高密度发酵生产普鲁兰多糖的方法
【专利摘要】本发明公布了一种高密度发酵生产普鲁兰多糖的方法，属于微生物发酵领域。为了解决传统优化调控方法中的不足，进一步增加普鲁兰多糖产量，提高普鲁兰多糖发酵过程中的效率，降低发酵过程中色素的产生，本发明通过两阶段调控pH和溶氧，从而实现高密度发酵，将普鲁兰多糖产量提高50%以上，而且在一定程度上降低了色素的产生，为后续提取减少了麻烦，进一步降低了普鲁兰多糖的成本。
【专利说明】高密度发酵生产普鲁兰多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种高密度发酵生产普鲁兰多糖的方法，特别涉及一种两阶段调控PH和溶氧来生产普鲁兰多糖的方法。
【背景技术】
[0002]微生物多糖主要指大部分细菌、少量的真菌和藻类产生的多糖。由于具有安全性高、副作用小、理化特性独特等优点且生产周期短，不受季节、地域、病虫害等条件的限制而使其在食品和非食品工业备受关注，尤其在医药领域具有巨大的应用潜力。常见的微生物多糖有:黄原胶、结冷胶、热凝胶、普鲁兰多糖等。
[0003]微生物多糖发酵大部分属于高粘度发酵，由于微生物多糖多属于次级代谢产物，在微生物处于稳定期开始大量产生，所以目前研究提高微生物多糖产量的方法基本上都是将微生物多糖发酵分为两个阶段:第一阶段是通过优化条件使菌体大量产生；第二阶段是菌体进入稳定期以后通过改变条件使多糖大量产生。
[0004]高密度发酵采用两阶段工艺，一方面可以减少菌体培养阶段的设备规模，节省大型发酵罐在发酵过程中的功率消耗和能量消耗，另一方面可以提高细胞培养和多糖合成的生产强度，使生产过程达到节能降耗的目的。
[0005]现有技术中大多都是通过菌种诱变、培养基优化来提高普鲁兰多糖产量，但由于普鲁兰多糖发酵属于高粘度发酵，在发酵后期，随着粘度的增加，菌体对底物的利用效率大大降低，色素产生严重，对后续提取过程带来了极大的不便，而通过传统优化的方法进行调控，对普鲁兰多糖产量的增加往往不是很明显，而且发酵效率也不能得到很好提高。
【发明内容】
[0006]为了解决传统优化调控方法中的不足，进一步增加普鲁兰多糖产量，提高普鲁兰多糖发酵过程中的效率，降低发酵过程中色素的产生，本发明通过两阶段调控PH和溶氧，从而实现高密度发酵，大大提高普鲁兰多糖的生产强度。
[0007]本发明技术方案如下:
[0008]高密度发酵生产普鲁兰多糖的方法，通过两阶段调控pH和溶氧，第一阶段使菌体大量生长，菌体得到大量的积累；第二阶段改变PH和溶氧，使普鲁兰多糖大量产生。具体包括如下步骤:
[0009](I)将菌株接于种子培养基进行摇瓶活化，转速为150-250rpm，温度为28°C，培养时间为30-35小时。
[0010](2)活化后的种子培养液以2-5% (v/v)的量接于新的种子摇瓶中进行扩大培养，转速为150-250rpm，温度为28°C，培养时间为16-20小时。
[0011](3)将步骤(2)所得种子液以2-5% (v/v)的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体生长情况即OD62tl值对pH和溶氧进行调控:当菌体OD62tl < 0.7(种子干重小于12g/L)时，溶氧降至60%左右时，将溶氧与搅拌串联，使溶氧维持在50%-60%之间，同时利用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠调控pH使其稳定在2.8-3.2之间使菌体大量产生；当菌体OD620 ^ 0.7 (种子干重不小于12g/L)时，将溶氧设定在25%-30%之间，同时利用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠调控pH使其稳定在4.8-5.2之间使菌体大量合成普鲁兰多糖；温度28°C，发酵时间72-96小时。
[0012](4)每隔8小时取样记录测定各项指标:pH、溶氧、菌体干重、普鲁兰多糖产量。
[0013]所述菌株具体为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans) BCSWGHPL101,于 2012年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号CGMCC N0.7055，分类命名出芽短梗霉 Aureobasidium pullulans。
[0014]所述菌体干重测定:准确取30mL发酵液5000rpm离心20min,去除上清,菌体蒸懼水洗涤离心2-3次，然后进行抽滤，80°C烘箱烘干称重，此质量乘以1000除以30即粗干重，以g/L记。
[0015]所述普鲁兰多糖粗糖测定:准确取30mL发酵液15000rpm离心20min去除菌体,上清液用两倍无水乙醇醇沉，所得沉淀烘干称重，此质量乘以1000除以30即粗产量，以g/L记。
[0016]有益效果
[0017]本发明提供了一种生产普鲁兰多糖的方法，操作简单，不仅解决了普鲁兰高粘度发酵过程中对底物利用率低的问题，而且增加了普鲁兰多糖的产量，提高了普鲁兰多糖的生产强度，而且在一定程度上降低了色素的产生，为后续提取减少了麻烦，进一步降低了普鲁兰多糖的成本。
【具体实施方式】
[0018]实施例1
[0019](I)将CGMCC N0.7055菌株接于种子培养基进行摇瓶活化，转速为150rpm，温度为28°C，培养时间为35小时。
[0020](2)活化后的种子培养液以2-5% (v/v)的量接于新的种子摇瓶中进行扩大培养，转速为150rpm，温度为28°C，培养时间为20小时。
[0021](3)将所得种子液以2-5% (v/v)的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体生长情况即OD62tl值对pH和溶氧进行调控:当菌体OD62tl < 0.7(种子干重小于12g/L)时，溶氧降至60%左右时，将溶氧与搅拌串联，使溶氧维持在50%，同时利用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠调控PH使其稳定在2.8之间使菌体大量产生；当菌体OD62tl ^ 0.7(种子干重不小于12g/L)时，将溶氧设定为25%，同时利用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠调控pH使其稳定在4.8之间使菌体大量合成普鲁兰多糖；温度28°C，转速300rpm，发酵时间72小时。
[0022] 种子培养基组成为:蔗糖100g/L、酵母浸粉3g/L、氯化钠2.5g/L、硫酸铵lg/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP041g/L、FeS04.7H200.05g/L，其余为水，ρΗ7.0。
[0023]发酵培养基成分:蔗糖150g/L、尿素 2g/L、氯化钠 2.5g/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP042g/L、FeS04.7H200.05g/L,其余为水，初始 pH6.0。
[0024]发酵完成后，菌体粗干重为16.53g/L，粗多糖产量为:78.8g/L。与未进行调控(pH自然，通风比1:1，转速300rpm)的对照试验相比产量提高了 57.6% ;离心之后上清在654nm下OD值为0.132，与未进行调控相比(0D值为0.25)，色素降低了 47.2%。
[0025]注:饱和硫酸钠溶氧为零；转速500rpm，通风量为7L/min时溶氧为100%。
[0026]实施例2
[0027](I)将CGMCC.N0.7055菌株接于种子培养基进行摇瓶活化，转速为200rpm，温度为28°C，培养时间为32小时。
[0028](2)活化后的种子培养液以2-5% (v/v)的量接于新的种子摇瓶中进行扩大培养，转速为200rpm，温度为28°C，培养时间为18小时。
[0029](3)将所得种子液以2-5% (v/v)的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体生长情况即OD62tl值对pH和溶氧进行调控:当菌体OD62tl < 0.7(种子干重小于12g/L)时，溶氧降至60%左右时，将溶氧与搅拌串联，使溶氧维持在55%，同时利用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠调控PH使其稳定在3.0使菌体大量产生；当菌体OD62tl ^ 0.7 (种子干重不小于12g/L)时，将溶氧设定为28%，同时利用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠调控pH使其稳定在5.0之间使菌体大量合成普鲁兰多糖；温度28°C，转速300rpm，发酵时间88小时。
[0030]种子培养基组成为:蔗糖100g/L、酵母浸粉3g/L、氯化钠2.5g/L、硫酸铵lg/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP041g/L、 FeS04.7H200.05g/L，其余为水，ρΗ7.0。
[0031]发酵培养基成分:蔗糖150g/L、尿素 2g/L、氯化钠 2.5g/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP042g/L、FeS04.7H200.05g/L,其余为水，初始 pH6.0。
[0032]发酵完成后，菌体粗干重为16.63g/L，粗多糖产量为:80.67g/L。与未进行调控(pH自然，通风比1:1，转速300rpm)的对照试验相比产量提高了 61.34% ;离心之后上清在654nm下OD值为0.112，与未进行调控相比(0D值为0.25)，色素降低了 55.2%。
[0033]实施例3
[0034](I)将CGMCC.N0.7055菌株接于种子培养基进行摇瓶活化，转速为250rpm，温度为28°C，培养时间为30小时。
[0035](2)活化后的种子培养液以2-5% (v/v)的量接于新的种子摇瓶中进行扩大培养，转速为250rpm，温度为28°C，培养时间为16小时。
[0036](3)将所得种子液以2-5% (v/v)的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体生长情况即OD62tl值对pH和溶氧进行调控:当菌体OD62tl < 0.7(种子干重小于12g/L)时，溶氧降至60%左右时，将溶氧与搅拌串联，将溶氧设定为60%，同时利用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠调控pH使其稳定在3.2使菌体大量产生；当菌体OD62tl ^ 0.7 (种子干重不小于12g/L)时，使溶氧维持在30%之间，同时利用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠调控PH使其稳定在5.2之间使菌体大量合成普鲁兰多糖；温度28°C，转速300rpm，发酵时间96小时。
[0037]种子培养基组成为:蔗糖100g/L、酵母浸粉3g/L、氯化钠2.5g/L、硫酸铵lg/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP041g/L、FeS04.7H200.05g/L，其余为水，ρΗ7.0。
[0038]发酵培养基成分:蔗糖150g/L、尿素 2g/L、氯化钠 2.5g/L、MgS04.7H200.4g/L、K2HP042g/L、FeS04.7H200.05g/L,其余为水，初始 pH6.0。
[0039]发酵完成后，菌体粗干重为18.70g/L，粗多糖产量为:76.2g/L。与未进行调控(pH自然，通风比1:1，转速300rpm)的对照试验相比产量提高了 52.4% ;离心之后上清在654nm下OD值为0.129，与未进行调控相比(0D值 为0.25)，色素降低了 48.4%。
【权利要求】
1.一种高密度发酵生产普鲁兰多糖的方法，具体步骤如下: (1)将菌株接于种子培养基进行摇瓶活化，转速为150-250rpm，温度为28°C，培养时间为30-35小时; (2)活化后的种子培养液以2-5%(v/v)的量接于新的种子摇瓶中进行扩大培养，转速为150-250rpm，温度为28°C，培养时间为16-20小时; (3)将步骤(2)所得种子液以2-5%(v/v)的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体生长情况即OD62tl值对pH和溶氧进行调控:当菌体OD62tl < 0.7 (种子干重小于12g/L)时，溶氧降至60%左右时，将溶氧与搅拌串联，使溶氧维持在50%-60%之间，同时利用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠调控pH使其稳定在2.8-3.2之间使菌体大量产生；当菌体OD620 ^ 0.7 (种子干重不小于12g/L)时，将溶氧设定在25%-30%之间，同时利用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠调控pH使其稳定在4.8-5.2之间使菌体大量合成普鲁兰多糖；温度28°C，发酵时间72-96小时。
2.如权利要求1所述的一种高密度发酵生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于:所述菌种为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) BCSWGHPL101,保藏编号 CGMCC N0.7055。
【文档编号】C12P19/10GK103740785SQ201310754978
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月28日 优先权日:2013年12月28日
【发明者】乔长晟, 宋亚琼, 郝华旋, 马正旺 申请人:天津北洋百川生物技术有限公司