一种氧化葡萄糖酸杆菌无抗性标记基因敲除体系的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌无抗性标记基因敲除体系，属于基因工程【技术领域】。本发明通过同源重组技术，将G.oxydans中upp基因进行敲除，得到一upp基因缺陷型菌株；同时构建了含有一个能在G.oxydans中良好转录表达并具有条件致死功能的upp基因、一个用于G.oxydans转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因及一个MCS多克隆位点的重组整合质粒。该质粒适用于G.oxydans染色体基因敲除和替代，相比使用抗性标记基因作为筛选标记进行基因敲除有以下两点优势：不将抗性基因引入G.oxydans基因组中，避免了抗性基因对上下游基因产生极性作用；利用该敲除体系可以在同一菌株中进行多次染色体基因敲除和替代。
【专利说明】一种氧化葡萄糖酸杆菌无抗性标记基因敲除体系
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌无抗性标记基因敲除体系，尤其是一种使用UPP基因作为筛选基因在G.0xydans中进行基因敲除的体系及其构建方法，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)是一种专性好氧的革兰氏阴性菌属于醋酸杆菌科，对人和其它动物无病原性，但可引起水果的细菌性腐烂和褐变。该菌种含有多种酶类能不完全氧化有机物，产生多种重要化合物，这使得在工业应用中占有一席之地。其酶类主要有两大类:第一种是颗粒酶，结合在细胞膜上，如D-葡萄糖脱氢酶、甘油脱氢酶、D-山梨醇脱氢酶等，这些酶为黄素蛋白类或者细胞色素；第二种存在于胞质中，催化胞内碳水化合物的代谢。G.0xydans广泛应用于维生素C、5_脱氧野尻霉素、D-葡萄糖酸、2-羟基丙酮和醋酸等工业化生产，是国内外生物合成维生素C前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的关键菌株，具有非常高的工业价值。
[0003]目前国内在G.0xydans中的基因工程操作技术还不成熟，国内报道过的敲除手段都是利用卡那霉素等抗性基因作为筛选基因。此方法存在明显的弊端:将抗性基因引入G.0xydans基因组中，抗性基因对上下游基因会产生极性作用；一旦抗性基因引入基因组，则该抗性基因不可以再次用于G.0xydans染色体基因敲除和替代。
[0004]Upp基因 编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶，能将5-氟尿嘧啶转化为5-氟尿苷一磷酸，5-氟尿苷一磷酸又转化为5-氟脱氧尿苷单磷酸，是胸苷酸合成酶的不可逆抑制剂，从而导致DNA不能修复和复制。因此，在培养基中加5-氟尿嘧啶可以筛选不含upp基因的菌株，由于upp基因缺失,培养基中添加胸腺嘧唳能使upp基因缺陷型G.0xydans更好地生长。采用upp基因为筛选基因在G.0xydans中进行基因敲除比使用抗性标记基因作为筛选标记进行基因敲除有以下两点优势:不将抗性基因引入G.0xydans基因组中，避免了抗性基因对上下游基因产生极性作用；利用该敲除体系可以在同一菌株中进行多次染色体基因敲除和替代。
[0005]采用upp基因为筛选基因在G.0xydans中进行基因敲除的技术以及敲除体系构建的方法国内未见有相关报道。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的第一个技术问题是提供一种氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)无抗性标记基因敲除体系。
[0007]所述敲除体系包括一株upp基因缺陷型G.0xydans和一个携带了 upp基因、抗生素抗性标记和多克隆位点的重组整合质粒。
[0008]所述upp基因(含启动子)核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]所述upp基因缺陷型G.0xydans是将upp基因上下游各500bp片段同源臂通过融合PCR连接,得到upp基因敲除框架,转化G.0xydans后得到的upp缺陷型菌株。
[0010]所述upp基因上游500bp片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，下游500bp片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示:
[0011]所述重组整合质粒，是将携带了 upp基因的PMD19-T通过Sac I1、Cla I双酶切，将所得upp基因片段连接到pK19mobsacB上，得到重组整合质粒pK19mobupp (图1)。该质粒含有一个能在G.0xydans中良好转录表达并具有条件致死功能的upp基因、一个用于G.0xydans转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因，还含有一个MCS多克隆位点。
[0012]本发明要解决的第二个技术问题是提供一种应用所述敲除体系对G.0xydans进行基因敲除的方法，是将所需敲除的基因的敲除框架引入重组整合质粒的多克隆位点，得到重组整合载体，再将得到的重组整合载体转化UPP缺陷型G.0xydans后，先后经抗生素抗性和抗5-氟尿嘧啶筛选得到目的基因缺陷型菌株。
[0013]具体地，所述方法可将upp基因通过Sac I1、Cla I双酶切后连接到pK19mobsacB上，得到重组整合质粒pK19mobupp，再将所需敲除的基因的敲除框架引入重组整合质粒的多克隆位点，然后电转化upp基因缺陷型G.0xydans,进行筛选:第一轮筛选是筛选具有卡那霉素抗性的转化子，第二轮筛选是筛选抗5-氟尿嘧啶及对卡那霉素敏感的转化子。
[0014]所述第一轮筛选，是将转化子涂布含卡那霉素的山梨醇平板。所述第二轮筛选是将在含卡那霉素的山梨醇平板上长出的转化子转接到含5-氟尿嘧啶和胸腺嘧啶的山梨醇平板。第一轮筛选的目的是筛选出单交换的转化子，此次交换卡那霉素抗性基因和upp基因会整合到基因组上，用卡那霉素抗性进行筛选，得到已进行单臂交换的转化子；第二轮筛选的目的是筛选出双交换 的转化子(即目的基因缺陷型转化子)，此次交换卡那霉素抗性基因和upp基因会脱离基因组，用5-氟尿嘧啶进行筛选，得到转化子不含upp基因即为目的基因缺陷型转化子(图2)。
[0015]本发明技术方案的有益之处:采用upp基因为筛选基因在G.0xydans中进行基因敲除比使用抗性标记基因作为筛选标记进行基因敲除有以下两点优势:不将抗性基因引入G.0xydans基因组中，避免了抗性基因对上下游基因产生极性作用；利用该敲除体系可以在同一菌株中进行多次染色体基因敲除和替代。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是质粒pK19mobupp构建示意图。
[0017]图2是目的基因敲除的菌株筛选流程示意图。
【具体实施方式】
[0018]实施例1重组整合质粒的构建
[0019]将本实验室对G.0xydans WSH-003 (保藏于江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，编号为CICM-CU B7004)的全基因组测序结果中注释的upp基因(SEQ ID N0.1,含启动子)设计引物进行扩增，分别连接到克隆载体PMD19-T测序，获得正确的upp转化子后进行双酶切连接到pK19mobsacB上,构建得到pK19mobupp (图1)。
[0020]实施例2upp基因缺陷型G.0xydans工程菌的构建
[0021]将对G.0xydans WSH-003的全基因组测序结果中注释upp上下游各500bp基因设计引物进行扩增，通过融合PCR将upp基因上下游的各500bp基因进行拼接，得到upp基因敲除框架，连接到克隆载体PMD19-T测序，获得正确的转化子后，进行双酶切得到upp基因敲除框架，电转化G.0xydans WSH-003，涂布含5-氟尿嘧啶的山梨醇平板，菌落PCR验证阳性转化子(只有upp基因上下游片段，不存在upp基因)，得到upp基因缺陷型G.0xydansWSH-003ο
[0022]实施例3G.0xydans WSH-003中山梨醇还原酶基因的敲除
[0023]将山梨醇还原酶基因(Sorbose Reductase)的敲除框架(上下游基因融合片段)连接到构建好的重组整合质粒pK19mobupp的MCS多克隆位点，电转化upp基因缺陷型G.0xydans WSH-003，涂布含卡那霉素的山梨醇平板，长出的转化子再转接到含5_氟尿嘧啶和胸腺嘧啶的山梨醇平板，通过PCR验证得到了敲除了山梨醇还原酶基因的阳性转化子，只有sr上下游基因片段，不存在sr基因。
[0024]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)无抗性标记基因敲除体系,其特征在于包括一株upp基因缺陷型G.0xydans和一个携带了 upp基因、抗生素抗性标记和多克隆位点的重组整合质粒。
2.根据权利要求1所述的敲除体系，其特征在于，所述upp基因的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。
3.根据权利要求1所述的敲除体系，其特征在于，所述upp基因缺陷型G.0xydans是将UPP基因上下游各500bp片段同源臂通过融合PCR连接，得到upp基因敲除框架，转化G.0xydans后得到的upp缺陷型菌株。
4.根据权利要求3所述的敲除体系，其特征在于，所述upp基因上游500bp片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，下游500bp片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
5.根据权利要求1所述的敲除体系，其特征在于，所述重组整合质粒的抗生素抗性标记是卡那霉抗性标记。
6.根据权利要求1所述的敲除体系，其特征在于，所述重组整合质粒是将upp基因通过Sac I1、Cla I双酶切后连接到pK19mobsacB上,得到重组整合质粒pK19mobupp。
7.根据权利要求6所述的敲除体系,其特征在于,所述重组整合质粒pK19mobupp含有一个能在G.0xydans中转录表达并具有条件致死功能的upp基因、一个用于G.0xydans转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因，还含有一个MCS多克隆位点。
8.一种应用权利要求1所述敲除体系对G.0xydans进行基因敲除的方法，其特征在于，是将所需敲除的基因 的敲除框架引入重组整合质粒的多克隆位点，得到重组整合载体，再将得到的重组整合载体转化upp缺陷型G.0xydans后，先后经抗生素抗性和抗5_氟尿嘧啶筛选得到目的基因缺陷型菌株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将upp基因通过SacI1、Cla I双酶切后连接到pK19mobsacB上,得到重组整合质粒pK19mobupp,再将所需敲除的基因的敲除框架引入重组整合质粒的多克隆位点，然后电转化upp基因缺陷型G.0xydans,进行筛选:第一轮筛选是筛选具有卡那霉素抗性的转化子，第二轮筛选是筛选抗5-氟尿嘧啶及对卡那霉素敏感的转化子。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一轮筛选，是将转化子涂布含卡那霉素的山梨醇平板；所述第二轮筛选是将在含卡那霉素的山梨醇平板上长出的转化子转接到含5-氟尿嘧啶和胸腺嘧啶的山梨醇平板。
【文档编号】C12N15/74GK103805545SQ201410055749
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】陈坚, 周景文, 夏雨, 堵国成 申请人:江南大学