高纯度的过敏原成为可能。目前已有国内外研究者利用不同表达系统生产花生过敏原，如陶爱林等(2012)在专利《一种重组花生过敏原与突变体及其制备方法和应用》中介绍了利用大肠杆菌表达系统制备一种重组花生过敏原与突变体的方法；KatrinLehmann等已成功利用大肠杆菌重组表达具有良好免疫原性的Arah2蛋白(KatrinLehmann, etal.High-yieldexpressioninEscherichiacoli, purification, andcharacterizationofproperIyfoldedmajorpeanutalIergenArah2.ProteinExpressionandPurification, 2003, 3 1:250 - 259)。但大肠杆菌可产生结构复杂、种类繁多的内毒素，且表达产物的后续纯化成本高昂，限制了大肠杆菌原核表达系统的临床应用。
[0005]乳酸乳球菌长期以来被广泛应用于酸奶、奶酪、泡菜等传统食品的生产中，是公认安全的微生物。利用乳酸乳球菌表达外源蛋白可无需纯化连同菌体一起服用，同时利用乳酸乳球菌作为表达载体的黏膜疫苗可有效诱导机体产生免疫反应和免疫耐受。已有研究表明，利用宿主细胞表面展示技术表达外源抗原或治疗性蛋白，所制备的乳酸乳球菌粘膜疫苗可有效激发机体保护性的免疫反应。Xin等研究者将HIV病毒包膜蛋白的V2-V4区片段锚定在乳酸乳球菌细胞表面进行展示表达，用此重组菌口服免疫小鼠可刺激机体产生高水平抗HIV的特异性血清IgG和粪便IgA抗体，使小鼠卵巢中HIV病毒载量降低350倍(Xin, etal.1mmunogenicityandprotectiveefficacyoforallyadministeredrecombinantLactococcusIactisexpressingsurface-boundHIVEnv.Blood, 2003, 102:223-228)。因此，我们利用乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)作为粘膜疫苗呈递载体,将花生过敏原Arah2在L.1actis细胞表面进行展示表达，所构建的重组乳酸乳球菌在医药工业等领域具有广阔的应用前景。
【
【发明内容】
】[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种表面展示表达花生过敏原蛋白nArah2的重组乳酸乳球菌菌株及其构建方法，该菌株是用含有经过密码子优化的编码花生过敏原蛋白nArah2的编码基因的重组质粒pNZ3转化乳酸乳球菌所获得的，其中所使用的乳酸乳球菌可以是L.lactisNZ9000。转化后筛选所获得的菌株为L.lactisNZCW，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，其保藏编号为CGMCCN0.8218。本发明还涉及所述重组乳酸乳球菌菌株的构建方法，所述方法包括如下步骤:a)对花生过敏原Arah2的天然基因序列进行密码子优化以得到优化基因nArah2 ；b)利用优化基因nArah2进一步构建重组表达质粒；c)利用重组表达质粒转化乳酸乳球菌并筛选鉴定获取重组乳酸乳球菌菌株，其中所构建的重组表达质粒是锚定表达载体质粒PNZ3，构建重组表达质粒PNZ3时包括以L.lactissubsp.cremorisMG1363的基因组DNA为模板，利用引物 PcalF:5’ -TAGGGTACCTCTGGTGGCTCGACAACCACAATTAC-3’ 和 PcalR:5’ -CCGCAAGCTTTTAITTTAITCGTAGATACTGACCAATT-3’ PCR 扩增-cwa 序列；利用引物 PsplF:5’ -CCGGCCATGGTGAAAAAAAAGATTATCTCAG-3’ 和 Pral， R:5’-CGGGGTACCATAACGATCACGACCACCT-3’PCR 扩增-SPusp45-nArah2融合序列的步骤,步骤c)中的转化方法是电转化。
[0007]本发明还涉及包含所述的重组乳酸乳球菌菌株的疫苗，所述疫苗可以是口服制剂，例如胶囊剂、锭剂、粉剂或颗粒剂等。
[0008]本发明还涉及所述的重组质粒或重组乳酸乳球菌菌株在制备可用于治疗花生过敏的乳酸乳球菌疫苗中的用途。
[0009]本发明中重组花生过敏原蛋白nArah2成功地锚定在L.lactisNZ9000细胞表面进行展示表达，且动物实验结果表明，表面展示表达方式的重组乳酸乳球菌疫苗可调节过敏性的系统免疫反应，逆转Th2型免疫应答向Thl型免疫应答转变。
[0010]因此，优化的花生过敏原nArah2基因可以重组质粒DNA疫苗的形式用于花生过敏的预防及治疗；重组乳酸乳球菌菌株可以胶囊、锭剂、粉包、颗粒状包装的形式，作为一种新型的口服疫苗应用于花生过敏的临床预防及免疫治疗。
[0011]本发明涉及的重组乳酸乳球菌LactococcuslactisNZCW, 2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCN0.8218 ；
[0012]乳酸乳球菌Lactococcus IactisNZNH, 2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCN0.8216。
【【专利附图】
【附图说明】】
[0013]图1乳酸乳球菌重组质粒PNZ3的结构示意图；
[0014]图2:重组菌株L.1actisNZCff中蛋白表达情况的Westernblot检测图:泳道I为纯化的nArah2蛋白作为阳性对照，泳道2、3分别为L.lactisNZ48菌株的培养物上清和细胞沉淀组分，泳道4-6分别为L.1actisNZCff菌株培养物的原生质体、细胞壁和上清组分；
[0015]图3:动物实验免疫程序图；
[0016]图4:激发后血清中特异性抗体水平:A-C分别为特异性的IgE、IgG2a、IgGl水平，*表示实验组与Sham组之间差异性显著，P〈0.05。【【具体实施方式】】
[0017]以下通过实施例来进一步阐述本发明，下例实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册进行实验操作，各种试剂如无特殊说明，其浓度均为质量百分比浓度。
[0018]实施例1 Arah2基因序列的密码子优化
[0019]首先利用信号肽预测软件SignalP4.1Server对Arah2的氨基酸序列(genbank:AAN77576.1)的信号肽序列进行了预测，在与上述氨基酸序列相对应的基因序列(genbank:AY158467.1)中去除预测得到的信号肽序列，得到待优化的原始核苷酸序列。
[0020]根据乳酸乳球菌偏爱密码子表对原始核苷酸序列进行优化，优化后的基因命名为nArah2,由生工生物工程(上海)有限公司进行全基因合成，并亚克隆至载体pUC57上，得到PUC57-nArah2 (由上海生工合成，其中pUC57为商业化质粒)。[0021]优化前天然基因序列(genbank:AY158467.1), SEQIDN0.1。
[0022]优化后基因序列(nArah2)，SEQIDN0.2。
[0023]优化前氛基酸序列(genbank:AAN77576.1), SEQIDN0.3?
[0024]优化后氨基酸序列，SEQIdN0.4。
[0025]实施例2重组表达载体pNZ3的构建
[0026]利用 L.lactissubsp.cremorisMG1363 (Gasson.PlasmidcomplementsofStreptococcus lactis NCD0712and other lactic streptococci after protoplast-1nducedcuring.Journal of Bacteriology.1983，154 (I): 1-9)中固有 N-乙酸胞壁质酶 AcmA 基因(为Genebank已公开基因序列，GenBank:U17696.1)中的cA结构域作为锚定功能序列CffA0利用L.lactis subsp.cremorisMG1363的基因组DNA为模板，利用引物PcalF:5’-TAGGGTACCTCTGGTGGCTCGACAACCACAATTAC-3’ 和 PcalR:5’-CCGCAAGCTTTTATTTTATTCGTAGATACTGACCAATT-3’ PCR扩增进行PCR扩增-cwa序列。PCR反应体系(总体积为50 u L)为:10XKODplusbuffer:5u L ；dNTP:5u L ；MgS04:2u L ;DNA 模板:2u L ;上游引物 / 下游引物(20iiM):各 Iii L ；K0Dplus:0.5u L ；ddH20:33.5u L0 反应程序:95°C 30s (变性)，59°C 30s (退火)，68°C 60s (延伸)，扩增 30 次循环。同时以质粒 pNZ8148_SPUsp45_nArah2作为模板，利用引物 PsplF:5’ -CCGGCCATGGTGAAAAAAAAGATTATCTCAG-3’ 和 Pral’ R:5’ -CGGGGTACCATAACGATCACGACCACCT-3’ PCR 扩增进行 PCR 扩增 _SPUsp45_nArah2 融合序列。PCR 反应体系同上。反应程序:95°C 30s (变性)，60°C 30s (退火)，68°C 50s (延伸)，扩增30次循环。将回收纯化的两片段-cwa、-SPUsp45-nArah2及载体pNZ8148分别酶切反应后进行连接反应，得到质粒pNZ8148-SPUsp45-nArah2-cwa，命名为pNZ3，质粒组成参见图1。
[0027]实施例3重组乳酸乳球菌的制备
[0028]将上述构建质粒pNZ3 电击转化 L.lactisNZ9000 (Kuipersetal.Quorumsensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria.Journal ofBiotechnology.1998，64(I): 15-21)感受态细胞。挑取单菌落进行菌落PCR和双酶切验证并送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序验证，将测序正确的转化子命名为L.lactisNZCW，将携带空质粒菌株 L.lactisNZ9000/pNZ8148 命名为 L.lactisNZ48。
[0029]实施例4 Western blot分析重组蛋白的表达情况[0030](I)重组L.lactisNZ9000菌株的诱导表达:
[0031]挑取验证正确的重组菌株的单菌落接入含10 u g/ml氯霉素(Cm) GMl7培
[0032]养基(每升GM17培养基配方:大豆蛋白胨5g，细菌蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母粉
2.5g，葡萄糖5g，(6-磷酸甘油二钠19g，维生素C0.5g, lmol/LMgS041mL)中，30°C静置培养过夜；将过夜培养菌液以2%接种量转接入GM17 (CmlOu g/ml)液体培养基中，30°C培养至OD600约为0.6，加入nisin (Sigma，购自上海悠扬生物科技有限公司)作为诱导物，使其终浓度为50ng/ml，3 0°C继续培养6小时。
[0033](2)蛋白样品制备:
[0034]诱导结束后将菌液于4°C,5, OOOg离心IOmin,所得上清液中加入100% (w/v)三氯乙酸(TCA)至终浓度为16% (w/v)，冰上放置至少30min，4°C，12，000Xg离心30min，收集沉淀用预冷的丙酮洗涤两次，最后将沉淀溶解于50mMNa0H溶液中，-80°C保存以待检测。菌体沉淀用 TES (IOmMTris-HCl [pH8.0]，ImMEDTA, 25%sucrose)溶液洗涤两次后，重悬于 TES(10mg/mL溶菌酶，0.lmg/mLRNase)中，37°C温浴Ih0将得到上述菌液4°C，2500X g离心IOmin后所得上清的处理方法同培养物上清液，所得样品用于分析细胞壁中蛋白分布情况；离心所得沉淀重悬于TES后用于分析原生质体中蛋白分布情况。所得样品均保存于_80°C以待检测；
[0035](3) Western blot分析重组蛋白表达情况:
[0036]上述制备的蛋白样品经12%SDS-PAGE凝胶分离后，150mA恒流转膜50min
[0037]将蛋白转移至PVDF膜(Millipore，购自中科瑞泰生物科技有限公司)上；转印膜经TBST (每升10XTBS缓冲液配方:Tris2.42g，NaC18g，用HCl调PH至7.6 ；TBST缓冲液配方:10 X TBSlOOml，蒸馏水900ml, Tween-200.1%)洗涤后，用TBST (含5%脱脂奶粉)室温封闭1.5h ;然后转印膜与一抗(1:750稀释度)于4°C过夜孵育；用HRP标记羊抗兔二抗(1: 1.2 X IO4稀释度，购自上海悠扬生物科技有限公司)和转印膜室温条件下杂交Ih后，向转印膜上滴加显色液(购自北京康为世纪生物科技有限公司)后避光条件下显色。检测结果参见图2。如图所示:阴性对照菌株的上清及沉淀部分(泳道2和3)中未检测出信号，在阳性对照(泳道I)检测出约19kDa片段(与nArah2蛋白的预期大小一致);在菌株L.lactisNZCW的细胞壁部分(泳道5)检测出约46kDa片段，推测可能为去掉信号肽的nArah2-CWA蛋白；L.lactisNZCW的原生质体部分(泳道4)检测出约49kDa片段，可能为SPUsp45-nArah2_CWA前体蛋白。
[0038]实施例5动物模型评价疫苗免疫效果
[0039]疫苗制备过程如下:重组菌株的诱导表达步骤如上所述。将诱导结束后的菌液4°C，5，000g离心lOmin，所得菌体沉淀用无菌PBS洗涤两次后重悬于PBS中，使其浓度为I X 101(lCFU/ml，所得新鲜菌悬液用于免疫动物。
[0040]动物实验流程如图3所示:50只3-5周龄雌性C3H/HeJ小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)适应性喂养一周后随机分成5组(10只/组)，动物实验分三个阶段:(I)预防阶段:第-14-0连续两周每天灌胃2X IO9CFU新鲜制备的重组菌株；(2)致敏阶段:第0、1、2、7、14、21天灌胃12mg花生蛋白粗提物(CPE)和10 y gCT ; (3)激发阶段:第28天灌胃30mgCPE进行激发。
[0041]设第I组为天然组(Naive group)，在整个实验过程中正常喂养。第2组为模型组(Sham group)，在预防阶段灌胃PBS，而在致敏阶段进行正常的致敏。第3_5组(分别命名为Vector组、CYT组和CWA组)为实验组，在预防阶段分别灌胃重组菌株L.lactis NZ48、L.lactis NZNH (已构建的可胞内表达nArah2的重组乳酸乳球菌菌株；在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.8216)和L.lactis NZCW，在致敏阶段均灌胃CPE和CT进行致敏。所有组别的小鼠均在第28天灌胃CPE进行激发。
[0042]第35天激发后30_40min收集小鼠血清样品，_80°C保存用于后续检测血清中过敏原特异性抗体水平；实验结束后处死小鼠并无菌分离小鼠脾脏制备脾细胞悬液，加入50 u g/mL花生粗提物(CPE)于37°C、5%C02培养箱中共培养72h，收集上清保存于_80°C用于检测细胞因子水平。
[0043]实验结果表明:灌胃L.lactis NZNH和L.lactis NZCW均可抑制激发后小鼠血清中特异性IgE和促进特异性IgG2a的产生，但仅L.lactis NZCW组的变化达到统计学的显著性水平(P〈0.05);说明在调节系统性的体液免疫反应方面，L.lactis NZCff的调节作用优于L.lactis NZNH(参见图4)。与Sham组相比，CWA组和CYT组脾细胞中Th2型细胞因子IL-4的数量和Thl型细胞因子IFN- y的数量、Thl/Th2细胞因子比例分别有降低和升高的趋势，而CWA组的变化程度明显大于CYT组；这说明在调节细胞免疫反应方面L.lactisNZCW的调节作用更优越(参见表1)。基于以上结果，在体液免疫和细胞免疫方面，表面展示型重组乳酸乳球菌作为黏膜疫苗均可有效逆转过敏性的Th2型免疫应答向保护性的Thl型免疫应答方向转变，对花生过敏具有有效的免疫调节作用。
[0044]表1:脾细胞培养上清中细胞因子水平
【权利要求】
1.一种能表面展示花生过敏原nArah2的重组乳酸乳球菌菌株，其特征在于，所述菌株为LactococcuslactisNZCW, 2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCCN0.8218。
2.包含权利要求1所述的重组乳酸乳球菌菌株的疫苗，其特征在于，所述疫苗为口服制剂。
3.根据权利要求2所述的包含重组乳酸乳球菌菌株的疫苗，其特征在于，所述口服制剂为胶囊剂、锭剂、粉剂、锭剂或颗粒剂。
4.权利要求1所述的重组乳酸乳球菌菌株在制备可用于治疗花生过敏的乳酸乳球菌疫苗中的用途。
5.一种制备权利要求1所述的重组乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤: a)对花生过敏原Arah2的天然基因序列进行密码子优化以得到优化基因nArah2，如SEQN0.2 所示； b)利用优化基因nArah2进一步构建表面展示表达载体质粒PNZ3； c)利用重组表达质粒转化乳酸乳球菌并筛选鉴定获取重组乳酸乳球菌菌株。
6.根据权利要求5所 述的制备重组乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于步骤b)中构建重组表达质粒PNZ3时包括以L.lactissubsp.cremorisMG1363的基因组DNA为模板，利用引物 PcalF:5’ -TAGGGTACCTCTGGTGGCTCGACAACCACAATTAC-3’ 和 PcalR:5’ -CCGCAAGCTITTAITTTAITCGTAGATACTGACCAATT-3’ PCR 扩增-cwa 序列；利用引物 PsplF:5’ -CCGGCCATGGTGAAAAAAAAGATTATCTCAG-3’ 和 Pral，R:5，-CGGGGTACCATAACGATCACGACCACCT-3，PCR 扩增-SPusp45-nArah2融合序列的步骤。
7.根据权利要求6所述的制备重组乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于步骤c)中的转化方法是电转化。
【文档编号】C12R1/01GK103614331SQ201310646560
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】陈卫, 张秋香, 任晟诚, 王刚, 田丰伟, 刘小鸣, 赵国忠, 赵建新, 张灏, 郭敏 申请人:江南大学