一种spf小鼠病原菌核酸荧光定量pcr联合快速检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒及检测方法。目的是提供的检测试剂盒应可同时对四种常见SPF动物携带病原进行检测；提供的方法具有操作简单、检测快速的特点。技术方案是：一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR预混体系以及ddH2O，该试剂盒还包括针对4种病原菌的4对特异性引物；特异性引物如下：金黄色葡萄球菌；肺炎克雷伯菌；沙门氏菌；绿脓杆菌。一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测方法，按以下步骤进行：（1）提取样品DNA；（2）以样品DNA为模板，进行联合PCR检测；（3）反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测。
【专利说明】—种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种SPF小鼠病原菌荧光定量联合快速检测试剂盒，可应用于SPF小鼠病原菌携带的实验室快速检测鉴定。
【背景技术】
[0002]实验动物是生命科学研究的基础和重要支撑条件，也是药品生产检测和新药研究的基础。实验动物按其微生物、寄生虫控制程度，可划分为四个等级，即普通动物、清洁动物、无特定病原体动物(SPF动物)和无菌动物。SPF动物是国际上公认的标准级别的实验动物，适用于所有科研实验。实验动物是否达到了 SPF级别，其重要的评价手段就是微生物和寄生虫质量控制，必须建立一套完整的微生物和寄生虫检测体系，来确保实验动物不携带有应排除的病原体 。
[0003]研究发现，目前我国商品化SPF小鼠的细菌污染主要包括肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和绿脓杆菌。通过采用生物信息学分析手段分析上述病原菌的特异性基因靶点，基于特异性保守基因片段建立病原菌核酸荧光定量联合快速检测方法，可以为SPF小鼠的相关病原菌携带情况调查提供分子生物学检测手段。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒；该检测试剂盒应可同时对四种常见SPF动物携带病原进行检测，并具有检测结果准确、使用方便的特点。
[0005]本发明的另一目的是提供一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测方法，该方法具有操作简单、检测快速的特点。
[0006]本发明采用的技术方案是:
[0007]一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR预混体系以及ddH20 (重蒸水);其特征在于该试剂盒还包括针对4种病原菌的4对特异性引物；所述特异性引物序列如下:
[0008]金黄色葡萄球菌:
【权利要求】
1.一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR预混体系以及ddH20 ;其特征在于该试剂盒还包括针对4种病原菌的4对特异性引物；所述特异性引物序列如下: 金黄色葡萄球菌:
2.根据权利要求1所述的一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒，其特征在于:所述荧光定量PCR预混体系的浓度为2X。
3.—种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测方法，按以下步骤进行: (1)提取待测样品DNA; (2)以待测样品DNA为模板，4对特异性引物与荧光定量PCR预混体系以及ddH20混合后分别配制成4个反应体系进行联合PCR检测； (3)反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测；选择荧光检测模式为SYBR荧光，基线调整取3~15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；PCR反应荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，同时，扩增产物的融解曲线显示为单峰的特异性检测体系判断为阳性，即待测样品含有相应的病原细菌；若无典型的扩增曲线，判断为阴性。
4.根据权利要求3所述的一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测方法，其特征在于所述步骤(2)中PCR反应体系中各成分的终浓度如下:荧光定量PCR预混体系使用浓度为IX 各特异性引物的上游与下游引物的浓度为IOpmol/μ 1，使用量I μ I/反应 DNA模板使用量5 μ I/反应 ddH20用于补足反应体系至50 μ I。
5.根据权利要求3或4所述的一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测方法，其特征在于所述步骤(3)中的PCR反应条件如下:95°C IOmin进行解链；95°C 15s，60°C Imin后进行荧光检测，共进行40个循环，溶解曲线分析条件为:95°C 15s,60°C lmin,95°C 15s后进行荧光检测，60°C 15s。
【文档编号】C12Q1/04GK103740822SQ201310754981
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】蒋锦琴, 张磊, 银国利, 徐小寅, 吴锦芳, 冯春燕 申请人:浙江医学高等专科学校