重组犬流感病毒毒株、其制备方法及由其制备得到的疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组犬流感病毒毒株、其制备方法及由其制备得到的疫苗。该重组犬流感病毒包含：H3N2亚型犬流感病毒的HA和NA基因，以及H9N2禽流感病毒的PB2、PB1、PA、NP、M和NS六个内部基因。本发明的一种犬流感重组病毒毒株、命名为rH3N2-DL，该毒株的保藏号为CGMCC?No.8162。本发明还公开了该犬流感重组病毒的制备方法以及由其制得的疫苗。与亲本株相比，本发明的犬流感重组病毒在鸡胚和MDCK细胞上均能产生很高的病毒滴度和血凝效价。动物实验结果表明由本发明的犬流感重组病毒制得的疫苗具有良好的免疫原性和保护效力。
【专利说明】重组犬流感病毒毒株、其制备方法及由其制备得到的疫苗
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种重组病毒株，尤其涉及一种犬流感重组病毒、其制备方法及由其制备得到的疫苗。本发明属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]犬流感(Canine influenza，Cl)是由正黏病毒科、流感病毒属的A型流感病毒中的犬流感病毒(Canine influenza virus, CIV)引起的犬的一种呼吸道急性高度接触性传染病，多呈暴发性流行，传播非常迅速而且广泛。
[0003]目前流行的犬流感主要是由H3N8亚型和H3N2亚型犬流感病毒引起的。H3N8亚型犬流感是由马流感病毒跨种传播而导致，主要在国外流行，我国尚没有马流感病毒感染犬的报道。自2006年以来，在我国江苏、广东、北京、浙江和辽宁等地相继发生了禽源H3N2亚型流感病毒感染犬并导致犬发生严重呼吸道疾病的事件，血清学调查发现犬群中禽源H3N2犬流感的阳性率达到10%以上，表明H3N2CIV在犬群中已经占据了一定的生态地位，具有普遍流行的特征。禽源H3N2CIV不仅可以感染犬，而且可以感染雪貂和猫，表明该病毒已经跨越种间障碍，具备了感染哺乳动物的能力。而犬是一种伴侣动物，与人之间的接触非常密切，这也增加了人感染H3N2CIV的风险。
[0004]疫苗是防控病毒性传染病的有效手段，而H3N2CI是犬的新发传染病，目前国内外尚没有预防该病的疫苗。因此研发一种拥有我国自主知识产权、保护性良好的新型高效Cl疫苗具有重要的公共卫生学意义。
【发明内容】
[0005]本发明目的之一是提供一株重组犬流感病毒(CIV)，其包含H3N2亚型CIV的HA和NA基因、以及H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的6个内部基因。
[0006]本发明目的之二是提供一种上述重组犬流感病毒的制备方法。
[0007]本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:
[0008]本发明的一株重组犬流感病毒(CIV)，是通过以下方法制备得到的:
[0009](I)将H3N2亚型犬流感病毒的HA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含犬流感病毒HA基因的重组质粒；
[0010](2)将H3N2亚型犬流感病毒的NA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含犬流感病毒NA基因的重组质粒；
[0011](3)将H9N2亚型禽流感病毒的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NS和M分别插入到流感基因转录/表达双向载体中，分别获得含有各基因的重组质粒；
[0012](4)将以上获得的8个重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞共培养细胞单层，转染后的细胞经培养后，反复冻融3次，使细胞裂解，释放出病毒粒子，将含有细胞裂解物的培养液离心后，取上清液接种SPF鸡胚，培养2-3天后，取鸡胚尿囊液，检测其血凝活性，获得重组犬流感病毒。[0013]在本发明中，优选的，所述的流感基因转录/表达双向载体为pHW2000。
[0014]在本发明中，优选的，所述的H3N2亚型犬流感病毒的HA基因的核苷酸序列如SEQID N0.1所示，或与SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
[0015]在本发明中，优选的，所述的H3N2亚型犬流感病毒的NA基因的核苷酸序列如SEQID N0.2所示，或与SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
[0016]在本发明中，优选的，所述的H9N2亚型禽流感病毒的六个内部基因PB2、PBU PA、NP、NS和M的核苷酸序列分别为SEQ ID N0.3-8所示，或与SEQ ID N0.3-8所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
[0017]在本发明的一个具体实施例中，将得到的一株重组犬流感病毒命名为rH3N2_DL，分类命名为:H3N2犬流感病毒；保藏时间是:2013年9月6日；保藏单位是:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC N0.8162。
[0018]本发明的目的之三在于提供该重组CIV在制备预防或治疗犬流感药物，特别是犬流感疫苗中的应用。
[0019]实验证明，本发明的重组CIV，在鸡胚和MDCK细胞上均能产生比亲本毒株高很多倍的病毒滴度和血凝滴度，可作为研制犬流感疫苗的优良种毒。
[0020]本发明的一种犬流感疫苗，其特征在于由下述方法制备:用以上任一项所述的重组CIV接种SPF鸡胚或MDCK细胞，收获鸡胚尿囊液或细胞培养上清，灭活，乳化，即得。
[0021]进一步的，本发明还提出了一种疫苗组合物，其特征在于包含所述的犬流感疫苗，以及药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂等。
[0022]从免疫效力试验结果可以看出，用本发明获得的重组犬流感病毒制备得到的灭活疫苗免疫犬后能够对H3N2犬流感病毒强毒攻击提供100%的保护。由此可见，本发明重组犬流感病毒制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性，可有效预防或治疗犬流感，是理想的疫苗候选毒株。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是本发明实施例1重组CIV rH3N2-DL的制备流程图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0025]实施例1本发明重组CIV rH3N2-DL的拯救
[0026]1、H3N2亚型犬流感病毒HA和NA基因的RT-PCR扩增
[0027]使用Axygen柱式病毒RNA提取试剂盒提取H3N2亚型犬流感病毒A/Canine/Liaoning/27/2012 (H3N2)株(简称CIV LN27，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医微生物菌种保藏中心保藏)的RNA，具体步骤参见试剂盒说明书。以A型流感病毒反转录通用引物Un1-12:5’ -AGCAAAAGCAGG-3’为反转录引物制备LN27cDNA，反转录体系如下:DEPCH2019.0 μ L、LN27RNA5.0 μ L、AMV RT buffer8.0 μ L、2.5mmol/L dNTP mixture4.0 μ L、Un1-12 通用引物 2.0 μ L、RNase Inhibitorl.0 μ L 和 AMVReverse Transcriptasel.0 μ L,总体积40.Ομ L。将上述反转录体系混匀，室温静置IOmin后,放于42°C水浴锅中反转录lh，然后将反转录产物立即冰浴静置2min，随后使用或置于_20°C保存。以CIV LN27cDNA为模板，用HA和NA基因的特异性引物(表1)分别进行PCR扩增。PCR反应体系为=IOXPCRbufferl0.0 μ L、Ex Taq 酶 0.5 μ L、2.5mmol/L dNTP mixture2.0 μ L,lOpmol/L HA 或 NA 基因上、下游引物各1.0 μ L、cDNA模板2.0 μ L和ddH2083.5 μ L,总体积100.0 μ L。PCR反应程序如下:94°C预变性5min、94°C变性30sec、53°C退火45sec、72°C延伸2min、72°C后延伸lOmin，共计30个循环。同时设无模板的阴性对照。反应结束后，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小。结果:有2条PCR条带出现，大小分别为HAl.7kb和NAl.4kb，与预期的相符。
[0028]表1扩增CIV HA和NA基因的特异性引物
[0029]
【权利要求】
1.一株重组犬流感病毒(Canine influenza virus),其特征在于所述的重组犬流感病毒是通过以下方法制备得到的: (1)将H3N2亚型犬流感病毒的HA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含犬流感病毒HA基因的重组质粒； (2)将H3N2亚型犬流感病毒的NA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含犬流感病毒NA基因的重组质粒； (3)将H9N2亚型禽流感病毒的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NS和M分别插入到流感基因转录/表达双向载体中，分别获得含有各基因的重组质粒； (4)将以上获得的8个重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞共培养细胞单层，转染后的细胞经培养后，反复冻融3次，使细胞裂解，释放出病毒粒子，将含有细胞裂解物的培养液离心后，取上清液接种SPF鸡胚，培养2-3天后，取鸡胚尿囊液，检测其血凝活性，获得重组犬流感病毒。
2.如权利要求1所述的重组犬流感病毒，其特征在于所述的流感基因转录/表达双向载体为pHW2000。
3.如权利要求1所述的重组犬流感病毒，其特征在于所述的H3N2亚型犬流感病毒的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，或与SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的重组犬流感病毒，其特征在于所述的H3N2亚型犬流感病毒的NA基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，或与SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。`
5.如权利要求1所述的重组犬流感病毒，其特征在于H9N2亚型禽流感病毒的六个内部基因PB2、PBU PA、NP、NS和M的核苷酸序列分别为SEQ ID N0.3-8所示，或与SEQ IDN0.3-8所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
6.如权利要求1-5任一项所述的重组犬流感病毒，其特征在于所述的重组犬流感病毒命名为rH3N2-DL，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC N0.8162。
7.权利要求1-6任一项所述的重组犬流感病毒在制备预防或治疗犬流感药物中的应用。
8.一种犬流感疫苗，其特征在于由下述方法制备:用权利要求1-6任一项所述的重组犬流感病毒接种SPF鸡胚或MDCK细胞，收获鸡胚尿囊液或细胞培养上清，灭活，乳化，即得。
9.一种疫苗组合物，其特征在于包含权利要求8所述的犬流感疫苗，以及药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。
【文档编号】C12R1/93GK103881983SQ201410082973
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】刘明, 刘春国, 刘大飞, 张云 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所