用于检测犬巴贝西虫的引物组合、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测犬巴贝西虫的引物组合、试剂盒及检测方法，属于生物检测【技术领域】。本发明针对犬巴贝西虫18s RNA基因序列设计套式PCR引物组合，引物特异性强，不受其他非目的基因的干扰，能快速、高效、准确定性犬巴贝西虫的转录水平。本发明定性检测犬巴贝西虫的方法简单、精确，可在4小时内准确检测出最低为10拷贝的DNA样本，检测灵敏度高，同等实验条件下对标准品的梯度检测中套式PCR的灵敏度比普通PCR高出1000倍，实际临床检测中套式PCR的灵敏度比普通PCR高3～10个百分点。
【专利说明】用于检测犬巴贝西虫的引物组合、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及一种用于检测犬巴贝西虫的引物组合，以及含有该引物组合的试 剂盒，同时还涉及采用该引物组合检测犬巴贝西虫的方法，属于生物检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 巴贝西虫病是一种经蜱传播的血源性原虫病，广泛发生于各种家畜。其在家畜体 内单个或成对寄生于红细胞内，有可能引起严重的贫血和血红蛋白尿症。引起犬的巴贝西 虫病的病原体有3种，即犬巴贝西虫（Babeisa canis)、韦氏巴贝西虫（B. vitlli)和吉氏巴 贝西虫（B.gibsoni)。犬巴贝西虫分布于欧洲、美洲和印度，韦氏巴贝西虫分布于南美洲，吉 氏巴贝西虫分布于亚洲。我国主要流行的虫种为吉氏巴贝西虫，目前在国内分布广泛，有蜱 滋生的地方，春、夏、秋季均可发病。
[0003] 目前，血液原虫检测方法主要有涂片染色镜检、酶联免疫反应、间接荧光、LAMP、多 聚酶链式反应（PCR)等。涂片染色镜检法对检测设备的要求较低，操作简便，但是检测率较 低。LAMP技术检测简单快速，肉眼即可直接观察结果，但易于出现假阳性，且不易鉴定虫体 的种类。而PCR技术以其较高的特异性和灵敏性被认为是检测巴贝西虫的最有效方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于检测犬巴贝西虫的引物组合。
[0005] 同时，本发明还提供一种用于检测犬巴贝西虫的试剂盒。
[0006] 最后，本发明提供一种检测犬巴贝西虫的方法。
[0007] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0008] 一种用于检测犬巴贝西虫的引物组合，由外引物和内引物组成，外引物为：
[0009] 正向引物：5' -GGCTTTCGGTGATTCATA-3'（如 SEQ ID N0:1 所示），
[0010] 反向引物：5' -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3'（如 SEQ ID N0:2 所示）；
[0011] 内引物为：
[0012] 正向引物：5' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3'（如 SEQ ID N0:3 所示），
[0013] 反向引物：5' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3'（如 SEQ ID N0:4 所示）。
[0014] 一种用于检测犬巴贝西虫的试剂盒，主要包括由外引物和内引物组成的引物组 合，外引物为：
[0015] 正向引物：5，-GGCTTTCGGTGATTCATA-3，，
[0016] 反向引物：5 ' -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3 ' ；
[0017] 内引物为：
[0018] 正向引物：5 ' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3 '，
[0019] 反向引物：5 ' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3 '。
[0020] 具体的，用于检测犬巴贝西虫的试剂盒，还可以包括Taq酶、Mg2+、mix dNTP、缓冲 液(如10XPCR Buffer)、DNA Marker (标准品）及试剂盒反应条件说明书等。
[0021] 更具体的，用于检测犬巴贝西虫的试剂盒，包括：Taq酶100UU0XPCR Buffer500 μ L、25mmol. IZ1Mg2+盐 500 μ LUOmmol. T1Iiiix dNTPlOO μ UlOpmol · μ Γ1 引物组 合(包括内外引物正反向）各100 μ L。
[0022] -种检测犬巴贝西虫的方法，包括以下步骤：
[0023] (1)以待检测DNA样品为模板，采用引物组合进行套式PCR扩增；
[0024] (2)取扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳结果判定样品中是否含有犬巴贝西虫；
[0025] 所述步骤（1)中引物组合由外引物和内引物组成，外引物为：
[0026] 正向引物：5 ' -GGCTTTCGGTGATTCATA-3 '，
[0027] 反向引物：5' -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3' ；
[0028] 内引物为：
[0029] 正向引物：5 ' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3 '，
[0030] 反向引物：5，-TCGTCTTCGATCCCCTA-3，。
[0031] 所述步骤（1)中采用引物组合进行套式PCR扩增的反应体系为：
[0032] 第一次 PCR :50μ L 体系，Taq 酶 1U、10XPCR Buffer5y L、25mmol/L Mg2 + 4y L、 10111111〇1/111^(1阶1314 1^、10?111〇1/^1^外引物正反向引物各14 1^、待检测0嫩样品14 1^，加 ddH20 至 50 μ L ;
[0033] 第二次 PCR :50μ L 体系，Taq 酶 1U、10XPCR Buffer5y L、25mmol/L Mg2 + 4y L、 lOmmol/L mix dNTPlyL、10pmol/yL内引物正反向引物各lyL、第一次PCR扩增产物 1 μ L，加 ddH20 至 50 μ L。
[0034] 所述的第一次PCR的反应程序为：94°C预变性5min，94°C变性30s、56°C退火30s、 72°C延伸lmin，进行25个循环，72°C延伸10min，冷却结束反应。
[0035] 所述的第二次PCR的反应程序为：95°C预变性5min，94°C变性30s、55°C退火30s、 72°C延伸lmin，进行30个循环，72°C延伸7min，冷却结束反应。
[0036] 所述步骤（2)中凝胶电泳采用I. 0%ΕΒ染色的琼脂糖凝胶，以便于电泳后在紫外灯 下观察电泳结果。与DNA Marker进行对照，当电泳池中出现大小为658bp的片段，即可判 定样品中含有犬巴贝西虫遗传物质。
[0037] 本发明的有益效果：
[0038] 本发明针对犬巴贝西虫18s RNA基因序列设计套式PCR引物组合，该引物的特异 性强，不受其他非目的基因的干扰，能快速、高效、准确定性犬巴贝西虫的转录水平。
[0039] 本发明用于检测犬巴贝西虫的试剂盒使用方便，便于携带，适用于多次检测。
[0040] 本发明定性检测犬巴贝西虫的方法简单、精确，可在4小时内准确检测出最低为 10拷贝的DNA样本，检测灵敏度高，同等实验条件下对标准品的梯度检测中套式PCR的灵敏 度比普通PCR高出1000倍，实际临床检测中套式PCR的灵敏度比普通PCR高3?10个百 分点。
【专利附图】
【附图说明】
[0041] 图1为本发明实施例3中扩增产物的电泳图像；
[0042] 图2为试验例1中特异性扩增犬巴贝西虫的电泳图像；
[0043] 图3为试验例2中检测犬巴贝西虫套式PCR方法灵敏度的电泳图像；
[0044] 图4为试验例2中检测犬巴贝西虫普通PCR方法灵敏度的电泳图像；
[0045] 图5为试验例3中套式PCR与普通PCR扩增产物的电泳图像。
【具体实施方式】
[0046] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0047] 实施例1
[0048] 本实施例中用于检测犬巴贝西虫的引物组合，由外引物和内引物组成，外引物 为：
[0049] 正向引物：5 ' -GGCTTTCGGTGATTCATA-3 '，
[0050] 反向引物：5, -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3,；
[0051] 内引物为：
[0052] 正向引物：5 ' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3 '，
[0053] 反向引物：5 ' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3 '。
[0054] 实施例2
[0055] 本实施例中用于检测犬巴贝西虫的试剂盒，包括由外引物和内引物组成的引物 组合，以及 Taq 酶 100UU0XPCR Buffer500 μ l、25mmol. T1Mg2+盐 500 μ LUOmmol. PmiX dNTPlOO μ L、IOpmol · μ Γ1弓丨物组合(包括内外引物正反向）各100 μ L、标准品25 μ L及试 剂盒反应条件说明书。
[0056] 所述的外引物为：
[0057] 正向引物：5 ' -GGCTTTCGGTGATTCATA-3 '，
[0058] 反向引物：5, -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3,；
[0059] 所述的内引物为：
[0060] 正向引物：5 ' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3 '，
[0061] 反向引物：5 ' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3 '。
[0062] 实施例3
[0063] 本实施例中检测犬巴贝西虫的方法，包括以下步骤：
[0064] (1)以待检测DNA样品为模板，采用引物组合进行套式PCR扩增，引物组合由外引 物和内引物组成，外引物为：
[0065] 正向引物：5，-GGCTTTCGGTGATTCATA-3，，
[0066] 反向引物：5，-CCTTCCGTCAATTCCTTT-3，，
[0067] 内引物为：
[0068] 正向引物：5，-TGGACCATTCAAGTTTCTG-3，，
[0069] 反向引物：5, -TCGTCTTCGATCCCCTA-3,；
[0070] 第一次PCR扩增的反应体系为：50 μ L体系，Taq酶1U、10XPCR Buffer5 μ L、 25mmol/LMg2 + 4 μ L、10mmol/L mix dNTPI μ L、IOpmoI/ μ L 外引物正反向引物各 I μ L、待检 测DNA样品1 μ L，加 CldH2O至50 μ L，反应程序为：94°C预变性5min，94°C变性30s、56°C退 火30s、72°C延伸lmin，进行25个循环，72°C延伸lOmin，冷却结束反应；
[0071] 第二次PCR扩增的反应体系为：50 μ M本系，Taq酶1U、10XPCR Buffer5 μ L、 25mmol/LMg2 + 4 μ L、10mmol/L mix dNTPl μ L、10pmol/y L 内引物正反向引物各 I μ L、第一 次PCR扩增产物1 μ L，加 CldH2O至50 μ L，反应程序为：95°C预变性5min，94°C变性30s、55°C 退火30s、72°C延伸lmin，进行30个循环，72°C延伸7min，冷却结束反应；
[0072] (2)取5 μ L套式PCR扩增产物在I. 0%ΕΒ染色的琼脂糖凝胶上电泳，电泳电压为 80V，时间为20分钟，电泳后在紫外灯下观察结果，与DNA Marker进行对照，发现在500? 750bp之间出现大小为658bp的特性条带(见图1，图中M为DNA Marker，1、阳性品外引物扩 增产物，2、阳性品内引物扩增产物，3、双蒸水外引物扩增产物，4、双蒸水内引物扩增产物)， 判定该样品中含有犬巴贝西虫遗传物质。
[0073] 试验例1
[0074] 将犬巴贝西虫阳性品、灭菌三蒸水、巴氏杆菌、附红细胞体、弓形虫、链球菌及反应 液中不加模板的阴性对照反应体系置于同一条件下进行套式PCR扩增，具体参见实施例3 中步骤（1)，将第二次PCR扩增产物5 μ L用于进行琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果见图2， 图中自右至左依次为DNA Marker、犬巴贝西虫阳性品套式PCR结果、阴性对照、灭菌三蒸 水、巴氏杆菌、附红细胞体、弓形虫、链球菌及DNA Marker。从图2可知，犬巴贝西虫阳性品 套式PCR结果的特性条带介于Marker750bp与Marker500bp条带之间。其他阴性对照、灭 菌三蒸水、巴氏杆菌、附红细胞体、弓形虫、链球菌未出现近似位置特性条带。
[0075] 试验例2
[0076] 将犬巴贝西虫阳性标准品IO6?10°拷贝作为模板分别加入套式PCR反应体系中， 体系置于同一条件下进行套式PCR扩增，将第二次PCR扩增产物5 μ L用于进行琼脂糖凝胶 电泳检测，同试验例1。电泳结果见图3,图中自右至左依次为DNA Marker、阳性犬DNA制成 的标准品（1?6依次为IO6?10°拷贝样品套式PCR结果）及DNA Marker。从图3可知， IO6?IO1拷贝样品套式PCR结果均出现特异性条带，介于Marker750bp与Marker500bp条 带之间，10°拷贝样品套式PCR结果未出现近似位置特性条带。
[0077] 将犬巴贝西虫阳性标准品IO8?IO1拷贝作为模板分别加入普通PCR反应体系中， 体系置于同一条件下进行普通PCR扩增（具体操作参见专利申请号：201110157247. 0)，将 PCR扩增产物5 μ 1用于进行琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果见图4,图中自右至左依次为 DNAMarker、阳性犬DNA制成的标准品（1?8依次为IO8?IO1拷贝样品套式PCR结果)。从图 4可知，IO 8?IO4拷贝样品PCR结果均出现特异性条带，介于Marker250bp与Marker500bp 条带之间，而IO3?IO1拷贝样品PCR结果未出现近似位置特性条带。
[0078] 试验例3
[0079] 1、发病情况
[0080] 河南某地一小型猎犬，雄性，4岁，已按正常程序免疫。至病情严重入院，临床观察 该犬只精神沉郁，少食或者不食，体温高达40. 5°C，可视粘膜为贫血高度黄疸，尿液呈浓茶 水色。发病前一周曾在山区活动，入院时在犬只耳根处发现蜱虫，疑似血源性原虫感染。但 经镜检未发现虫体，采用普通PCR检测方法也未出现阳性结果(具体操作参见专利申请号： 201110157247. 0)，遂采用套式PCR检测方法，具体步骤为：
[0081] (1)待检测DNA样品的制备：于犬前肢隐静脉取300 μ L抗凝血，采用全血DNA提 取试剂盒（ΤΑΚΑΤΑ公司），按说明书操作方法提取DNA样品；
[0082] (2)以待检测DNA样品为模板，采用引物组合进行套式PCR扩增，引物组合由外引 物和内引物组成，外引物为：
[0083] 正向引物：5，-GGCTTTCGGTGATTCATA-3，，
[0084] 反向引物：5 ' -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3 '，
[0085] 内引物为：
[0086] 正向引物：5，-TGGACCATTCAAGTTTCTG-3，，
[0087] 反向引物：5' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3' ；
[0088] 第一次PCR扩增的反应体系为：50 μ L体系，Taq酶1U、10XPCR Buffer5 μ L、 25mmol/LMg2 + 4 μ L、10mmol/L mix dNTPI μ L、IOpmoI/ μ L 外引物正反向引物各 I μ L、待检 测DNA样品1 μ L，加 CldH2O至50 μ L，反应程序为：94°C预变性5min，94°C变性30s、56°C退 火30s、72°C延伸lmin，进行25个循环，72°C延伸lOmin，冷却结束反应；
[0089] 第二次PCR扩增的反应体系为：50 μ L体系，Taq酶1U、10XPCR Buffer5 μ L、 25mmol/LMg2 + 4 μ L、10mmol/L mix dNTPl μ L、10pmol/y L 内引物正反向引物各 I μ L、第一 次PCR扩增产物1 μ L，加 CldH2O至50 μ L，反应程序为：95°C预变性5min，94°C变性30s、55°C 退火30s、72°C延伸lmin，进行30个循环，72°C延伸7min，冷却结束反应；
[0090] (3)取5 μ L套式PCR扩增产物在I. 0%ΕΒ染色的琼脂糖凝胶上电泳，电泳电压为 80V，时间为20分钟，电泳后在紫外灯下观察结果，与DNA Marker进行对照，发现在500? 750bp之间出现大小为658bp的特性条带(见图5,图中M为DNA Marker，1、DNA样品套式 PCR检测结果，2、DNA样品普通PCR检测结果，3、双蒸水对照，4、阴性对照)，扩增产物的核苷 酸序列如SEQ ID N0:2所示，判定该样品中含有犬巴贝西虫遗传物质。
[0091] 2、诊断与治疗
[0092] 根据流行病学及临床症状观察，由于镜检未发现虫体，结合套式PCR检测结果，初 步判定该犬只感染犬巴贝西虫。
[0093] 试验例4
[0094] 取豫西地区(洛阳、三门峡、平顶山）犬血液样品进行犬巴贝西虫检测，分别采用套 式PCR检测方法及普通PCR检测方法(检测步骤同试验例3)，检测结果详见下表1。
[0095] 表1豫西地区犬血液样品中犬巴贝西虫检测结果
【权利要求】
1. 一种用于检测犬巴贝西虫的引物组合，其特征在于：由外引物和内引物组成，外弓丨 物为： 正向引物：5 ' -GGCTTTCGGTGATTCATA-3 '， 反向引物：5' -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3' ； 内引物为： 正向引物：5 ' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3 '， 反向引物：5' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3'。
2. -种用于检测犬巴贝西虫的试剂盒，其特征在于：主要包括由外引物和内引物组成 的引物组合，外引物为： 正向引物：5' -GGCTTTCGGTGATTCATA-3'， 反向引物：5' -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3' ； 内引物为： 正向引物：5' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3'， 反向引物：5' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3'。
3. 根据权利要求2所述的用于检测犬巴贝西虫的试剂盒，其特征在于：还包括Taq酶、 Mg2+、mix dNTP 及缓冲液。
4. 根据权利要求3所述的用于检测犬巴贝西虫的试剂盒，其特征在于：包括：Taq酶 100比10\卩0?811打6沾0(^1、25臟〇1.171]\%2+盐50(^1^10臟〇1.17 111^叉（1^13各10(^1^ lOpmol · μ I71 引物组合各 100 μ L。
5. -种检测犬巴贝西虫的方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 以待检测DNA样品为模板，采用引物组合进行套式PCR扩增； (2) 取扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳结果判定样品中是否含有犬巴贝西虫； 所述步骤（1)中引物组合由外引物和内引物组成，外引物为： 正向引物：5 ' -GGCTTTCGGTGATTCATA-3 '， 反向引物：5 ' -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3 ' ； 内引物为： 正向引物：5 ' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3 '， 反向引物：5 ' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3 '。
6. 根据权利要求5所述的检测犬巴贝西虫的方法，其特征在于：所述步骤（1)中采用引 物组合进行套式PCR扩增的反应体系为： 第一次PCR:50yL体系，Taq酶 1U、10XPCR Buffer5yL、25mmol/L Mg2 + 4yL、10mmol/ 1^11^(1阶1314 1^、10?111〇1/^1^外引物正反向引物各14 1^、待检测0嫩样品14 1^，加(1(1!120至 50 μ L ； 第二次PCR:50yL体系，Taq酶 1U、10XPCR Buffer5yL、25mmol/L Mg2 + 4yL、10mmol/ L mix (^?14 1^、10?!11〇1/^1^内引物正反向引物各14 1^第一次？0?扩增产物14 1^力口 ddH20 至 50μ L。
7. 根据权利要求6所述的检测犬巴贝西虫的方法，其特征在于：所述的第一次PCR的 反应程序为：941：预变性51^11，941：变性3〇8、561：退火3〇8、721：延伸11^11，进行25个循 环，72°C延伸lOmin，冷却结束反应。
8. 根据权利要求6所述的检测犬巴贝西虫的方法，其特征在于：所述的第二次PCR的 反应程序为：95°C预变性5min，94°C变性30s、55°C退火30s、72°C延伸lmin，进行30个循 环，72°C延伸7min，冷却结束反应。
9. 根据权利要求5所述的检测犬巴贝西虫的方法，其特征在于：所述步骤（2)中凝胶电 泳采用1. 〇%EB染色的琼脂糖凝胶。
【文档编号】C12Q1/68GK104293903SQ201410105100
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】杨自军, 尚泽松, 张才, 贺鹏飞, 田丽萍, 汪纪仓, 王宏伟, 刘凤军, 爨淑楠 申请人:河南科技大学