光合细菌sc01及其快速培养方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物的培养，具体的说是一种光合细菌SC01及其培养方法和应用。光合细菌为类球红细菌(Rhodobacter?sphaeroides)，已于2013年9月25日在中国微生物保存中心保藏，保藏编号为CGMCC?No.8248。将所述光合细菌SC01作为添加剂用于养殖生物培养过程中，进而使增加养殖生物的摄食量增强，同时降低残饵率。本发明所述的菌株具有筛选方法简单易行，生产及储运方便，使用效果明显等特点。具有良好的应用前景。
【专利说明】光合细菌SC01及其快速培养方法和应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及微生物的培养，具体的说是一种光合细菌SCOl及其快速培养方法和应用。【背景技术】
[0002]我国的海水养殖业经过数十年的迅猛发展，在沿海经济乃至国民经济发展中起着举足轻重的作用，海水养殖的品种包括鱼、虾、蟹、贝、海参等主要经济品种。山东是我国海水养殖业大省，以海参养殖为例，2012年山东省海参养殖面积达80万亩，年产7.1万吨，占全国海参总产量的一半以上，年产值达160亿元。且每年以20%的增长速度发展。
[0003]伴随海水养殖业的迅猛发展，养殖过程中的病害以及养殖废水的处理问题日益突出，成为制约行业健康可持续发展的瓶颈之一。特别是养殖废水长期得不到有效处理而直接排海。由于养殖后的海水中，饵料残留、养殖生物的粪便等导致的海水中氨氮、亚硝氮、磷酸盐等营养成分丰富，随意排海容易引起藻类等有害生物的滋生。当环境条件合适时，一些繁殖迅速的赤潮藻类的爆发，常常引起海水中含氧量的急剧下降，造成养殖海区的养殖生物大量死亡，同时，由于养殖废水中含有抗生素、清洁剂、杀菌剂等有害物质，随意排海有可能造成近岸甚至近海生物多样性减少或消失，引起海底荒漠化等一系列严重生态问题。
[0004]因此，基于微生物技术开发一些能够用于海水养殖的，既有利于养殖生物健康，有能够进行养殖水质改良的微生态制剂，可以大大缓解上述问题的产生及发展。从而有利于降低养殖消耗，减少排海风险，增加农民收入，促进行业的长期稳定和可持续发展。[0005]光合细菌一类能够以光作为能源、在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的硫化物、氨等有机物作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物。光合细菌是地球上最早出现具有原始光能合成体系的原核生物。在长期的进化过程中，光合细菌形成了自己独特的代谢系统，在新型药物、功能酶类、以及环境治理方面具有潜在的科研和应用价值。
[0006]在水产养殖方面，人们已经开始利用光合细菌进行养殖水质的改善和病害控制方面的实践，但缺乏系统的理论指导。对于菌种选择、光合细菌的使用量，使用时机等方面目前尚没有系统的理论指导，在生产及使用过程中仍存在较大的盲目性。
【发明内容】
[0007]本发明目的在于提供一种光合细菌SCOl及其快速培养方法和应用。
[0008]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0009]一种光合细菌SC01，光合细菌分类学命名为类球红细菌(Rhodobactersphaeroides),已于2013年9月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.8248，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0010]光合细菌SCOl的快速培养方法:
[0011]将光合细菌于快速培养基中，在28-30°C，150-300rpm，自然光照下至0D_到
0.8-1.0 ；
[0012]或，将光合细菌于快速培养基中室温条件下静置培养5-7d,并每间隔24h搅拌将培养液混匀，培养至0D_到0.8-1.0 ；[0013]所述快速培养基成分为=K2HPO40.25-0.5g/L，KH2PO40.25-0.5g/L，酵母膏1.5-3.0g/L，NaAc2.0-2.5g/L，NH4Cll.0—1.5g/L，pH值 6.8-7.4，用陈海水定容至 1000mL。
[0014]所述每间隔24h采用搅拌或反转培养器具的方式将培养液混匀。
[0015]光合细菌SCOl的应用，将所述光合细菌SCOl作为添加剂用于养殖生物培养过程中，进而使增加养殖生物的摄食量增强，同时降低残饵率。
[0016]本发明光合细菌从大菱鲆育苗厂分离获得。该光合细菌革兰氏染色为阴性，无芽孢，无荚膜。在LB平板上，菌落成红色，圆形，中间凸起，光滑湿润。对获得的菌株进行16SrDNA序列测定，采用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增，取PCR产物2~5 μ I进行lwt%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测.用琼脂糖凝胶纯化试剂盒(购自大连宝生物公司)切胶回收1.5kb大小的PCR产物进行测序分析。菌株的16SrDNA序列测序结果登录GenBank,并用BLAST与GenBank中的16SrDNA序列进行同源性比较，将得到的相似菌株的16SrDNA,利用MEGA4.0软件，构建系统发育树，分析各分离菌株的进化地位。经鉴定:是一种为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。于2013年9月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.8248。该菌株16SrDNA的GenBank登陆号为:KF791043。
[0017]本发明所具有的优点:
[0018]本发明所采用的光合细菌对大菱鲆等主要海水养殖经济动物育苗及养殖具有良好的应用前景。可用于改善因残饵、粪便等导致的水质恶化问题，降低残饵率，提高单位时间内养殖动物的重量。同时本发明所述的菌株具有筛选方法简单易行，生产及储运方便，使用效果明显。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明实施例提供的光合细菌SCOl生长曲线示意图。
【具体实施方式】
[0020]围绕本发明所述的菌株及【具体实施方式】做详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0021]实施例1光合细菌的筛选
[0022]1)采样及处理:分别取大菱鲆育苗厂厂区排水沟底层海水、池壁附着物、池底污泥、育苗及养殖池底层海水、附着物、池壁及池底残留的污泥Sg，加入100ml的灭菌海水，置于300ml的无菌三角瓶中，充分震荡15min,去除杂草、岩石等大颗粒物质,制备成样品悬池液。
[0023]2)富集培养:取样品悬浊液5mL，加入含有50mL的无菌富集培养基(KH2PO40.5g/L，酵母膏 1.5g/L,胰蛋白胨 0.05g, CaCl0.05g, NaAcl.0g/L, NH4Cl0.2g/L, MnSO40.05g,MgSO40.025g, FeSO40.002g, pH值7.2，用蒸馏水定容至1000mL)的150ml三角瓶中，加入IOml石蜡油，封口膜封口。28°C，20001ux光照培养。每48h观察培养液颜色变化。此富集培养过程持续至30天。
[0024]3)分离培养:当富集培养液明显呈现红色，取2ml，加入50ml的液体分离培养基(K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，酵母膏 1.5g/L，NaAcl.0g/L, NH4Cl0.2g/L，谷氨酸 0.005g，pH 值7.4，用蒸馏水定容至1000mL), 28°C，20001ux光照，300rpm振荡培养3d，此时培养液经肉眼观察变成深红色，取IOOul该培养液涂布在固体分离培养基平板(K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，酵母膏 1.5g/L，NaAcl.0g/L, NH4Cl0.2g/L，谷氨酸 0.005g，琼脂粉 10g，pH 值 7.4，用蒸馏水定容至1000mL。)上，28°C，20001ux光照，倒置培养7d，选择红色菌落，重复在上述固体培养基上划线分离，至得到菌落形态一致的纯培养物，命名为SCOl并保存。经生理生化及16s rDNA分析，确定SCOl为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。于2013年9月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.8248。
[0025]实施例2光合细菌SCOl的培养
[0026]将上述实施例获得的光合细菌进行快速培养，取50ul-80°C冻存的SCOl接种至IOml 快速培养基(K2HPO40.25g/L, KH2PO40.25g/L，酵母膏 3.0g/L, NaAc2.0g/L, NH4Cll.0g/L，pH值6.8，用陈海水(静置沉淀14天后去除沉淀物)定容至1000mL。)中，28°C，300rpm，自然光照下培养120h至OD6tltl到1.0,以此作为种子液，按照5% (体积比)接种量将种子液接种于快速培养基中，28°C，150rpm，自然光照下培养120h。间隔2h取出培养液测定0D_。绘制SCOl的生长曲线(图1)。
[0027]利用平板计数法计算单位体积内的菌落形成单位(CFU, colony-forming unit):待SCOl菌液OD600至1.0，取Im用无菌海水按照10_5稀释，分别取200ul的稀释液均匀涂布在三个固体快速培养基平板上(在快速培养基中添加1.0-1.2% (质量体积比)的琼脂粉)，28°C，倒置培养120h。三个培养基平板上分别形成了 18、28、23个红色菌落。按照公式:CFU/ml=生长菌落的数量/ (用以稀释的菌液体积X稀释倍数X涂布液的体积)。即每毫升OD6tltl为1.0的SCOl菌液中菌落的平均数量约为1.3X 107。
[0028]实施例3SC01对残饵率的影响
[0029]取0D_至1.0的SCOl培养液5ml，添加至50L海水的暂养池中，每个养殖池中放入10条身体全长为6-8cm的健康大菱鲆。室内正常光照，养殖池每分钟曝气量为6.5L,养殖用常规复合颗粒饵料(颗粒饵料通常在海水中2h不会解体)的添加量按照每天每池颗粒饵料300粒(约10g)，分3次投加。每次投喂后2h，将养殖池中残留饵料捞出，清点各养殖池中残留饵料的数量，计算残饵率。同时以未添加SCOl培养液的暂养池作为对照，进而观察发现投加有光合细菌SCOl的养殖池，大菱鲆摄食欲望强烈，出现争抢饵料的现象，未投加SCOl的养殖池，大菱鲆摄食欲不强，降落至池底的饵料较多。通过计算，投加SCOl的养殖池中残饵率平均为48%，而未投加SCOl的养殖箱中，残饵率为64%。
[0030]实施例4SC01对大菱鲆体重的影响
[0031]准备6个装有50L海水的暂养池，设置3个样品组和3个对照组，其中样品组每个养殖池中添加0D_至0.8-1.0的SCOl培养液5ml，对照组加入5ml快速培养基，每个养殖池中放入10条平均体重为7g的健康大菱鲆，室内正常光照。养殖池每分钟曝气量为6.5L，每天饲料添加量按照每池8-lOg (颗粒饵料约300粒)，分3次投加。20天后计算体重。结果如表1所示，投加有光合细菌SCOl的养殖池，大菱鲆平均体重为9.90g，未投加SCOl的养殖池,大菱鲆平均体重为8.83g,经分析，投加SCOl组的大菱鲆的体重比不投加SCOl组的体重有明显差异。说明SCOl可以有效提高单位时间内养殖生物的体重。
[0032]表1scOl添加前后实验组与对照组中大菱鲆体重的变化
[0033]
【权利要求】
1.一种光合细菌SC01，其特征在于:光合细菌为类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)，已于2013年9月25日在中国微生物保存中心保藏，保藏编号为CGMCCN0.8248。
2.—种权利要求1所述的光合细菌SCOl的快速培养方法，其特征在于: 将光合细菌于快速培养基中，在28-30°C，150-300rpm，自然光照下至OD6tltl到0.8-1.0 ； 或，将光合细菌于快速培养基中室温条件下静置培养5-7d，并每间隔24h搅拌将培养液混匀，培养至OD600到0.8-1.0 ； 所述快速培养基成分为=K2HPO40.25-0.5g/L，KH2PO40.25-0.5g/L，酵母膏 1.5-3.0g/L,NaAc2.0-2.5g/L, NH4Cll.0—1.5g/L, pH 值 6.8-7.4，用陈海水定容至 1000mL0
3.按权利要求2所述的光合细菌SCOl的快速培养方法，其特征在于:所述每间隔24h采用搅拌或反转培养器具的方式将培养液混匀。
4.一种权利要求1所述的光合细菌SCOl的应用，其特征在于:将所述光合细菌SCOl作为添加剂用于养殖生物 培养过程中，进而使增加养殖生物的摄食量增强，同时降低残饵率。
【文档编号】C12R1/01GK103740615SQ201310732029
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】栾顺香, 焦绪栋, 秦显明 申请人:莱州市顺昌水产有限公司