一种人角质干细胞体外诱导分化为人毛囊细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及一种人角质干细胞体外诱导分化制备人毛囊细胞的方法。其技术方案：将人角质干细胞移入装有成分确定的角质形成细胞-SFM初始培养液培养皿中进行贴壁培养，得到初始诱导的人角质干细胞，再制备成细胞膜片备用；取小鼠胚胎期13.5天的小鼠头部的下颚，去除下颚第一磨牙的上皮组织，取出牙间充质干细胞组织，吹打成单细胞悬液，离心后重聚成第一磨牙间充质干细胞团。将人角质干细胞膜片与牙间充质干细胞团重聚再植入小鼠肾包膜下继续诱导分化，得到具有毛囊细胞的组织块。本发明可成功将人角质干细胞诱导分化成人毛囊细胞，整体技术和方法既合理高效，又简便实用，人工诱导分化的人毛囊细胞可望通过移植到皮肤，长出毛发。
【专利说明】一种人角质干细胞体外诱导分化为人毛囊细胞的方法
【技术领域】[0001]本发明属生物【技术领域】，涉及一种诱导分化细胞的方法。具体涉及一种人角质干细胞体外诱导分化为人毛囊细胞的方法。
【背景技术】
[0002]角质干细胞来源于表皮基底层膜，是一种具有增殖和多向分化的潜能，能分化形成表皮各层组织，如生发层、颗粒层、透明层、角质层等。其常处于静息状态，具有非成熟细胞的形态学特征和很强的自我更新能力。
[0003]毛囊与牙齿等器官的发育在最初期都具有相同的发育模式，即上皮组织受到间充质组织的诱导后，上皮细胞不断增殖，同时上皮向内凹陷形成芽蕾状结构。在一定的条件下，角质干细胞具有增殖和多向分化的潜能，能分化形成表皮各层组织，而后表皮在间充质组织的诱导作用下向内凹陷形成毛芽，进一步诱导分化形成毛囊细胞。
[0004]目前角质干细胞目前已大量应用于组织工程皮肤的构建。角质干细胞诱导分化成为毛囊细胞成功的报道很少。本发明人角干质细胞体外诱导分化为人毛囊细胞的的整体技术和方法既合理高效，又简便实用，有较高的诱导分化的转化率。未来人工诱导分化的人毛囊细胞可以通过移植到皮肤，长出毛发，这项技术有望应用于治疗秃头症。
【发明内容】
[0005]本发明目的是以人角质干细胞为材料，经复合生长因子和小鼠下颚磨牙间充质干细胞联合诱导分化为人毛囊细胞。人工诱导分化的人毛囊细胞可望通过移植到人的头皮皮肤，长出毛发。
[0006]为实现本发明的目的采用的技术方案包括下述步骤:
1.将人角质干细胞进行复苏后，移入预先装有成分确定的角质形成细胞-SFM初始培养液的培养皿中；将培养皿放置在37°C、5%浓度的CO2气体培养箱进行贴壁培养；当人角质干细胞贴壁生长占据培养皿底面积的50~60%时，按照复合生长因子:成分确定的角质形成细胞-SFM初始培养液=1: 1000的体积比配制诱导培养液，把培养皿原有的成分确定的角质形成细胞-SFM初始培养液替换为诱导培养液，进行初始诱导，诱导时间24小时，得到初始诱导的人角质干细胞，再制备成细胞膜片备用。
[0007]所述的复合生长因子，按其重量份组成为:每I ml复合生长因子中含有人成纤维细胞生长因子8 (FGF8)30~50 mg、人成纤维细胞生长因子10 (FGFlO)50~lOOmg、人骨形成蛋白4 (BMP4) 30~50mg、人刺猬蛋白(SHH) 50~lOOmg。
[0008]2.小鼠下颚第一磨牙间充质干细胞团制备:切取小鼠胚胎期13.5天的小鼠头部的下颚，在2.0 U/ml的中性蛋白酶中消化30分钟。此时下颚第一磨牙的牙上皮与间充质不再紧密相连，于体式显微镜下去除下颚第一磨牙的上皮组织，取出下颚第一磨牙间充质干细胞组织，下颚第一磨牙间充质干细胞组织在高糖Dulbecco改良Eagle培养基(Deulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)中吹打成单细胞悬液，用细胞计数板取I~2X IO6个细胞，200 X g离心5分钟，重聚成第一磨牙间充质干细胞团。
[0009]3.将备用的初始诱导的人角质干细胞膜片，与分离好的小鼠头部的下颚第一磨牙间充质干细胞团体外重聚成嵌合细胞块，再将嵌合细胞块植入Balb/c免疫缺陷小鼠肾包膜下继续进行为期14天的诱导分化，得到含有毛囊细胞的毛囊细胞组织块。
[0010]将上述得到的具有毛囊细胞的组织块取出，经过常规的固定，脱水，透明，透蜡、包埋、切片后，进行苏木精/伊红染色，置于100倍显微镜视野下观察，可见具有毛囊细胞形态结构的毛囊细胞。
[0011]将上述得到的具有毛囊细胞的组织块进行免疫组化染色检测小鼠主组织相容性复合蛋白和人角蛋白14的表达，证明毛囊细胞形态结构的毛囊细胞由人角质干细胞分化而来。
[0012]所述的人角质干细胞购自美国标准生物品收藏中心(ATCC? PCS-200-010?)。成分确定的角质形成细胞-SFM培养液购自生命技术公司(Life technologies)。
[0013]所述的人成纤维细胞生长因子8 (FGF8)、人成纤维细胞生长因子10 (FGF10)、人骨形成蛋白4 (BMP4)和人刺猬蛋白(SHH)购自于R&D系统公司(R&D Systems)。
[0014]所述的高糖Dulbecco改良Eagle培养基购自生命技术公司(Lifetechnologies)。
[0015]参照本发明的技术方案进行验证试验，其过程是仅添加复合生长因子进行初始诱导或仅与小鼠头部的下颚第一磨牙间充质干细胞团体外重聚，所得到的细胞或嵌合细胞块移植Balb/c免疫缺陷小鼠肾包膜下14天后取出，采用常规的固定，脱水，透明，透蜡、包埋、切片后，进行苏木精/伊红染色，置于100倍显微镜视野下观察，都未见具有毛囊细胞形态结构的毛囊细胞，表明仅添加复合生长因子进行初始诱导或仅与小鼠头部的下颚第一磨牙间充质干细胞团体外重聚，移植Balb/c免疫缺陷小鼠肾包膜下14天后取出，人角质干细胞都不能形成毛囊细胞形态结构。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是本发明实施例1中人角质干细胞经过体外诱导分化后形成的毛囊细胞形态结构图。
[0017]图2是本发明实施例1中人角质干细胞经过体外诱导分化后检测到的小鼠主组织相容性复合蛋白的表达图。
[0018]图3是本发明实施例1中人角质干细胞经过体外诱导分化后检测到的人角蛋白14的表达图。
[0019]图4是本发明实施例1中人角质干细胞仅进行初始诱导，移植Balb/c免疫缺陷小鼠肾包膜下14天后的细胞形态结构图。
[0020]图5是本发明实施例2中人角质干细胞经过体外诱导分化后形成的毛囊细胞形态结构或组织块中小鼠主组织相容性复合蛋白和人角蛋白14的表达情况图。
[0021]图6是本发明实施例2中人角质干细胞只与小鼠下颚第一磨牙间充质干细胞团体外重聚，移植Balb/c免疫缺陷小鼠肾包膜下14天后的细胞形态结构图。·【具体实施方式】[0022]为了更为清楚地了解本发明的技术方案，现结合附图做进一步的说明。
[0023]图1中，白色箭头所示的为毛囊细胞，毛囊细胞紧密包裹在空洞性蜂窝状的毛髓质周围，与其共同形成明显可见的毛囊形态结构。
[0024]图2中，本发明采用了免疫组织化学技术检测了具有毛囊细胞的组织块中小鼠主组织相容性复合蛋白的表达情况，结果显示非毛囊细胞(小鼠组织来源)呈现棕色，毛囊细胞(人组织来源)未呈现棕色，证明所诱导形成的毛囊细胞来源于人组织，是由人角质干细胞分化而来。
[0025]图3中，本发明采用免疫组织化学技术检测了具有毛囊细胞的组织块中人角蛋白14的表达情况。结果显示毛囊细胞呈现棕色，证明所诱导形成的毛囊细胞来源于人组织，是由人角质干细胞分化而来。
[0026]图4中，本发明验证试验了仅进行初始诱导但并未与小鼠下颚第一磨牙间充质干细胞团体外重聚的人角质干细胞移植Balb/c免疫缺陷小鼠肾包膜下14天后无毛囊细胞特征，表明未能被诱导分化成毛囊细胞。
[0027] 图5中，A图是在100倍显微镜下拍摄的人角质干细胞经过体外诱导分化后形成的毛囊细胞形态结构图是免疫组织化学技术检测了具有毛囊细胞的组织块中小鼠主组织相容性复合蛋白的表达情况，C图是免疫组织化学技术检测了具有毛囊细胞的组织块中人角蛋白14的表达情况。
[0028]图6中，本发明验证试验了人角质干细胞未经过初始诱导，仅与小鼠下颚第一磨牙间充质干细胞团体外重聚，移植Balb/c免疫缺陷小鼠肾包膜下14天后无毛囊细胞特征，表明未能被诱导分化成毛囊细胞。
[0029]实施例1
1.人角质干细胞体外培养与初始诱导:将人角质干细胞进行复苏后，取人角质干细胞置于预先装有成分确定的角质形成细胞-SFM初始培养液的培养皿中，将培养皿放置在37°C、5%浓度的CO2气体培养箱进行贴壁培养；当人角质干细胞贴壁生长占据培养皿底面积50%时，按照复合生长因子:成分确定的角质形成细胞-SFM培养液=1: 1000的体积t匕，配制诱导培养液；把培养皿原有的成分确定的角质形成细胞-SFM初始培养液替换为诱导培养液，诱导24小时后，得到初始诱导的人角质干细胞，再制备成细胞膜片备用。
[0030]复合生长因子其组成为:每I ml复合生长因子中含有人成纤维细胞生长因子8(FGF8)为50mg、人成纤维细胞生长因子10 (FGFlO) lOOmg、人骨形成蛋白4 (BMP4) 50mg、人刺猬蛋白(SHH) IOOmgo
[0031]2.小鼠下颚第一磨牙间充质干细胞团制备:取小鼠胚胎期13.5天的小鼠头部的下颚，在2.0 U/ml的中性蛋白酶中消化30分钟。此时第一磨牙的牙上皮与间充质不再紧密相连，于体式显微镜下去除下颚第一磨牙的上皮组织，取出牙间充质干细胞组织，间充质干细胞组织在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基(Deulbecco，s Modified Eagle Medium,DMEM)中吹打成单细胞悬液，用细胞计数板取IX IO6个细胞，200 Xg离心5分钟，重聚成第一磨牙间充质干细胞团。
[0032]3.将备用的初始诱导的人角质干细胞膜片，与分离好的小鼠头部的下颚第一磨牙间充质干细胞团体外重聚成嵌合细胞块，再将嵌合细胞块植入Balb/c免疫缺陷小鼠肾包膜下继续进行为期14天的诱导分化，得到具有毛囊细胞的组织块。[0033]4.毛囊细胞的检测
I)将嵌合细胞块植入Balb/c免疫缺陷小鼠肾包膜下诱导分化14天后取出，得到具有毛囊细胞的组织块，经过常规的固定，脱水，透明，透蜡、包埋、切片后，进行苏木精/伊红染色。结果如图1所示,在图1中可见毛囊细胞形态结构的毛囊细胞。
[0034]2)进行免疫组化染色检测在具有毛囊细胞的组织块中小鼠主组织相容性复合蛋白(Major Histocompatibility Complex,MHC)的表达情况,非毛囊细胞(小鼠组织来源)呈现棕色，毛囊细胞(人组织来源)未呈现棕色，证明所形成的毛囊细胞来源于人组织，是由人角质干细胞分化而来。结果如图2所示，在图2中可见非毛囊细胞呈现出棕色，而毛囊细胞不显棕色，说明毛囊细胞中不会表达小鼠主组织相容性复合蛋白，排除其是小鼠细胞分化而来的可能性。
[0035]进行免疫组化染色检测在具有毛囊细胞的组织块中人角蛋白14的表达。结果如图3所示，在图3中可见毛囊细胞呈现棕色，证明诱导而来的毛囊细胞能表达人角蛋白14，是人源性的细胞。
[0036]参照本实施例的技术方案进行对比试验，其过程如下:
1.人角质干细胞体外培养与初始诱导:将人角质干细胞进行复苏后，取人角质干细胞置于预先装有成分确定的角质形成细胞-SFM初始培养液的培养皿中，将培养皿放置在37°C、5%浓度的CO2气体培养箱进行贴壁培养；当人角质干细胞贴壁生长占据培养皿底面积的50~60%时，按照复合生长因子:成分确定的角质形成细胞-SFM初始培养液=1:1000的体积比配制诱导培养液，把培养皿原有的成分确定的角质形成细胞-SFM初始培养液替换为诱导培养液，进行初始诱导，诱导时间24小时，得到初始诱导的人角质干细胞，再制备成细胞膜片。将制备得到的细胞膜片移植Balb/c免疫缺陷小鼠肾包膜下14天后取出；经过常规的固定，脱水，透明，透蜡、包埋、切片后，进行苏木精/伊红染色，未见毛囊细胞特征，表明上述过程未能诱导分化出毛囊细胞，结果如图4所示。
[0037]实施例2
1.人角质干细胞体外培养与初始诱导:将人角质干细胞进行复苏后，取人角质干细胞置于预先装有成分确定的角质形成细胞-SFM初始培养液的培养皿中，将培养皿放置在37°C、5%浓度的CO2气体培养箱进行贴壁培养；当人角质干细胞贴壁生长占据培养皿底面积50%时，按照复合生长因子:成分确定的角质形成细胞-SFM培养液=1: 1000的体积t匕，配制诱导培养液；把培养皿原有的成分确定的角质形成细胞-SFM初始培养液替换为诱导培养液，诱导24小时后，得到初始诱导的人角质干细胞，再制备成细胞膜片备用。
[0038]复合生长因子其组成为:每I ml复合生长因子中含有人成纤维细胞生长因子8(FGF8)为30mg、人成纤维细胞生长因子10 (FGFlO) 50mg、人骨形成蛋白4 (BMP4)30mg、人刺猬蛋白(SHH) 50mg。 [0039]2.小鼠下颚第一磨牙间充质干细胞团制备:取小鼠胚胎期13.5天的小鼠头部的下颚，在2.0 U/ml的中性蛋白酶中消化30分钟。此时第一磨牙的牙上皮与间充质不再紧密相连，于体式显微镜下去除下颚第一磨牙的上皮组织，取出牙间充质干细胞组织，间充质干细胞组织在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基(Deulbecco，s Modified Eagle Medium,DMEM)中吹打成单细胞悬液，用细胞计数板取2 X IO6个细胞，200 Xg离心5分钟，重聚成第一磨牙间充质干细胞团。[0040]3.将备用的初始诱导的人角质干细胞膜片，与分离好的小鼠头部的下颚第一磨牙间充质干细胞团体外重聚成嵌合细胞块，再将嵌合细胞块植入Balb/c免疫缺陷小鼠肾包膜下继续进行为期14天的诱导分化，得到具有毛囊细胞的组织块。
[0041]4.毛囊细胞的检测
I)将嵌合细胞块植入Balb/c免疫缺陷小鼠肾包膜下诱导分化14天后取出，得到具有毛囊细胞的组织块，经过常规的固定，脱水，透明，透蜡、包埋、切片后，进行苏木精/伊红染色。结果如图5中的A所示，图中可见毛囊细胞形态结构的毛囊细胞。
[0042]2)进行免疫组化染色检测在具有毛囊细胞的组织块中小鼠主组织相容性复合蛋白(Major Histocompatibility Complex,MHC)的表达情况,非毛囊细胞(小鼠组织来源)呈现棕色，毛囊细胞(人组织来源)未呈现棕色，证明所形成的毛囊细胞来源于人组织，是由人角质干细胞分化而来。结果如图5中的B所示，图中可见非毛囊细胞呈现出棕色，而毛囊细胞不显棕色，说明毛囊细胞中不会表达小鼠主组织相容性复合蛋白，排除其是小鼠细胞分化而来的可能性。
[0043]进行免疫组化染色检测在具有毛囊细胞的组织块中人角蛋白14的表达。结果如图5中的C所示，图中可见毛囊细胞呈现棕色，证明诱导而来的毛囊细胞能表达人角蛋白14，是人源性的细胞。
[0044]参照本实施例的技术方案进行对比试验，其过程如下:
1.人角质干细胞体外培养与初始诱导:将人角质干细胞进行复苏后，取人角质干细胞置于预先装有成分确定的角质形成细胞-SFM初始培养液的培养皿中，将培养皿放置在37°C、5%浓度的CO2气体培养箱进行贴壁培养；当人角质干细胞贴壁生长占据培养皿底面积的50~60%时，继续培养24小时，再制备成细胞膜片。将制备得到的细胞膜片与分离好的小鼠头部的下颚第一磨牙间充质干细胞团体外重聚成嵌合细胞块，再将嵌合细胞块植入Balb/c免疫缺陷小鼠肾包膜下14天后取出；经过常规的固定，脱水，透明，透蜡、包埋、切片后，进行苏木精/伊红染色，·未见毛囊细胞特征，表明上述过程未能诱导分化出毛囊细胞，结果如图6所不。
【权利要求】
1.一种人角质干细胞体外诱导分化为人毛囊细胞的方法，其特征在于: 1)将人角质干细胞进行复苏后，移入预先装有成分确定的角质形成细胞-SFM初始培养液的培养皿中；将培养皿放置在CO2气体培养箱进行贴壁培养；当人角质干细胞贴壁生长占据培养皿底面积的50~60%时，将初始培养液替换为诱导培养液，进行初始诱导，得到初始诱导的人角质干细胞，再制备成细胞膜片备用； 2)切取小鼠胚胎期13.5天的小鼠头部的下颚，在2.0 U/ml的中性蛋白酶中消化30分钟，于体式显微镜下去除下颚第一磨牙的上皮组织，取出下颚第一磨牙间充质干细胞组织；将下颚第一磨牙间充质干细胞组织在高糖Dulbecco改良Eagle培养基中吹打成单细胞悬液，用细胞计数板取I~2 X IO6个细胞，200 X g离心5分钟，重聚成第一磨牙间充质干细胞团； 3)将备用的初始诱导的人角质干细胞膜片，与分离好的小鼠头部的下颚第一磨牙间充质干细胞团体外重聚成嵌合细胞块，再将嵌合细胞块植入Balb/c免疫缺陷小鼠肾包膜下继续进行诱导分化，得到含有毛囊细胞的毛囊细胞组织块。
2.根据权利要求1所述的一种人角质干细胞体外诱导分化为人毛囊细胞的方法，其特征在于所述的诱导培养液是按照复合生长因子:成分确定的角质形成细胞-SFM培养液=1: 1000的体积比进行配制的。
3.根据权利要求2所述的一种人角质干细胞体外诱导分化为人毛囊细胞的方法，其特征在于所述的复合生长因子，按其重量份组成为:每I ml复合生长因子中含有人成纤维细胞生长因子8为30~50 mg、人成纤维细胞生长因子10为50~lOOmg、人骨形成蛋白4为30~50mg、人刺猬蛋白为50~IOOmg0`
4.根据权利要求1所述的一种人角质干细胞体外诱导分化为人毛囊细胞的方法，其特征在于所述的初始诱导，诱导时间24小时。
5.根据权利要求1所述的一种人角质干细胞体外诱导分化为人毛囊细胞的方法，其特征在于所述的诱导分化，诱导分化时间14天。
【文档编号】C12N5/074GK103667180SQ201310754832
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】黄镇, 张彦定, 陈素珠, 林鑫 申请人:福建师范大学