β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备白藜芦醇中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种β-葡萄糖苷酶高产菌，系以虎杖为碳源从自然界中筛选的，其保藏编号为CCTCC?NO.M2013633，分类命名为米曲霉（Aspergillus?oryzae）HHL，该菌能高效转化白藜芦醇苷为白藜芦醇。据此，发明人建立了一种利用上述β-葡萄糖苷酶高产菌转化制备白藜芦醇的方法，一方面可在温和条件下水解白藜芦醇苷，避免了传统方法导致有效成分损失的缺陷，有效地提高了产量；另一方面利用现代微生物发酵工程技术和酶工程技术使虎杖的有效成分白藜芦醇苷在体外可控条件下实现规模转化，降低了生产成本，提高了生产效率。本发明为大量工业化生产β-葡萄糖苷酶、白藜芦醇提供了一条可行途径，具有较大的经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。
【专利说明】β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备白藜芦醇中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物生物转化【技术领域】，尤其涉及一种β -葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备白藜芦醇中的应用。
【背景技术】
[0002]白藜芦醇是中草药虎杖中的一种天然活性物质，化学名称为芪三酚(即3，5，4’一三羟基一 1，2 —二苯基乙烯)，是一种活性多酚物质，分子式为C14H12O315虎杖中白黎芦醇往往以葡萄糖苷(即虎杖苷)的形式存在，虎杖苷在肠道中糖苷酶的作用下可分解为白黎芦醇，而发挥药理作用。白黎芦醇具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗过敏、抗动脉粥样硬化和防治冠心病、缺血性心脏病、高血脂症等作用，白黎芦醇已被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一，它是继紫杉醇以后的又一绿色抗癌物质。白黎芦醇具有独特的化学和生理活性，在护肤品中可起到多重作用，例如抗氧化、抗衰老、抗紫外线、增白及保湿等，因而对多种因素造成的皮肤老化(皱纹和色素沉着)都有独到的功效。现代方法获得白黎芦醇主要有直接从植物中提取、化学合成法、复合酶酶解法和生物合成法等。目前，有人用酸碱水解法或改性纤维素酶解法对虎杖苷进行分解，但是酸碱会造成环境污染还降低产量，而改性纤维素酶法成本较高、工艺较为复杂，因此均不利于推广应用。
[0003]国内近年来葡萄糖苷酶的研究已经成为热点，已由过去研究葡萄糖苷酶的简单提取到现在的产酶条件优化以及粗酶液的纯化。虽然葡萄糖苷酶基因已成功克隆表达，新构建的工程菌也已应用到生产实践中，但仍然存在很多不足，如:工艺复杂、成本过高，从而限制了其进一步发展。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问·题是提供一种能高效转化白藜芦醇苷为白藜芦醇的β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备白藜芦醇中的应用。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:β_葡萄糖苷酶高产菌，保藏编号为 CCTCC N0.Μ2013633，分类命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)HHL。
[0006]上述β -葡萄糖苷酶高产菌在转化制备白藜芦醇中的应用。
[0007]利用上述β -葡萄糖苷酶高产菌转化制备白藜芦醇的方法，包括以下步骤:
[0008](I)种子制备:将保存的米曲霉HHL孢子接种于斜面培养基上，置于35°C恒温培养箱培养2天，获得孢子，用无菌水洗脱孢子获得孢子悬浮液，将孢子悬浮液接入摇瓶发酵培养基；斜面培养基为查氏培养基；摇瓶发酵培养基是产酶优化培养基；
[0009](2)转化制备白藜芦醇 在温度为35°C、pH7.0、装液量为100ml/250ml、接种量为1%、转速180r/min的条件下发酵120h，加入10%虎杖液，在温度为50°C、pH5.0的条件下反应5h。
[0010]孢子悬浮液浓度为1.0X IO8个/ml。
[0011]虎杖液按以下操作制备:取IOg虎杖按质量体积比1:10用蒸馏水浸泡20分钟，然后小火煮沸30分钟左右，冷却后用8层纱布过滤，依法重复煮三次；合并滤液，最后用蒸馏水定容至100ml，得虎杖煮提液。
[0012]产酶优化培养基配方为麸皮汁10%、酵母膏0.5%、硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、抗坏血酸0.1%。
[0013]发明人以虎杖为碳源从自然界中筛选到一株葡萄糖苷酶产生菌(保藏编号为CCTCC N0.Μ2013633，分类命名为米曲霉(Aspergi I Ius oryzae ) HHL)，该菌能高效转化白藜芦醇苷为白藜芦醇。据此，发明人建立了一种利用上述β_葡萄糖苷酶高产菌转化制备白藜芦醇的方法，采用产酶基础培养基，分别从碳源、氮源、接种量、底物浓度、装液量、转化温度、转化时间、转化PH等几方面进行单因素实验分析优化，确定微生物发酵产酶的最佳条件及微生物转化得到产物白藜芦醇的最佳条件，一方面可在温和条件下水解白藜芦醇苷，避免了传统方法导致有效成分损失的缺陷，有效地提高了产量；另一方面利用现代微生物发酵工程技术和酶工程技术使虎杖的有效成分白藜芦醇苷在体外可控条件下实现规模转化，降低了生产成本，提高了生产效率。应用本发明可为大量工业化生产β_葡萄糖苷酶、白藜芦醇提供一条可行途径，具有较大的经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是米曲霉HHL产酶条件优化一发酵时间对产酶的影响结果图。
[0015]图2是米曲霉HHL产酶条件优化一碳源对产酶的影响结果图。
[0016]图3是米曲霉HHL产酶条件优化一氮源对产酶的影响结果图。
[0017]图4是米曲霉HHL产酶条件优化一磷酸二氢钾浓度对产酶的影响结果图。
`[0018]图5是米曲霉HHL产酶条件优化一发酵温度对产酶的影响结果图。
[0019]图6是米曲霉HHL产酶条件优化一接种量对产酶的影响结果图。
[0020]保藏信息说明
[0021]米曲霉(Aspergillusoryzae)HHL，保藏号为CCTCC M2013633，保藏日期:2013 年12月6日，保藏地址为:湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏单位:中国典型培养物保藏中心。
【具体实施方式】
[0022]以下结合实施例及附图，对本发明作进一步详细说明。
[0023]一、菌种的筛选
[0024]土样取自广西玉林中药港垃圾场的土壤，以10%的虎杖液做酶反应底物，配以改良查氏培养基(在查氏培养基中去除蔗糖)形成初筛培养基，利用刚果红染色法染色出现的透明圈，判断是否存在产葡萄糖苷酶真菌菌株，工艺为:
[0025](I)菌种初筛:取所采的土样5g,加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，振荡5min,制成土壤悬液，梯度稀释KT1~10_7倍。选择适宜稀释倍数的菌悬液分别涂布于初筛平板培养基上，置于35°C培养箱中倒置培养,48h后观察现象。
[0026]保藏培养基:查氏琼脂斜面固体培养基。
[0027]初筛培养基组成以质量百分比计为:NaN030.3%，MgSO4.7H200.05%, FeSO40.001%,K2HPO40.1%，KC10.05%，虎杖液 10%，琼脂 2%。
[0028]虎杖液按以下操作制备:取IOg虎杖按质量体积比1:10用蒸馏水浸泡20分钟，然后小火煮沸30分钟左右，冷却后用8层纱布过滤，依法重复煮三次；合并滤液，最后用蒸馏水定容至100ml，得虎杖煮提液。
[0029]经过初筛(含有虎杖液的查氏平板)，有十株菌株在初筛平板中经过刚果红染色后有透明圈，说明这十株菌能够产生葡萄糖苷酶，将这十株菌命名为HHL、HHLU HHL2、HHL3、HHL4、HHL5、HHL6、HHL7、HHL8、HHL9。
[0030](2)菌种的复筛:初筛获得的菌种接种到产酶基础培养基中发酵，利用DNS法测定酶活(以IU计)。
[0031]产酶基础培养基:麸皮汁4%、硫酸铵0.1%、硫酸镁0.1%、醋酸钠0.1%、磷酸氢二钾
0.2%、尿素0.2%、抗坏血酸0.1%。
[0032]结果:HHL的酶活最高，达到8IU/ml。
[0033]二、菌种的鉴定及发酵条件的优化
[0034]1、菌种的鉴定 [0035](1)菌落形态观察
[0036]将HHL斜面菌点接至有查氏培养基的平皿中，于35°C培养48h，观察菌落形态。
[0037]结果:菌落生长快，直径2~3cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色孢子；背面无色。
[0038](2)菌体形态观察
[0039]在载玻片上加一滴无菌水，用接种针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以吸取脱落的孢子，再放在载玻片上的无菌水中，用接种针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜(40X)下观察，必要时换高倍镜观察。
[0040]结果:分生孢子头放射状，直径约200 μ m，分生孢子梗2mm左右；顶囊近球形，近顶囊处直径约15 μ m。
[0041](3)菌株的ITS鉴定
[0042]a.基因组DNA的提取
[0043]I)将适量孢子接种到种子培养基中，35°C、180r/min振荡培养2_3d，真空泵抽滤，每次用生理盐水冲洗，抽滤3次得到菌丝体；
[0044]2)取约Ig抽滤过的菌丝体用液氮研磨成粉末状，把粉末加入到20ml抽提缓冲液中剧烈振荡混匀，用玻璃棒搅拌，37°C水浴lh，不时颠倒混匀(约5-10min混匀一次)；
[0045]3)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)到样品中，温和颠倒混匀；然后于4°C，12000r/min离心20min，可取上清重新抽提一次；然后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),于 4°C , 12000r/min 离心 IOmin ；
[0046]4)取上层水相至另一离心管中，加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠(pH4.8)及0.6体积的冰冷异戊醇，颠倒混匀，4°C放置l_2h ；
[0047]5) 12000r/min离心10min,弃上清，干燥沉淀；
[0048]6)加入200 μ ITE缓冲液溶解，可转入L 5ml离心管，再加入终浓度为0.1 μ g/μ I 的 RNase, 37°C 反应 l_3h ；
[0049]7)取出，加入200 μ I氯仿/异戊醇(24:1)抽提I次，12000r/min离心、IOmin ；
[0050]8)将上清转至另一个1.5ml离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，_20°C放置Ih以上，可见白色DNA沉淀；[0051]9) 12000r/min离心10min,收集沉淀，然后用70%乙醇洗一次；
[0052]10)待乙醇挥发完全，用适量TE或蒸馏水溶解(约50 μ I)。
[0053]b.PCR扩增体系(20 μ L，引物采用通用弓丨物)
[0054]IOXEr Taq buffer2.0 μ L, 2.5mM Dntp Mixl.6μ L,上游弓丨物(ITS1:5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ) 0.8 μ L,下游引物(ITS4:5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ )0.8 μ L，基因组模板 0.5 μ L，Er Taq0.2 μ L, ddH2014.1 μ L。
[0055]c.PCR反应条件:
[0056]95°C 5min ；95°C 30s,55°C 30s, 72°C lmin30s，共 30cycles ；72°C IOmin ；4°C 2h。
[0057]通过将ITS序列扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，得到片段大小为600bp左右，选取最好的条带进行胶回收，将回收的DNA送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。通过Nucleotide BLAST分析，与米曲霉菌株的18S r RNA序列同源性为99%，可初步确定HHL菌株为米曲霉。
[0058]2、米曲霉HHL产酶条件优化
[0059](I)发酵时间对产酶的影响
[0060]以产酶基础培养基接种米曲霉HHL，在温度为35°C、pH自然、装液量100ml/250ml、接种量1ml，转速180r/min的条件下分别发酵72、96、108、120、132、144、168h取上清液测酶活。其中，产酶基础培养基为麸皮汁4%、硫酸铵0.1%、硫酸镁0.1%、醋酸钠0.1%、磷酸氢二钾0.2%、尿素0.2%、抗坏血酸0.1%。
`[0061](2)碳源优化
[0062]以产酶基础培养基为基础，碳源的变量为麸皮、玉米粉、可溶性淀粉、10%煮提液、麸皮+玉米粉、羧甲基纤维素钠。配制成液体培养基在恒温摇床上35°C发酵培养120h，1000Orpm离心10min，取其上清液测酶活。
[0063](3)氮源的优化
[0064]以产酶基础培养基为基础，氮源的变量为蛋白胨、黄豆粉、尿素、硫酸铵和硝酸钠，还对其中的一部分进行组合，作为产酶基础培养基的唯一的氮源进行微生物发酵培养。在恒温摇床上35°C培养120h，取出发酵液1000Orpm离心10min，取其上清液测酶活。
[0065](4)磷酸盐对产酶的影响
[0066]磷酸盐采用KH2PO4,为了测定对发酵的影响，设计一个空白对照和0.1%、0.2%、0.5%，加入产酶基础培养基进行发酵120h。取出发酵液1000Orpm离心10min，取其上清液测酶活。
[0067](5)发酵温度对产酶的影响
[0068]以产酶基础培养基接种米曲霉HHL，在pH自然、装液量100ml/250ml、接种量1ml，转速180r/min的条件分别在20、25、28、30、35、37、40°C下发酵120h，取上清液测酶活。
[0069](6)接种量对产酶的影响
[0070]在温度为35°C、pH自然、装液量100ml/250ml、转速180r/min的条件下接种量分别为0.1mU0.5ml、lml、1.5ml,2.0ml的条件下发酵120h，取上清液测酶活。
[0071]结果(见图1至图6):通过上述单因素实验优化检测确定米曲霉HHL发酵产酶的最佳条件条件为:发酵时间120h，接种量为1ml，发酵温度为35°C，最佳碳源为10%麸皮汁，最佳氮源为0.5%酵母膏，最佳磷酸盐浓度为0.1%磷酸二氢钾。[0072]三、利用米曲霉HHL转化发酵制备白藜芦醇
[0073]1、培养基的配制
[0074]斜面培养基(查氏培养基)(100ml)=NaNO30.3g, MgSO4.7Η200.05g, FeSO40.0Olg,K2HPO40.lg，KC10.05g，蔗糖 3g，琼脂 2g，121°C灭菌 20min ；
[0075]摇瓶发酵培养基:产酶优化培养基(具体为麸皮汁10%、酵母膏0.5%、硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、抗坏血酸0.1%)，pH7.0，分装到250ml的三角瓶中，121°C灭菌20min ；
[0076]2、种子制备:将保存的米曲霉HHL孢子接种于斜面培养基上，置35°C恒温培养48h，获得母斜面，选用生长正常、孢子丰富的斜面孢子加一定量的的无菌水，打散孢子后，用显微镜计数，并调节为每毫升孢子1.0X IO8个，接入摇瓶发酵培养基；
[0077]3、转化制备白藜芦醇:在温度为35°C、ρΗ7.0、装液量为100ml/250ml、接种量为1%、转速180r/min的条件下发酵120h，加入10%虎杖液，在温度为50°C、pH5.0的条件下反应5h。
[0078]其中，虎杖液按以下操作制备:取IOg虎杖按质量体积比1:10用蒸馏水浸泡20分钟，然后小火煮沸30分钟左右，冷却后用8层纱布过滤，依法重复煮三次；合并滤液，最后用蒸馏水定容至100ml，得虎杖煮提液。
[0079]按紫外分光光度法测定发酵液`中白藜芦醇的含量，经计算其转化率为90%。
【权利要求】
1.一种β-葡萄糖苷酶高产菌，其特征在于保藏编号为CCTCC Ν0.Μ2013633，分类命名为米曲霉HHL。
2.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶高产菌在转化制备白藜芦醇中的应用。
3.利用权利要求1所述β_葡萄糖苷酶高产菌转化制备白藜芦醇的方法，其特征在于包括以下步骤: (O种子制备:将保存的米曲霉HHL孢子接种于斜面培养基上，置于35°C恒温培养箱培养2天，获得孢子，用无菌水洗脱孢子获得孢子悬浮液，将孢子悬浮液接入摇瓶发酵培养基；所述斜面培养基为查氏培养基；所述摇瓶发酵培养基是产酶优化培养基； (2)转化制备白藜芦醇 ?在温度为35°C、pH7.0、装液量为100ml/250ml、接种量为1%、转速180r/min的条件下发酵120h，加入10%虎杖液，在温度为50°C、pH5.0的条件下反应5h。
4.根据权利要求3所述利用β_葡萄糖苷酶高产菌转化制备白藜芦醇的方法，其特征在于:所述孢子悬浮液浓度为1.0X IO8个/ml。
5.根据权利要求3所述利用β_葡萄糖苷酶高产菌转化制备白藜芦醇的方法，其特征在于:所述虎杖液按以下操作制备:取IOg虎杖按质量体积比1:10用蒸馏水浸泡20分钟，然后煮沸30分钟，冷却后用8层纱布过滤，依法重复煮三次；合并滤液，最后用蒸馏水定容至100ml，得虎杖煮提液。
6.根据权利要求3所述利用β_葡萄糖苷酶高产菌转化制备白藜芦醇的方法，其特征在于:所述产酶优化培养基配方为麸皮汁10%、酵母膏0.5%、硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、抗坏血酸0.1%。``
【文档编号】C12N1/14GK103865804SQ201410037538
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】苏龙, 覃荣燕, 区善芬, 许译中 申请人:玉林师范学院