一种用于沉默镰刀菌内源基因的沉默载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于沉默镰刀菌内源基因的沉默载体及其应用，所述沉默载体包括原始载体以及插入所述原始载体的正向沉默片段和反向沉默片段，所述原始载体为PFsilent-1，或潮霉素抗性基因替换为G418抗性基因的载体PFsilent-1；所述正向沉默片段插入所述原始载体中内含子上游的多克隆位点，所述反向沉默片段插入所述原始载体中内含子下游的多克隆位点。本发明还公开了所述沉默载体在沉默镰刀菌内源基因中的应用。本发明构建了能用于适用于禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌等镰刀菌基因沉默的沉默载体及高效遗传转化体系；利用本发明建立的沉默载体和转化体系，能使靶基因的表达量降低约80-90%。
【专利说明】—种用于沉默镰刀菌内源基因的沉默载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学与基因工程领域，尤其涉及一种用于沉默镰刀菌内源基因的沉默载体及其应用。
【背景技术】
[0002]RNA沉默是真核生物细胞对RNA的一种特异性的、高效的降解机制，该机制一旦被激活就能通过碱基互补的方式对胞质中同源的RNA进行降解。RNA沉默现象普遍存在于植物、动物和真菌等真核生物中，是生物体进化过程中抵抗外源遗传因子(病毒、转座子或转基因)作用的一种防御机制，用以保持生物体自身基因组的完整和稳定性。
[0003]利用RNA沉默技术防治病虫害，显示着巨大的应用潜力。最近研究发现，将病原菌或害虫基因的dsRNA沉默载体转入寄主植物中，植物中产生的双链siRNA不仅能在植物微管组织进行系统输导，而且能从植物细胞中移动到寄生植物的线虫、病菌以及取食植物的昆虫体内，对病菌和害虫产生基因沉默效应，这也称作为寄主诱导的RNA沉默(Host-1nduced RNA silencing)。利用寄主诱导的RNA沉默技术可有效地、特异性地抑制棉铃虫基因的表达，进而抑制棉铃虫的生长。该技术在害虫防治方面已显示出广阔的应用前景，国内外已经利用该技术获得对刺吸式和咀嚼式等多种害虫有防治效果的转基因作物材料。利用寄主诱导的RNA沉默技术在抗病品种培育方面也有成功先例，尤其在植物抗病毒方面，已培育出多种抗病毒的转基因作物品种。例如:抗黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus, CMV)、西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)和西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)的转基因南瓜。国际上刚刚开始利用寄主诱导的基因沉默技术创建抗真菌病害的作物材料，并已显示出巨大的应用潜力。2010年Nowara等在《Plant Cell))上报道:在大麦植株中转入针对白粉病菌效应因子AvralO或Avrkl基因的dsRNA沉默载体，大麦中产生的针对AvralO和Avrkl的siRNA能够通过白粉菌的吸器进入菌体内，进而有效抑制白粉病菌的侵染行为，提高植株对白粉病的抗性。利用RNA沉默技术在小麦上成功的沉默了条锈病菌吸器特异性表达的致病相关基因，获得的转基因小麦材料对条锈病表现抗性。近来，Tinoco`等人将⑶S基因dsRNA沉默载体转入烟草中，再用转⑶S基因的轮枝镰孢菌接种转基因烟草，结果发现:侵染烟草的轮枝镰孢菌中GUS基因的表达被完全抑制，表明寄主诱导的基因沉默对腐生性较强的镰孢菌同样有效。与常规转基因技术相比，利用RNA沉默技术仅需要在寄主植物中表达病原物基因特有的一部分序列，而不需要表达一个完整的基因，这可有效克服转基植物可能存在的安全性问题，因此，该技术在高效广谱抗真菌种质材料的创建中可发挥重要作用。
[0004]由镰刀菌引起的农作物重要病害，如禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病，尖孢镰刀菌引起的番茄枯萎病等，给农业生产带来巨大的经济损失。利用上述寄主诱导基因沉默技术获得转基因抗镰刀菌品种具有广阔的应用前景。建立寄主诱导基因沉默技术的关键是选择针对病菌的靶基因，但目前还未见镰刀菌沉默技术的报道。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种用于沉默镰刀菌内源基因的沉默载体，适用于镰刀菌的基因沉默，且沉默效果好。
[0006]一种用于沉默镰刀菌内源基因的沉默载体，包括原始载体以及插入所述原始载体的正向沉默片段和反向沉默片段，所述原始载体为pSilent-Ι或潮霉素抗性基因替换为G418抗性基因的载体pSilent-Ι ;所述正向沉默片段插入所述原始载体中内含子上游的多克隆位点，所述反向沉默片段插入所述原始载体中内含子下游的多克隆位点。
[0007]启动子的启动效率是影响基因沉默效果的关键因素，原始载体PFsilent-1中，用于启动正向沉默片段和反向沉默片段转录的启动子为来源于粗糙脉孢霉的trpC基因的启动子，本发明研究发现，该启动子能够在镰刀菌内正常启动，且启动效率高，能够高效率的启动正向沉默片段和反向沉默片段转录形成发卡结构，对Cyp51A基因、PKS12基因、Stel2基因、致死基因FGSG_06103、多基因tri6-Cyp51A_PKS12均能达到较好的沉默效果，基因的表达量最闻可降低80%以上。
[0008]沉默靶区域的选择直接影响靶基因的沉默效果，对于沉默cyp51A基因，所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0009]对于沉默PKS12基因，所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0010]对于沉默Stel2基因，所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0011]对于沉默同时沉默tri6-cyp51A-PKS12三基因，所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示。
[0012]对于沉默致死基因FGSG_06103，所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示。
[0013]选择上述的沉默靶区域，可特异性的对各自相应的靶基因进行沉默，且沉默效果好，基因的表达量最闻可降低80%以上。
[0014]本发明还提供了所述的沉默载体的构建方法，包括:
[0015](I)以靶基因的cDNA为模板，PCR扩增正向沉默片段和反向沉默片段；
[0016](2)将所述的正向沉默片段连入所述原始载体中内含子上游的多克隆位点，将所述的反向沉默片段连入所述原始载体中内含子下游的多克隆位点，构建得到所述的沉默载体。
[0017]本发明还提供了所述的沉默载体在沉默镰刀菌内源基因中的应用。
[0018]所述镰刀菌具体可以为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)或尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。
[0019]所述的应用具体包括:
[0020](I)将镰刀菌的分生孢子接种于培养液中振荡培养，获得幼殖体；
[0021](2)以所述幼殖体为原料，制备得到原生质体；
[0022](3)将沉默载体转化所述的原生质体，筛选获得沉默转化子。
[0023]步骤(1)中，所述振荡培养的温度为23~28°C，时间为12~14小时，转速为150~220rpm，优选的，所述振荡培养的温度为25°C，时间为12小时，转速为160rpm。
[0024]所述原生质体的制备方法包括:将所述的幼殖体置于蜗牛酶、纤维素酶和溶菌酶的混合酶液中进行酶解，酶解结束后过滤、离心、清洗，得到所述的原生质体。
[0025]良好的原生质体是成功转化及高转化效率的前提，而酶液是影响原生质体质量的关键，优选的，所述蜗牛酶的浓度为30g/L，纤维素酶的浓度为20g/L，溶菌酶的浓度为20g/L，混合酶液的溶剂为0.7M NaCl溶液。上述浓度的三种酶混合后，能够有效降解镰刀菌的细胞壁，制得原生质体。
[0026]酶解的温度和时间也会影响原生质体的质量，优选的，所述酶解的时间为2.5~3h，温度为28~30°C。
[0027]所述转化的方法包括:[0028](I)将所述的原生质体悬浮于STC溶液中，并滴加含40%PEG4000的STC溶液，得原生质体悬液；
[0029](2)将原生质体悬液、沉默质粒溶液和肝素钠溶液混合，冰浴20~30min后，向混合液中逐滴加入1/3混合液体积的含40%PEG4000的STC溶液，得转化液；
[0030](3)将所述的转化液混匀后静置20~30min，加入培养液进行再生培养；
[0031](4)再生培养结束后将所述的培养液与培养基混合后共培养。
[0032]采用上述PEG介导转化的方法可将沉默质粒高效率的转化到镰刀菌的原生质体中。
[0033]STC溶液可维持原生质体的渗透压，优选的，STC溶液的配方为:山梨醇14.58g/100ml, CaCl20.555g/100ml, Tris0.692g/100ml,浓 HC10.42ml/100ml, ρΗ7.0。
[0034]步骤(2)中，原生质体悬液、沉默质粒溶液和肝素钠溶液混合后，所述肝素钠在混合液中的浓度为0.1~0.3mg/ml,优选为0.2mg/ml。
[0035]步骤(3)中，所述的培养液优选为RM培养液(酵母提取物lg/L，水解酪蛋白Ig/L,蔗糖 274g/L，ρΗ7.0)。
[0036]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0037]本发明根据RNAi (RNA介导的基因沉默)原理，构建了能用于适用于禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌等镰刀菌基因沉默的沉默载体，同时也建立了镰刀菌高效遗传转化体系；利用本发明建立的沉默载体和转化体系，能使靶基因的表达量降低约80-90%，达到基因功能研究的目的。另外，该技术不仅能完成单基因沉默，且能同时完成多基因沉默，尤其能用于镰刀菌致死基因功能分析及寄主介导基因沉默技术的靶基因筛选，具有很强的理论研究及应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1.沉默载体PFsilent-Hgy图谱；
[0039]图2.沉默载体 PFsilent_G418 图谱；
[0040]图3A.cyp51A沉默载体构建示意图；
[0041]图3B.cyp5 IA沉默转化子的表型检测；其中，cyp51A_S7为该沉默转化子在含戊唑醇药剂平板上的生长表型，HN9-1为野生型禾谷镰刀菌菌株，为阳性对照；cyp51A菌株为该cyp51A基因插入突变体，为阴性对照。[0042]图3C.RT-PCR检测转化子cyp51A_S7中cyp51A基因的mRNA的相对表达量，野生型HN9-1的表达量设置为I。
[0043]图4A.pksl2沉默载体构建示意图；
[0044]图4B.为pks 12沉默转化子的表型检测；其中，PKS-Sl为该沉默转化子在PDA平板上的生长表型，HN9-1为野生型禾谷镰刀菌菌株，为阳性对照。
[0045]图4C.RT-PCR检测转化子PKS-Sl中该pksl2基因的mRNA的相对表达量，野生型HN9-1的表达量设置为I。
[0046]图5A.F0Stel2沉默载体构建示意图；
[0047]图5B.F0Stel2沉默转化子的致病力检测；其中，F0Stel2_S12为该沉默转化子在番爺果实上的致病能力，WT为野生型菌株F.0xysporum4287,为阳性对照。
[0048]图5C.RT-PCR检测转化子F0Stel2_S12中该F0Stel2基因的mRNA的相对表达量，野生型F.0xysporum4287的表达量设置为I。
[0049]图6A.tri6-cyp51A-PKS12三个基因同时沉默载体构建示意图。
[0050]图6B.三个基因同时沉默转化子CPT-S2在含戊唑醇药剂平板上的生长表型、色素
形成及DON毒素含量。
[0051]图6C.三个基因同时沉默转化子CPT-S2的DON毒素含量；
[0052]图6D.RT-PCR检测转化子CPT-S2中三个靶标基因的mRNA的相对表达量，野生型HN9-1的表达量设置为I。
`[0053]图7A.FGSG_06103基因沉默载体构建示意图。
[0054]图7B.FGSG_06103基因沉默转化子FGSG_06103_S4在PDA上生长表型。
【具体实施方式】
[0055]下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。
[0056]实施例1镰刀菌的基因沉默技术体系的建立
[0057]本发明的目的是针对目前没有适合镰刀菌的基因沉默方法，提供一种适用于禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌等镰刀菌的基因沉默技术体系，涉及适用于镰刀菌的沉默载体，含靶基因沉默载体构建方法及镰刀菌遗传转化方法。具体
【发明内容】
如下:
[0058]1.适用于镰刀菌基因沉默的载体PFsilent-Hyg和PFsilent_G418
[0059]沉默载体PSilent-1系赠送，即以下参考文献中提及的pSilent-Ι载体:GenBank:AB303070.2, “Gene silencing vector pSilent-lDNA, complete sequence”，http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/217272796。
[0060]适用于镰刀菌的沉默载体PFsilent-Hyg (即沉默载体pSilent-1)的图谱见图1,PFsilent-Hyg质粒主要包括:Amp,氨节霉素编码区(129_989bp),主要用于载体构建过程中，质粒在大肠杆菌中的筛选标记；PtrpC (2226-2592bp)，来源于粗糙脉孢霉的trpC基因的启动子，用于启动潮霉素编码区；HygromyCin(2593-3618bp)，潮霉素抗性，用于在含潮霉素的平板上筛选沉默转化子；TtrpC(3638-4123bp)，来源于粗糙脉孢霉的trpC基因的终止子，用于潮霉素基因翻译的终止；PtrpC (4162-5447bp)来源于粗糙脉孢霉的trpC基因的启动子，用于启动加入的沉默片段正向转录；MCS (5451-5476bp)，多克隆位点，通过酶切的靶基因序列正向插入在该位点处；Intron(5491-5624bp)，来源于稻瘟病菌角质酶基因的内含子，便于形成发卡结构；MCS (5451-5476bp)，多克隆位点，通过酶切的能形成靶基因沉默 序列反义链的DNA序列插入在该位点处；TtrpC (5675_6404bp),来源于粗糙脉孢霉的trpC 基因的终止子，用于形成发卡结构的mRNA转录的终止。
[0061]对载体pSilent-1进行改造，将pSilent_l载体的筛选标记潮霉素基因通过SacI 和Spel双酶切后，回收后连接上同样黏性末端的G418抗性基因(序列如SEQ ID NO. 49)，构 建得到沉默载体PFsilent-G418。
[0062]适用于镰刀菌的沉默载体PFsilent-G418的图谱见图2，可以用于在已含潮霉素 抗性的镰刀菌菌株中进行基因沉默，与PFsilent-Hyg载体的主要区别在于G418抗性区域。 PFsilent-G418质粒主要包括：Amp，氨苄霉素编码区（129_989bp)，主要用于载体构建过程 中，质粒在大肠杆菌中的筛选标记；PtrpC (2226-2546bp),来源于粗糙脉孢霉的trpC基因 的启动子，用于启动G418抗性编码区；G418 (2547-3341bp)，G418抗性，用于在含G418抗 生素的平板上筛选沉默转化子；TtrpC(3342-3827bp)，来源于粗糙脉孢霉的trpC基因的终 止子，用于潮霉素基因翻译的终止；PtrpC(3866-5151bp)来源于粗糙脉孢霉的trpC基因的 启动子，用于启动加入的沉默片段正向转录；MCS (5155-5180bp)，多克隆位点，通过酶切的 靶基因序列正向插入在该位点处；Intron(5195-5328bp)，来源于稻瘟病菌角质酶基因的内 含子，便于形成发卡结构；MCS (5341-5377bp)，多克隆位点，通过酶切的能形成靶基因沉默 序列反义链的DNA序列插入在该位点处；TtrpC (5379_6108bp),来源于粗糙脉孢霉的trpC 基因的终止子，用于形成发卡结构的mRNA转录的终止。
[0063]2.靶基因沉默质粒的构建方法
[0064]在美国哈佛-麻省理工的博德研究所（Broad Institute)中查找到所需进行研究 的革巴基因(http://www. broadinstitute. org/annotation/genome/fusarium_group)获取 对应的编码区核酸序列（cDNA)。通过 SMART 软件（http://smart, embl-heidelberg. de/)分 析靶基因的关键结构域作为沉默区域，再结合Vcctor NTIK软件分析选择沉默区域的酶切 位点，沉默区域应选择不含有多克隆位点的酶切位点。沉默区域选择大小一般为200-400bp 较合适。确定沉默区域后，设计引物扩增靶区域，酶切位点设计在引物的5’端。PCR产物使 用TAKARA公司的限制性内切酶进行酶切，酶切产物切胶回收后进行T4连接酶获得重组质 粒。通过上述方法将正向和反向PCR产物插入至对应的多克隆位点上，获得靶基因沉默质 粒。
[0065]3.沉默质粒转化镰刀菌方法
[0066]本发明采用PEG介导法将沉默质粒转入目的镰刀菌菌株中，具体步骤如下：
[0067]1)分生孢子制备
[0068]取PDA培养基(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉10g/L)上镰刀菌菌落边缘的 菌块接种到1%绿豆汤（10g绿豆水煮20分钟后三层纱布过滤，加ddH20至1000ml，121 °C高 压灭菌20min)或CMC产孢培养液(羧甲基纤维素钠15g/L，酵母提取物lg/L，NH4N03lg/L， KH2P04lg/L，MgS04 ?7H200. 5g/L)中，25°C，180rpm，24h 光照培养 4 天后用灭菌纱布过滤，滤 液8000rpm离心lOmin,弃上清,孢子沉淀再用无菌水悬浮混勻备用。
[0069]2)幼殖体制备
[0070]将分生孢子悬浮液接种到100ml的YEH)培养液(蛋白胨10g/L，酵母提取物3g/L， 葡萄糖20g/L，pH6. 7-7. 0)中，25°C，170rpm过夜培养，用三层擦镜纸过滤幼殖体，0. 7M NaCl溶液冲洗多次，再用灭菌牙签将冲洗好的幼殖体转移到50ml玻璃三角瓶中待用。
[0071]3)原生质体制备
[0072]称取三种细胞壁裂解酶(蜗牛酶、纤维素酶和溶菌酶)(上海楷洋)各0.3g、0.2g、0.2g溶解在IOml的0.7M NaCl溶液中，用0.45 μ m的细菌滤器(Millpore)过滤酶液。将过滤好的酶液加入到装有幼殖体的50ml玻璃三角瓶中，摇匀，使得幼殖体均匀分布在酶液中，30°C，IOOrpm摇培裂解2.5_3h。3层擦镜纸过滤酶解混合液，用0.7M NaCl溶液冲洗原生质体，收集滤液，40C，5000rpm离心2min，弃上清液留原生质体沉淀，用2ml的0.7M NaCl溶液重悬浮原生质体沉淀，4°C,5000rpm,离心2min,弃上清液,再用Iml的STC (Sorbitol (山梨醇)14.58g/100ml, CaCl20.555g/100ml, Tris0.692g/100ml，浓 HC10.42ml/100ml，pH7.0)溶液重悬浮原生质体沉淀，4°C，5000rpm,离心2min，弃上清液，再用800 μ I的STC溶液重悬浮原生质体，逐滴加入200 μ I的SPTC溶液(含40%PEG4000的STC溶液)，冰上放置待用。4)原生质体转化
[0073]将Iml的原生质体悬浮液、100 μ I的沉默质粒溶液(使用天根无内毒素质粒大提试剂盒提取(货号DPl 17)，质粒浓度为450ng/y I)和5μ I的肝素钠(5mg/ml)加入管中，轻轻混匀，冰上静置30min ;逐滴加入1/3体积的SPTC溶液，轻轻混匀，在室温静置20min ；将转化混合液加入50ml玻璃三角瓶中，加入20ml的RM培养液(酵母提取物lg/L，caseinhydrolysate (水解酪蛋白)lg/L,鹿糖 274g/L, ρΗ7.0),室温静置 2h 后 25°C, IOOrpm 过夜培养。次日将恢复好的菌丝混入温度适中的PDA培养基中，加入筛选抗生素(潮霉素或者G418，终浓度均为100μ g/ml)，铺平板，25°C培养2~3d后挑转化子。
[0074]4.基因沉默效果评价方法
[0075]通过测定沉默转化子的生长、对非生物胁迫等生物学特征，并通过RT-PCR技术定量检测靶基因的表达量，与野生型菌株比较综合评价沉默效果。
[0076]实施例2禾谷镰刀菌cyp51A单基因的沉默
[0077]cyp51A基因在禾谷镰刀菌抗三唑类杀菌剂过程中起重要作用，该基因的敲除突变体，不能在含三唑类药剂平板上生长。试验通过沉默cyp51A后，观察其表型。
[0078]从 http://www.broadinstitute.0rg/annotation/genome/fusarium_group 中查找到禾谷镰刀菌的cyp51A基因(FGSG_04092)的⑶NA区域，通过分析，设计扩增正向沉默片段(Sense arm)的上下游引物为:
[0079]cvd51A-SL-F:5’ -ATctcgagTCTATCCCTTATGGGTCTTGG-3’ (XhoI)
[0080]cvp5IA-SL-R:5，-ATaagcttTTGCGTAAGGCCAAACTTGA~3，(HindIII)
[0081]扩增反向沉默片段(Antisense arm)的上下游引物为:
[0082]cvp5IA-SR-F: 5，-ATggtaccTCTATCCCTTATGGGTCTTGG-3，(KpnI)
[0083]cyp5IA-SR-R:5，-ATagatctTTGCGTAAGGCCAAACTTGA-3，(BglII)
[0084]RT-PCR鉴定沉默转化子基因表达量引物如下，产物大小248bp:
[0085]cyp5 IA-RT-F: 5 ’ -CCAAGGCAATGGCTGAGATA-3 ’
[0086]cyp5 IA-RT-R: 5，-TGTTCGAATGCCCCCTTTT-3 ’
[0087]正向(正向沉默片段)或反向(反向沉默片段)PCR扩增产物为401bp，其中正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，正反向产物分别酶切连接至PFsilent-G418的两个多克隆位点，获得重组后的沉默质粒，命名为PFsilent-G418-Cyp51A。按照实施例1中的PEG介导转化体系转化禾谷镰刀菌，并在G418平板上筛选转化子。
[0088]试验得到23个沉默转化子，表现出不同的沉默效果，以S7号(命名为cyp51A_S7)进行表型测定和RT-PCR分析。结果如图3C所示，沉默转化子cyp51A-S7的基因表达量明显下降至野生型的15%左右,在含三唑酮(浓度为5 μ g/ml)的平板上表型与cyp51A基因的敲除突变体类似，生长极其缓慢(图3B)。结果证明，该技术完成了靶基因cyp51A的沉默，降低其表达量。
[0089]实施例3禾谷镰刀菌色素合成基因PKS单基因沉默
[0090]PKS基因簇是禾谷镰刀菌色素合成的基因簇，该基因簇的基因突变将导致菌株不能产生深红色色素。本实例将沉默PKS基因簇的关键基因PKS12来进行沉默效果评价。
[0091]从 http://www.broadinstitute.0rg/annotation/genome/fusarium_group 中查找到禾谷镰刀菌的PKS12基因(FGSG_02324)的⑶NA区域，通过分析设计引物如下:
[0092]扩增正向沉默片段的上下游引物为:
[0093]Pks12-SL-F: 5，-ATGCctcgag ACTTTGCCGACATTCAGGAA-3，(XhoI)
[0094]Pksl2-SL-R:5’ -ATGCaagcttAAGGAACTGACGATCGAGCAA_3’ (HindIII)
[0095]扩增反向沉默片段的上下游引物为:
[0096]PksI2-RL-F:`ATGCggtaccACTTTGCCGACATTCAGGAA~3， (KpnI)
[0097]Pksl2-RL-R:5’ -ATGCagatctAAGGAACTGACGATCGAGCAA-3’ (BglII)
[0098]RT-PCR鉴定引物如下，PCR产物大小为112bp:
[0099]NPKS-RTF: 5，-AAAGGTCGCGATGTTCATCG-3，
[0100]NPKS-RTR: 5，-TGAAGCAGCCATTCATGACC-3，
[0101]正向或反向PCR扩增产物为426bp，其中正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.3所示，反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，正反向产物分别酶切连接至PFsilent-Hgy的两个多克隆位点，获得重组后的沉默质粒，命名为PFs i Ient-Hgy-PKS12。按照实施例1中的PEG介导转化体系转化禾谷镰刀菌，并在潮霉素平板上筛选转化子。
[0102]试验得到18个沉默转化子，表现出不同的沉默效果，以SI号(命名为PKS-S1)进行表型测定和RT-PCR分析。结果如图4B、图4C所示，沉默转化子PKS-Sl的基因表达量明显下降至野生型的15%左右，在PDA平板上不能形成色素。结果证明，该技术完成了靶基因PKS12的沉默，降低其表达量。
[0103]实施例4尖孢镰孢菌致病关键基因Stel2的沉默分析
[0104]尖孢镰孢菌Stel2在其致病过程中起关键作用，已报道该基因的敲除突变体菌株不能引起番茄的病害，实例中对该基因进行沉默并观察其致病能力。
[0105]从 http://www.broadinstitute.0rg/annotation/genome/fusarium_group 中查找到尖孢镰刀病菌F.0xysporum4287菌株Stel2 (F0XG_02103)的⑶NA区域,分析后设计沉默引物如下:
[0106]扩增正向沉默片段的上下游引物为:
[0107]PS-Fostel2-LF:5’ -ATGCctcgagGCAACCCGACCAGTACATTCGCCG_3’ (XhoI)
[0108]PS-Fostel2-LR:5，-ATGCaagcttCCAGTAAAAGACTTTTTGCTTC-3J (HindIII)扩增反向沉默片段的上下游引物为:[0109]PS-Fostel2-RF:5’ -ATGCggtaccGCAACCCGACCAGTACATTCGCCG_3’ (KpnI)
[0110]PS-Fostel2-RR:5，-ATGCagatctCCAGTAAAAGACTTTTTGCTTC-3J (BglII) RT-PCR 引物如下，扩增产物为217bp:
[0111]F0stel2-RT-F:5’ -GCCGTCCTGTCAAAAACTCCAA-3’
[0112]F0stel2-RT-R:5’ -TCGCGTTCCAGCGCGTCAAGAAAC-3’
[0113]正向或反向PCR扩增产物为361bp，其中正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.5所示，反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示，正反向产物分别酶切连接至PFsilent-Hgy的两个多克隆位点，获得重组后的沉默质粒，命名为PFsilent-Hgy-Ste12。按照实施例1中的PEG介导转化体系转化尖孢镰孢菌，并在潮霉素平板上筛选转化子。
[0114]试验得到50个沉默转化子，表现出不同的沉默效果，以S12号(命名为F0Stel2-S12)进行表型测定和RT-PCR分析。结果如图5B、图5C所示，沉默转化子F0Stel2-S12的基因表达量明显下降，番茄果实上接种试验表明其致病力下降。
[0115]实施例5禾谷镰刀菌tri6-cyp51A_PKS12多基因同时沉默效果评价
[0116]本实施案例通过同时沉默脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)合成关键基因、戊唑醇抗性相关基因cyp51A和色素合成基因PKS12，并检测沉默转化子沉默后，各基因对应表型，以证明本发明的技术可以用于同时进行多基因沉 默。
[0117]从 http://www.broadinstitute.0rg/annotation/genome/fusarium_group 中查找到cyp51A、PKS12、tri6在禾谷镰刀菌中的基因位置分别为FGSG_04092、FGSG_02324和FGSG_03536,首先设计引物将3个基因的沉默区域进行扩增，再通过融合PCR，进行融合。相关引物如下:
[0118]PsilentCom-Fl:5，-TACTCCGAAGAACCACTTGTT-3’
[0119]Psi IentCom-Rl: 5，-TGACAGCAAAGAGTGCTACCACATTGTTGTCCTTCCTTGTCTT-3，
[0120]PsilentCom-F2:5，-TGGTAGCACTCTTTGCTGTCA-3’
[0121]PsilentCom-R2:5’ -GCTTTTTGCGTAAGGCCAAACT-3’
[0122]NPsi lentCom-F3:5，-AGTTTGGCCTTACGCAAAAAGCCGTACCTTTCCTTCGGAGAAC-3，
[0123]NPsi lentCom-R3:5 ’ -AGGAACTGACGATCGAGCAAGTC-3 ’
[0124]PsilentCom-Fl/Rl 用于扩增 tri6 基因沉默区，PCR产物为 380bp;PsilentCom-F2/R2用于扩增cyp51A基因沉默区，PCR产物为438bp;NPsilentCom_F3/R3用于扩增PKS12基因沉默区，PCR产物为354bp。PCR产物用Primer Star进行扩增并回收产物。上述3个片段利用融合PCR进行融合后利用下列引物扩增正反向插入片段:
[0125]扩增正向沉默片段的上下游引物:
[0126]PsilentCom-HpF4:5’ -ATGCctcgagGCTTCGACTTTGACTTCGCGAAC_3’ (XhoI)
[0127]NPsilentCom-HpR4:5，-ATGCaagcttGAGAGCTCCAAGGACAAAGAAT_3’ (HindIII)扩增反向沉默片段的上下游引物:
[0128]NPsilentCom-NHpF5:5，-ATGCggtaccGCTTCGACTTTGACTTCGCGAAC_3’ (KpnI)
[0129]NPsilentCom-NHpR5:5’ -ATGCagatctGAGAGCTCCAAGGACAAAGAAT_3’ (BglII)
[0130]正向或反向PCR扩增产物为llOlbp，其中正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.7所示，反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示，正反向产物分别酶切连接至PFsi Ient-G418的两个多克隆位点，获得重组后的沉默质粒，命名为PFsi Ient-G418-CPT。按照实施例1中的PEG介导转化体系转化禾谷镰刀菌，并在G418平板上筛选转化子。
[0131]试验得到30个沉默转化子，表现出不同的沉默效果，以S2号(命名为CPT-S2)进行表型测定和RT-PCR分析。RT-PCR使用引物如下:
[0132]Tri6-PS-RTF: 5，-TTATCGCCCTTCCCACCTTCACAC-3，
[0133]Tri6-PS-RTR:5’ -GGTAATGCCGCCTAAAGTCCCGTC-3’
[0134]CYP5IA-PS-RTF: 5，-TTTTCCACTGGTTCCCTTTCTT-3，
[0135]CYP5IA-PS-RTR: 5，-ACTTCTTCTGCATTGGCATCCT-3，
[0136]PKS-PS-RTF: 5，-TGGTGTAGATGCTGTTCGTGTG-3，
[0137]PKS-PS-RTR: 5，-TGATGAATGAGTCAAGTCGGTC-3，
[0138]结果如图6B、图6C、图6D所示，沉默转化子CPT-S2的各基因表达量明显下降，转化子不能在含戊唑醇的平板上生长、菌落白色且DON产量降低。实例结果证明，该发明技术能进行多基因同时沉默。
[0139]实施例6禾谷镰刀菌致死基因FGSG_06103沉默效果评价
[0140]禾谷键刀菌基因FGSG_06103 功能预测为 Serine/threonine-proteinph0SphataSe2B催化亚基。通过同源重组技术进行该基因敲除该基因，获得150个异位转化子，未获得敲除突变体，因此推测为致死基因。本实例通过该发明技术进行沉默，观察表型。
[0141]从 http://www.broadinstitute.0rg/annotation/genome/fusarium_group 中查找到FGSG_06103的CDNA序列，设计引物如下:
[0142]扩增正向沉默片段的上下游引物:
[0143]PS-Fg6103-LF:5’ _ATGCctcgagGGACGCTCCCATCACCGTCTGTG3’ (XhoI)
[0144]PS-Fg6103-LR:5’ -ATGCaagctt AAGGTGAAGTAGTCGGTCAAGT-3’(HindIII)扩增反向沉默片段的上下游引物:
[0145]PS-Fg6103-RF:5’ -ATGCggtaccGGACGCTCCCATCACCGTCTGTG-3’ (KpnI)
[0146]PS-Fg6103-RR:5’ -ATGCagatct AAGGTGAAGTAGTCGGTCAAGT-3? (BglII)
[0147]正向或反向PCR扩增产物为243bp，其中正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.9所示，反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示，正反向产物分别酶切连接至PFsilent-Hgy的两个多克隆位点，获得重组后的沉默质粒，命名为PFsilent-Hgy-6103。按照实施例1中的PEG介导转化体系转化禾谷镰刀菌，并在潮霉素平板上筛选转化子。
[0148]试验得到25个沉默转化子，表现出不同的沉默效果，其中有5个转化子表现出明显的生长表型减慢。以S4号(命名为FGSG_06103-S4)进行表型测定，结果如图7B所示，沉默转化子FGSG_06103-S4在PDA培养基表面的生长速度明显减弱。该结果证明，该技术完成了致死基因FGSG_06103的沉默。
【权利要求】
1.一种用于沉默镰刀菌内源基因的沉默载体，包括原始载体以及插入所述原始载体的正向沉默片段和反向沉默片段，其特征在于，所述原始载体为PSilent-1或pSilent-Ι潮霉素抗性基因替换为G418抗性基因的载体pSilent-Ι ;所述正向沉默片段插入所述原始载体中内含子上游的多克隆位点，所述反向沉默片段插入所述原始载体中内含子下游的多克隆位点。
2.如权利要求1所述的沉默载体，其特征在于，所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQID N0.1所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；或所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示；或所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示；或所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示,所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示；或所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.9所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示。
3.如权利要求1或2所述的沉默载体的构建方法，其特征在于，包括: (1)以靶基因的cDNA为模板，PCR扩增正向沉默片段和反向沉默片段； (2)将所述的正向沉默片段连入所述原始载体中内含子上游的多克隆位点，将所述的反向沉默片段连入所述原始载体中内含子下游的多克隆位点，构建得到所述的沉默载体。
4.如权利要求1或2所述的沉默载体在沉默镰刀菌内源基因中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述镰刀菌为禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)或尖抱键刀菌(Fusarium xysporum)。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括: (1)将镰刀菌的分生孢子接种于培养液中振荡培养，获得幼殖体； (2)以所述幼殖体为原料，制备得到原生质体； (3)将沉默载体转化所述的原生质体，筛选获得沉默转化子。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述原生质体的制备方法包括:将所述的幼殖体置于蜗牛酶、纤维素酶和溶菌酶的混合酶液中进行酶解，酶解结束后过滤、离心、清洗，得到所述的原生质体。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述蜗牛酶的浓度为30g/L，纤维素酶的浓度为20g/L，溶菌酶的浓度为20g/L。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述转化的方法包括: (1)将所述的原生质体悬浮于STC溶液中，并滴加含40%PEG4000的STC溶液，得原生质体悬液； (2)将原生质体悬液、沉默质粒溶液和肝素钠溶液混合，冰浴20~30min后，向混合液中逐滴加入1/3混合液体积的含40%PEG4000的STC溶液，得转化液； (3)将所述的转化液混匀后静置20~30min，加入培养液进行再生培养； (4)再生培养结束 后将所述的培养液与培养基混合后共培养。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，原生质体悬液、沉默质粒溶液和肝素钠溶液混合后，所述肝素钠在混合液中的浓度为0.1~0.3mg/ml。
【文档编号】C12N15/63GK103820482SQ201410037594
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】陈云, 高启迅, 尹燕妮, 马忠华 申请人:浙江大学