采用lamp技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法
【专利摘要】采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法，该检测方法包括LAMP引物设计、LAMP反应体系建立以及采用LAMP检测方法，所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测。该法以嗜吞噬细胞无浆体16SrRNA为靶基因位点，具有快速、灵敏、高效、低成本等特点。
【专利说明】采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及采用环介导等温扩增技术(LAMP)检测嗜吞噬细胞无浆体方法。
【背景技术】
[0002]嗜吞噬细胞无浆体是立克次氏体目(Rickettsiale)无浆体科(Anaplasmataceae)无衆体属(Anaplasma)的一种重要的人兽共患病原体。该病原体广泛寄生于包括人、野生动物和家畜和啮齿动物的粒细胞内。人粒细胞无浆体病(Humangranulocytic anaplasmosis, HGA)就是由嗜吞卩遼细胞无衆体(A.phagocytophilum)侵染人末梢血中性粒细胞引起的(Lj Zhang, Y Liu, et al.Nosocomial Transmission of HumanGranulocytic Anaplasmosis in China[J].The Journal of the American Medical Association, 2008，300(19):2263-2270)。
[0003]目前，无浆体的主要检测方法有病原学诊断、血清学诊断法和分子生物学诊断法
等ο
[0004]病原学诊断主要有血涂片检查和动物接种试验。血涂片检查仍是无浆体检查最为经典的方法，其要求在疑患病动物用药之前体温较高时进行采血做血涂片，用姬姆萨染色法染色，染色后在1000倍油镜下观察结果。该方法虽简单可靠，但在实验过程中需要使用显微镜，对人员要求较高，且检出率低(党志胜，蒋锡仕，黄孝玢.我国牛羊边虫及边虫病的研究现状[J].青海畜牧兽医杂志，2003，33 (4):39-41)。临床上，若被检动物染虫率很低，不能确诊，可通过人工培养病原，接种实验动物来人工感染动物，然后收集接种动物的血液，进行诊断(G Ulrike, Munderloh, M Cynthia, M Lynch, et al.1solation of anAnaplasma sp.0rganism from White-Tailed Deer by Tick Cell Culture[J].Journal ofClinical Microbiology, 2003,41(9):4328-4335)。无浆体的体外培养往往需要较好的实验条件和操作熟练的专业技术人员，因此该方法不适用于田间流行病学调查，而较适合于病原的实验室分离。
[0005]血清学诊断主要有补体结合试验(CF)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。在我国，张其才利用边缘边虫高染虫率的含虫血所制备的补反诊断抗原具有敏感性良好和特异性很强的特点，CF方法对试验条件下人工感染牛的补反检出率为99%，安全区无假阳性反应(张其才，吕文顺，窦惠芳，等.补体结合试验诊断边虫感染牛的研究[J].中国兽医科技.1993,23(5):8-10)。该方法虽然具有其自身的很多优点，但其自身仍存在不足，它要求抗原和抗体的比例适当，否则会出现假阳性或假阴性现象，另外，由于操作条件和技能等较高要求的限制而不适合于田间流行病学调查。2007年Glen等证实了 ELISA方法能够有效且可靠的诊断家养羊的绵羊无浆体病和野生有蹄类动物的无浆体病(Glen A Scoles1WLGoff,TJ Lysykj et al.Validation of an Anaplasma marginale cELISA for use inthe diagnosis of A.0vis infections in domestic sheep and Anaplasma sp.1n wildungulates [J].Veterinary Microbiology, 2008，130 (1-2): 184-190)。2010 年徐平源等还对湖南地区边缘无浆体的MSP4基因进行了克隆及序列分析，这些都为重组抗原ELISA诊断方法的建立奠定了基础。ELISA多用于样品的批量筛检，且特异性强，但其缺点在于对时间和操作的要求非常严格，必须有专业人员完成，而且对于阳性的区别比较模糊，有时候需要反复做(徐平源，何德肆.湖南地区边缘无浆体的MSP4基因的克隆及序列分析[J].中国预防兽医学报，2010，32(10):815-817)。
[0006]分子生物学诊断方法主要有核酸探针技术、聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction, PCR)。核酸探针是指一段用放射性同位素或其他标记物(如酶与荧光素等)标记的DNA片段、单链DNA和RNA等。其具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱基互补序列的核酸片段结合，可用于样品中特定基因片段的检测。中国研究者马米玲等的研究表明，核酸探针技术的最大优点是可以较准确的区分形态相似的病原，但与病原学检查和血清学方法相比，其敏感性并不具有明显的优势，而且需要特殊设备，检出速度又慢，不适应于大批量样品的检测(马米玲，罗建勋，殷宏，等.边缘无浆体病诊断方法的研究进展[J].中国兽医科学，2008，38(07):633-638)。除常规PCR检测方法外，还有复合实时荧光定量PCR(JWCourtney, LM Kostelnik, NS Zeidner, et al.Multiplex Real-Time PCR for Detectionof Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burgdorferi[J].Journal of ClinicalMicrobiology, 2004，42(7):3164-3168)、实时反转录 PCR(KR Sirigireddy, RR Gant.Multiplex Detection of Ehrlichia and Anaplasma Species Pathogens in PeripheralBlood by Real-Time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction[J].Journalof Molecular Diagnostics, 2005，7 (2): 308-316)、双重 RT-PCR(N Decaro, G Carelli, E.Lorusso,et al.Duplex real-time polymerase chain reaction for simultaneousdetection and quantification of Anaplasma marginale and Anaplasma centrale[J].Journa of Veterinary Diagnos tic Investigation, 2008, 20(5):606-611)等方法检测无浆体，虽然PCR方法的敏感性高，特异性强，但是其操作繁琐，不适合实践应用，而更适合用于长期带虫动物的检测。
[0007]环介导的等温扩增技术(loopmediated isothermal amplification, LAMP)是日本学者Notomi等在2000年建立的一种快速、简单、灵敏、特异低成本的全新的核酸扩增技术(Tsugunori Notomi, Hiroto Okayama, Hatumi Masubuchi, et al.Loop-mediatedisothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Reseach.2000, 28 (12):63),其特点是针对靶基因的6个独立区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNAPolymerase)的作用下，不需要模板的热变性即可扩增。与传统PCR方法相比，LAMP技术属于等温扩增，无需昂贵的热循环仪，并且由于LAMP反应中产生大量的副产物——白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物可不经过电泳，无需开盖直接通过肉眼观察即可判定结果，在反应前、后加入染色剂效果更佳。LAMP技术敏感性高、特异性强、操作简便，能够满足现场和条件较差的基层实验室进行快速检测的需求。目前，LAMP方法已用于多种寄生虫等病原体的检测，例如，李群等根据牛巴贝斯虫的细胞色素b基因(cyt b)设计LAMP引物，建立了检测牛巴贝斯虫的LAMP方法(李群，王素华，周前进，等.快速检测牛巴贝斯焦虫LAMP方法的建立[J].中国预防兽医学报，2010，10(32):781-784);王中光等根据瑟氏泰勒虫表面蛋白基因(P33)设计引物，建立了检测牛瑟氏泰勒虫的LAMP方法(王中光，张守发，曹士诺，等.牛瑟氏泰勒虫环介导等温扩增检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2010，2 (32):108-111) ;Ma等根据绵羊无浆体的表面蛋白4 (MSP4)基因设计引物，建立了检测绵羊无衆体的LAMP方法(Miling Ma, Zhijie Liu, Jianxun Luo, etal.Development and Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal AmplificationMethod for Rapid Detection of Anaplasma ovis[J].JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.2011,49 (6):2143-2146) ;Pan等根据嗜吞噬细胞无浆体的表面蛋白2 (MSP2)基因设计引物，建立了检测嗜吞曬细胞无衆体的LAMP方法(Lei Pan, Lijuan Zhang, GuiqiangWang, et al.Rapid, Simple, and Sensitive Detection of Anaplasma phagocytophilumbyLoop-Mediated Isothermal Amplification of the msp2Gene[J].JOURNAL OF CLINICALMICROBIOLOGY.2011，49(12):4117-4120);目前，尚没有以嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA为靶基因位点的LAMP方法，本发明以嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA为靶基因位点设计引物，建立针对嗜吞噬细胞无浆体的LAMP方法。
【发明内容】
[0008]针对现有技术的检测方法检出率低、操作繁琐等问题，本发明提供一种LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法，该法以嗜吞噬细胞无浆体16sRNA为靶基因位点，具有快速、灵敏、高效、低成本等特点，为无浆体病的快速诊断提供科学依据。
[0009]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是:采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法，该检测方法包括LAMP引物设计、LAMP反应体系建立以及采用LAMP检测方法，所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测，所述的LAMP引物设计利用Primer Explorer V4软件针对嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因的6个位点设计4条LAMP引物，引物包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP， [0010]F3: GCAAGCCTGATCCAGCTATG ；
[0011 ] B3:AAGCCCTGGCATTTCACC ；
[0012]FIP:TGCCGGGACTTCTTCTGTAGGTTGAGTGAGGAAGGCCTTAGG ；
[0013]BIP:CCAGCAGCCGCGGTAATACGCCTACATGCCCTTTACGCC。
[0014]所述的LAMP反应体系包括:
[0015]I)引物混合液:外引物为F3和B3各0.2ymol/L，内引物为FIP和BIP各1.6ymol/L，外内引物比为1:8 ；
[0016]2)反映混合液:0.6mol/L Betaine,8mmol/L MgSO4,1.4mmol/L dNTP Mixture,8U/25μ L Bst DNA ；
[0017]3) 2μ I DNA 模版；
[0018]加灭菌双蒸馏水至25 μ I。
[0019]所述LAMP反应体系的反应条件，将引物引物混合液和反映混合液混合均匀后加入 2 μ I DNA 模版，在 60-65 °C 保温 40_90min。
[0020]所述LAMP反应体系的反应条件，将引物引物混合液和反映混合液混合均匀后加入2 μ I DNA模版，在65°C保温60min。
[0021]所述的荧光可视化检测采用SYBR Green I染料，在每个管盖内侧添加I μ L稀释10倍的SYRB Green I原液，合上管盖，反应结束后，轻甩反应管，使染料与产物混合。
[0022]本发明有以下优点:(I)扩增效率极高，60min内扩增产物可达到靶基因的IO9~101°倍；(2)本发明操作简单，只需在65°C恒温条件下将反应物混合，不需要复杂的温度变化过程；(3)本发明建立的LAMP方法灵敏性高，扩增模板只需10拷贝或更少；(4)本发明基于嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA建立的LAMP方法特异性高，可检测嗜吞噬细胞无浆体，不能检测牛无浆体、绵羊无浆体、吕氏泰勒虫、莫氏巴贝斯虫、血吸虫；(5)本发明结果判定简单，可以通过添加I μ LlO倍稀释的SYRB Green I染料，显色直接肉眼观察，不经过电泳。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是本发明检测嗜吞噬细胞无浆体电泳检测图及添加荧光染料显色图；
[0024]图A为检测结果的电泳图，M为DL2000DNA Marker, 1、2为阳性结果，为LAMP扩增梯形条带，N为阴性对照，无扩 增产物；
[0025]图B加荧光染料检测结果，左、中为阳性结果，具有绿色荧光，右为阴性对照，为红褐色；
[0026]图2是本发明中不同反应温度条件下测得的LAMP体系试验电泳检测图，图中所示:M:DL2000DNA Marker ；1:60°C ；2:61°C ；3:62°C ；4:63°C ；5:64°C ；6:65°C ；7:阴性对照，65 °C ；
[0027]图3是本发明中不同浓度MgS04条件下测得的LAMP体系试验电泳检测图，图中所不:M:DL2000DNA Marker ；I:2mmol/L；2:4mmol/L；3:6mmol/L；4:8mmol/L ；5:lOmmol/L；6: 12mmol/L ；7:14m mol/L ；8:阴性对照，8mmol/L ；
[0028]图4是本发明中不同浓度dNTP Mixture条件下测得的LAMP体系试验电泳检测图，M:DL2000DNA Marker ；1:0.8mmol/L ；2:1.0mmoI/L ；3:1.2mmol/L ；4:1.4mmol/L ；5:1.BmmoI/T, ；6:1.8mmol/L ；7:2.0mmol/L ；8:阴性对照，1.4mmol/L ；
[0029]图5是本发明中在加入不同量的酶的条件下测得的LAMP体系试验电泳检测图，M:DL2000DNA Marker ；1:2U ；2:4U ；3:6U ；4:8U ；5:10U ；6:12U ；7:14U ；8:阴性对照，8U/25μ L ；
[0030]图6是本发明检测嗜吞噬细胞无浆体敏感性试验电泳检测图，图中M:DL2000DNAMarker ；A图为LAMP电泳扩增图，1-7代表嗜吞噬细胞无浆体DNA含量为103-10_3copies/μ L，8为阴性对照，检测灵敏度是常规PCR的1000倍；B图为常规PCR电泳扩增图，检测结构不明显。
[0031]图7是本发明检测嗜吞噬细胞无浆体特异性试验电泳检测图，图中M:DL2000DNAMarker ；I:A.phagocytophilum ；2:A.bovis ；3:A.0vis ；4:B.motasi ；5:T.1uwenshuni ；6:Schistosome sp.;7:双蒸水，I为嗜吞卩遼细胞无衆体基因组出现LAMP特征性梯状条带,展示较好的特异性；
【具体实施方式】
[0032]下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0033]所述试剂均为市售，所用DNA模版本 申请人:实验室均有保存。
[0034]主要试剂:BstDNA 聚合酶大片段(Bst DNA polymerase large fragment),New England Biolab ;三甲铵乙内酯(Betaine), Sigma公司；Tap DNA聚合酶、脱氧核苷三憐酸(dNTP Mixture)> DL2000DNA Marker、6XLoading buffer, TaKaRa 生物合成公司；DNAGreen7TIANDZ ；SYBR Green I，Solarbio ;基因组DNA快速抽提试剂盒(血液)，上海生工生物合成有限公司。
[0035]试验仪器:电热恒温水浴锅，北京市长风仪器仪表公司，型号HwS24 ；PCR仪，GeneCompany Limited,型号9700 ;稳压稳流电泳仪,北京市六一仪器厂，型号DYY-5 ;紫外成像仪，SYNGENE,型号InGenius LHR ;数码照相机，佳能公司，型号IXUSl15HS ;快速混匀器，GENIE，型号V0RTEX-2 ;高速台式离心机，上海安亭科技有限公司，型号TGL-16B ;手掌型离心机，江苏海门市麟麟医用仪器厂，型号LX-100 ;分析天平，METTLER TOLEDO公司，型号AB204-N ;精密PH计，上海宇隆仪器有限公司，型号PHS-3C ;超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；双重纯水蒸馏仪，上海亚荣生化仪器厂，型号SZ-93 ;移液器，BRAND。
[0036]1.引物设计
[0037]首先本发明人从NCBI上下载了嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因序列(登录号:NR_044762.1),使用 Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index, html)设计多组引物，然后根据引物序列所在区域的保守性、引物的发夹结构、GC含量及Tm值等综合因素选择引物，共设计4条LAMP引物，其中包括2条外引物F3、B3和2条内引物FIP、BIP。引物的信息见表1:
[0038]表1引物序列信息
[0039]
【权利要求】
1.采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法，其特征在于:该检测方法包括LAMP引物设计、LAMP反应体系建立以及采用LAMP检测方法，所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和突光可视化检测，所述的LAMP引物设计利用Primer Explorer V4软件针对嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因的6个位点设计4条LAMP引物，引物包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP,
F3:GCAAGCCTGATCCAGCTATG ；
B3:AAGCCCTGGCATTTCACC ；
FIP:TGCCGGGACTTCTTCTGTAGGTTGAGTGAGGAAGGCCTTAGG ；
BIP:CCAGCAGCCGCGGTAATACGCCTACATGCCCTTTACGCC。
2.根据权利要求1所述的采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法，其特征在于:所述的LAMP反应体系包括: O引物混合液:外引物为F3和B3各0.2μπιο1/1，内引物为FIP和BIP各1.6Mmol/L,外内引物比为1:8 ；
2)反映混合液:0.6mol/L Betaine,8mmol/L MgSO4,1.4mmol/L dNTP Mixture,8U/25M-LBst DNA ； 3)2μ1DNA 模版; 加灭菌双蒸馏水至25 μ1。
3.根据权利要求2所述的采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法，其特征在于:所述LAMP反应体系的反应条件，将引物引物混合液和反映混合液混合均匀后加入2μ1 DNA模版，在 58-65°C保温 40-90min。
4.根据权利要求3所述的采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法，其特征在于:所述LAMP反应体系的反应条件，将引物引物混合液和反映混合液混合均匀后加入2μ1 DNA模版，在65°C保温60min。
5.根据权利要求1所述的采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法，其特征在于:所述的荧光可视化检测采用SYBR Green I染料，在每个管盖内侧添加I μ L稀释10倍的SYRBGreen I原液,合上管盖,反应结束后,轻甩反应管,使染料与产物混合。
【文档编号】C12Q1/68GK103695538SQ201310656319
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】宁长申, 王金鸿, 菅复春, 吕亚莉, 张龙现, 王荣军, 张艳, 韩琼琼, 张文静 申请人:河南农业大学