一种青藏高原藏羊mtDNA D-loop全序列及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种青藏高原藏羊mtDNA?D-loop全序列及检测方法，包括以下步骤:（1）绵羊线粒体D-loop全序列的收集及与近缘线粒体D-loop序列的比对；（2）引物设计与PCR扩增；（3）PCR产物测序与序列组装。本发明获得了青藏高原14个藏羊地方品种636个个体的mtDNA?D-loop全序列。本发明的检测方法具有速度快、成本低、易掌握等优点，所获得的mtDNA?D-loop全序列可应用于青藏高原藏羊遗传资源多样性评估、遗传变异分析、系统进化分析、母系起源和系统发育研究及种质资源鉴定与保护等领域。
【专利说明】—种青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于绵羊基因组学领域,具体涉及一种青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列及检测方法。
【背景技术】
[0002]家畜遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是畜牧业生产的基础。通过研究家畜的遗传多样性可以进一步了解家畜遗传多样性的丰富程度和品种遗传的独特性程度，为合理开发利用家畜遗传资源提供依据，还可以为物种多样性的保护提供依据。
[0003]绵羊的线粒体基因组DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)呈典型的闭合环状双链结构，长度为15.6kb，能够自主复制和转录。线粒体DNA(mtDNA)是核外遗传物质，具有分子量较小、进化速度快、无组织特异性及严格的母系遗传等特性，在近缘种间和种内群体间具有丰富的多态性，是研究物种起源进化、分类的有力工具。根据碱性氯化铯密度梯度离心中双链密度不同可将mtDNA的两条链分为重链(H)和轻链(L),两条链都参与复制和转录过程。对绵羊线粒体基因组的结构分析表明，mtDNA可分为编码区和非编码区。编码区内含37个基因，包括13个蛋白质基因，2个rRNA基因，22个tRNA基因。其中13个蛋白质编码基因分别是细胞色素b基因(Cytb)、细胞色素C氧化酶三个亚基1、II和III基因(Co I ,Co II和Co III)，ATP 合成酶亚基基因(ATPase 6 和 ATPase 8)和 7 个 NADH 酶亚基 ND 1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6和ND4L ；2个rRNA基因分别是12s rRNA基因和16s rRNA基因，紧紧相邻；线粒体的12S rRNA和16S rRNA基因位于H链的tRNA Phe和tRNA Leu基因之间，以tRNAVal基因为间隔，12S rRNA基因比16S rRNA基因更保守。22个tRNA基因位于rRNA和13个蛋白质基因之间。除了 ND6和8个tRNA基因在L链编码外，其余大多数蛋白质编码基因和2个rRNA基因都是由H链编码。
[0004]mtDNA控制区又称为替代环区(D-1oop)或D-环，位于tRNAPlr°和tRNAPhe基因之间，它是线粒体基因组中最主要的一段非编码区，也是线粒体碱基序列和长度变异最大的区域，进化速度是其他区段的5倍，具有碱基替换速率快、存在丰富的序列变异等特点，特别适合于检测种群内及种群间的遗传多样性。D-1oop的碱基替换率比mtDNA分子的其他区域高5~10倍，是核单拷贝基因的25~100倍；它是整个线粒体基因组中序列和长度变异最大的区域。D-1oop是mtDNA分子内的高变区，且为A-T富集区，依照碱基A的比率，D-1oop可分为左功能区、中间保守区、右功能区三部分。左功能区和右功能区在遗传上为高变区，且为AT富集区；保守序列区(conserved sequence block, CSB)为G碱基富集区,且在不同的物种上结构不尽相同，多数动物的中间保守区内存在不同的重复序列。不同的物种重复序列所在的位置及重复单元序列不同，同种物种不同个体的单元序列重复数也不尽相同，这种差异在个体间表现为mtDNA分子的长度差异(molecule size variation),在个体内则表现为异质型现象(heteroplasmy)。因控制区不编码基因，故产生的突变可以不断地得到积累而对线粒体的功能不产生影响，因此具有更大的进化速率。由于具有单倍性、低重组率、母系遗传及进化速度快等特点，mtDNA已经被广泛地应用于遗传学、系统进化学及物种鉴定等领域。
[0005]藏羊主要有高原型(草地型)、山谷型和欧拉型三大类，各地根据其自然生态特点又细分为不同的类型，属粗毛型绵羊地方品种。藏羊原产于青藏高原，主要分布于西藏自治区及青海、甘肃、四川、云南、贵州等地，由于各生态条件差异悬殊，形成了不同的类型。草地型(高原型)藏羊是主体，数量最多，主要分布于西藏境内的网底斯山、念青唐古拉山以北的藏北高原和雅鲁藏布江地带；青海的藏羊主要分布在海北藏族自治州、海南藏族自治州、海西蒙古族哈萨克自治州、黄南藏族自治州、玉树藏族自治州、果洛藏族自治州六州的广阔高寒牧区；甘肃的甘南藏族自治州的各县市藏羊的主要分布区域；四川境内的藏羊分布在甘孜藏族自治州、阿坝藏族羌族自治州北部牧区。山谷型藏羊主要分布在青海省南部的班玛、囊谦两县的部分地区，四川省阿坝藏族羌族自治州南部牧区，云南的昭通市、曲靖市、丽江市及保山市腾冲县。欧拉型藏羊是藏系绵羊的一个特殊生态类型，中心产区位于甘肃省甘南藏族自治州的玛曲县欧拉乡及比邻地区及青海省河南蒙古族自治县和久治县等地。研究藏羊起源和进化可以说明古今绵羊的关系，更好的解决育种、改良、选种和保种问题。通过对藏羊遗传多样性、系统进化、母系起源的研究和认识，不但可以调查藏羊品种遗传资源背景状况，而且可确定品种遗传特征，了解各群体间的亲缘关系，准确区分品种，进而为育种工作提供重要依据。因此，有必要开展藏羊mtDNA D-1oop全序列研究，从基因水平揭示其系统进化关系和种群 遗传多样性水平。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提出一种速度快、成本低、易掌握的青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及检测方法，已解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0007]为了实现上述目的，本发明的技术方案是:
一种青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列及检测方法,包括以下步骤:
(1)绵羊mtDNAD-1oop全序列的收集与分析:
收集绵羊mtDNA D-1oop全序列，并与近缘种的mtDNA D-1oop全序列进行比对,分析mtDNA D-1oop全序列在近缘种的mtDNA全基因组序列上的相对位置；
(2)引物设计与PCR扩增:
根据mtDNA D-1oop基因在近缘种全基因组序列保守区域设计上、下游PCR引物，采用PCR方法扩增相邻的两个已知序列的未知序列；
(3)PCR产物测序与序列组装:
通过PCR产物测序反应体系对PCR产物进行测序、序列分析，将mtDNA D-1oop序列进行组装，获得mtDNA D-1oop全序列。
[0008]步骤(1)中，所述绵羊mtDNA D-Ιοορ全序列的获得方法有三种:一种是从测序获得的基因组文库或转录组文库中查找；另一种是从GenBank数据库中公开的绵羊基因序列中查找；第三种是通过收集近缘种的mtDNA D-1oop全序列进行同源比对，在保守区设计简并引物，然后以藏羊的DNA为模板进行PCR扩增，测序后获得青藏高原14个藏羊地方品种636个个体mtDNA D-1oop全序列。
[0009]步骤(1)中，所述近缘种为摩弗伦羊、羱羊、盘羊、亚洲A型、欧洲B型。
[0010]步骤⑵中，所述PCR引物和测序引物I对，其引物序列为:Forward primer:5’ -GGCTGGGACCAAACCTAT-3J
Reverse primer:5’ -GAACAACCAACCTCCCTAAG-3’。
[0011]步骤⑵中，所述PCR方法中PCR扩增反应体系为30uL，包括基因组DNA模板2uLUOXBuffer 3 uL、2.5 mM dNTP 2 uL、Taq DNA聚合酶0.2 uL、3 pM上下游引物各3 uL、灭菌双蒸水16.8 uL ;PCR反应程序为:94°C预变性5分钟、94°C变性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸90秒、36个循环、72°C延伸10分钟，12°C保存。
[0012]步骤(3)中，所述PCR产物测序反应体系为5 uL，包括基因组DNA模板(30-50 ng)3 uL、3 pM测序引物I uL、Bigdye 0.5 uL、灭菌双蒸水0.5 uL ;PCR测序反应程序为:95°C预变性2分钟、95°C变性10秒、51°C退火10秒、60°C延伸190秒、25个循环，12°C保存。
[0013]步骤(3)中，所述PCR产物的测序方法为双向、直接测序。
[0014]步骤(3)中，所述mtDNA D-Ιοορ序列组装方法是:以摩弗伦羊的mtDNA D-1oop全序列为参照物，将所有14个藏羊地方品种636个个体的mtDNA D-1oop序列进行拼接，获得青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列,所述青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列长度的变化范围为977-1259bp。
[0015]综上所述，本发明有益效果:
1、本发明的检测方法具有速度快、成本低、易掌握等优点，能够有效检测出青藏高原藏羊的mtDNA D-1oop全序列，从而为青藏高原藏羊分子遗传学及分子系统进化学研究提供有效的研究平台。
[0016]2、本发明提供的青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列可应用于藏羊遗传资源多样性评估、遗传变异分析、系统进化分析、母系起源和系统发育研究及种质资源鉴定与保护等领域。
【具体实施方式】
[0017]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0018]实施例1
一种青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列及检测方法,包括以下步骤:
(1)绵羊mtDNAD-1oop全序列的收集与分析
首先，本发明从测序获得的基因组文库中筛选青藏高原藏羊mtDNA D-1oop相关基因序列，一方面从GenBank数据库中检索青藏高原藏羊mtDNA D-1oop相关基因；然后,将收集到的青藏高原藏羊mtDNA D-1oop相关基因序列与近缘种摩弗伦羊、羱羊、盘羊、亚洲A型、欧洲B型的mtDNA D-1oop全序列进行比对,分析相关基因在近缘种mtDNA D-1oop全序列上的相对位置；
(2)引物设计与PCR扩增
根据藏羊mtDNA D-1oop全序列在近缘种基因组序列上的相对位置，以藏羊基因组为模板设计引物，采用PCR方法扩增相邻的两个已知基因间的未知序列。PCR扩增反应体系为 30uL，包括基因组 DNA 模板 2 uLUO X Buffer 3 uL、2.5 mM dNTP 2 uL、Taq DNA 聚合酶0.2 uL、3 pM上下游引物各3 uL、灭菌双蒸水16.8 uL ;PCR反应程序为:94°C预变性5分钟、94 V变性30秒、56 V退火30秒、72 °C延伸90秒、36个循环、72 °C延伸10分钟，最后12 °C保存；PCR反应完成后，采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测产物的质量；
(3)PCR产物测序与序列组装
PCR产物测序反应体系为5 uL，包括基因组DNA模板(30-50 ng) 3 uL、3 pM测序引物I uL、Bigdye 0.5 uL、灭菌双蒸水0.5 uL ;PCR测序反应程序为:95°C预变性2分钟、95°C变性10秒、51°C退火10秒、60°C延伸190秒、25个循环，12°C保存。
[0019]将上述PCR产物送测序公司进行双向、直接测序。将每个PCR产物的双向测序结果拼接为一条完整的序列。然后以摩弗伦羊、羱羊、盘羊、亚洲A型、欧洲B型的mtDNA D-1oop全序列为参照序列，将所有的mtDNA基因进行组装。最后组装获得藏羊14个地方绵羊品种636个个体mtDNA D-1oop全序列。
[0020]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0021]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他 实施方式。
【权利要求】
1.一种青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列及检测方法,其特征是,包括以下步骤: (1)绵羊mtDNAD-1oop全序列的收集与分析: 收集绵羊mtDNA D-1oop全序列，并与近缘种的mtDNA D-1oop全序列进行比对,分析mtDNA D-1oop全序列在近缘种的mtDNA全基因组序列上的相对位置； (2)引物设计与PCR扩增: 根据mtDNA D-1oop基因在近缘种全基因组序列保守区域设计上、下游PCR引物，采用PCR方法扩增相邻的两个已知序列的未知序列； (3)PCR产物测序与序列组装: 通过PCR产物测序反应体系对PCR产物进行测序、序列分析，将mtDNA D-1oop序列进行组装，获得mtDNA D-1oop全序列。
2.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及检测方法，其特征是，步骤(1)中，所述绵羊mtDNA D-1oop全序列的获得方法有三种:一种是从测序获得的基因组文库或转录组文库中查找；另一种是从GenBank数据库中公开的绵羊基因序列中查找；第三种是通过收集近缘种的mtDNA D-1oop全序列进行同源比对，在保守区设计简并引物，然后以藏羊的DNA为模板进行PCR扩增，测序后获得青藏高原14个藏羊地方品种636个个体mtDNA D-1oop全序列。
3.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及检测方法，其特征是，步骤(1)中，所述近缘种为摩弗伦羊、羱羊、盘羊、亚洲A型、欧洲B型。
4.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及检测方法，其特征是，步骤⑵中，所述PCR引物和测序引物I对，其引物序列为:`
Forward primer:5’ -GGCTGGGACCAAACCTAT-3’
Reverse primer:5’ -GAACAACCAACCTCCCTAAG-3’。
5.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及检测方法，其特征是，步骤(2)中，所述PCR方法中PCR扩增反应体系为30uL，包括基因组DNA模板2 uL、IOXBuffer 3 uL、2.5 mM dNTP 2 uL、Taq DNA 聚合酶 0.2 uL、3 pM 上下游引物各 3 uL、灭菌双蒸水16.8 uL ；PCR反应程序为:94°C预变性5分钟、94°C变性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸90秒、36个循环、72°C延伸10分钟；最后12°C保存。
6.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及检测方法，其特征是，步骤(3)中，所述PCR产物测序反应体系为5 uL，包括基因组DNA模板(30-50 ng) 3uL、3 pM测序引物I uL、Bigdye 0.5 uL、灭菌双蒸水0.5 uL ;PCR测序反应程序为:95°C预变性2分钟、95°C变性10秒、51°C退火10秒、60°C延伸190秒、25个循环、12°C保存。
7.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及检测方法，其特征是，步骤⑶中，所述PCR产物的测序方法为双向、直接测序。
8.根据权利要求1或2所述的一种青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及检测方法，其特征是，步骤(3)中，所述mtDNA D-1oop序列组装方法是:以摩弗伦羊的mtDNA D-1oop全序列为参照物，将所有14个藏羊地方品种636个个体的mtDNA D-1oop序列进行拼接，获得青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列。
9.根据权利要求8所述的一种青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及检测方法，其特征是，所述青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列长度的变化范围为977_1259bp。
【文档编号】C12Q1/68GK103865924SQ201410057019
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月20日 优先权日:2014年2月20日
【发明者】刘建斌, 孙晓萍, 曾玉峰, 王凡, 郭健, 杨博辉, 岳耀敬, 张万龙, 郎侠, 冯瑞林, 郭婷婷, 牛春娥, 王宏博 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所