具有改善生长特征的木本植物以及使用转录因子制备它们的方法

具有改善生长特征的木本植物以及使用转录因子制备它们的方法
【专利摘要】本发明涉及用于从使用生物信息学工具、来自EST测序和DNA阵列的数据鉴定的大量候选基因中选择具有可能的商业价值表型的基因的新型大规模分析平台。本发明的一个方面提供了产生相比于野生型具有提高的生长的转基因植物的方法。所述方法包括在植物中改变在木质形成的不同阶段中特异性表达的至少一种基因的基因产物水平。这可以使用转基因方法或特定杂交方法进行。本发明的另一些方面提供了具有根据本发明调节的基因表达的植物细胞或植物后代和木材。另一些方面涉及包含本发明核苷酸序列的DNA构建体以及包含所述DNA构建体的植物细胞或植物后代。
【专利说明】具有改善生长特征的木本植物以及使用转录因子制备它们的方法
[0001]本申请是申请日为2008年12月18日、申请号为“200880127543.2”、发明名称为“具有改善生长特征的木本植物以及使用转录因子制备它们的方法”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT / SE2008 / 051495的中国国家阶段申请。
发明领域
[0002] 本发明一般地涉及分子生物学领域，还涉及改善植物生长特征的方法。更具体地说，本发明涉及用于表型修饰植物和转基因植物以及通过特定杂交方法获得的植物的方法，所述植物具有改变的基因表达，其导致改变的生长表型。本发明还提供了可用于本发明方法的构建体。另外，本发明涉及所述植物的植物细胞或植物后代，以及本发明的植物产生的木材。
【背景技术】
[0003]目前，林木工程和分子育种的主要目标是改进木材的品质和产量。全球对木制品的需要每年增长约1.7%，尽管已经达到或超过全球森林的最大可持续收获率，但是木材消耗量仍在增加。因此，需要提高全世界的种植木材生产。作为对日益增加的大气CO2的响应，林业栽植还具有作为碳回收作物(carbon sequestration crop)的优点。类似地,希望来自非木本植物的生物质生产的增加，例如以满足对能源生产原料的需要。因此，改变高等植物细胞发育过程中的特定过程具有很大的商业价值，这不仅是指改善树木的特性，还包括其它植物。
[0004]通过顶端分生组织实现的植物生长使得一系列初生组织发育，还使得茎和根伸长。除了初生生长外，木本物种还发生次生生长，从形成层产生次生组织“木质”。次生生长提闻了莖和根的周长。
[0005]多年生植物例如长寿树种具有显著不同于一年生植物例如拟南芥(Arabidopsis)的生活方式，因为多年生植物例如树具有无限的生长，而诸如拟南芥的植物在植物开花时生长终止。拟南芥植株的最终尺寸在许多方面取决于从萌芽到开花和结籽的发育程序。一个实例是这些事件发生时间的任何变化可显著改变植物的大小。
[0006]多年生植物还在活跃生长期和休眠期之间循环。在活跃生长期间，叶进行光合作用，捕获能量，然后其用于驱动多种细胞过程。转化为蔗糖的固定碳输送到茎组织和顶芽，在休眠状态期间存储在这里，最初作为淀粉，后来作为蔗糖。随着休眠解除之后生长重新开始，该蔗糖转移至活跃生长的组织，因为复苏的早期阶段在光合作用开始之前进行。类似地，对于氮，氨基酸也转移到茎和顶端组织，在休眠期间储存为贮藏蛋白，随着生长的开始发生分解。因此，长寿树种的生活周期与一年生作物有显著差异，一年生作物经常将碳和氮转移到种子中。由于一年生作物和多年生植物例如树的这些差异，产量的决定因素和测量它们的能力很可能有很大差异。事实上，在许多情况下，模式系统(如欧美杨(PopulustremulaX tremuloides))更可靠地发现可用于增加生物质生产的基因。例如,对于一年生作物，已经提出将种子大小/产量作为植物大小和生产力的度量，但是情况不太可能是这样，因为多年生植物例如树木要花费数年才能开花，因此，种子产量(即便是的话)仅仅是在植物开花的年份中占优势的生长条件指示。所以，直接转用一年生作物中的研究和发现不太可能对树木有用。
[0007]树木生物质中非常重要的一部分存在于茎组织中。此生物质的积累是叶的光合作用和氮获得以及营养再分配到多种细胞过程的结果。因此，叶的大小、叶光合作用、根系获得氮能力的大小都可以是决定植物生产力和生物质生产的重要因素。但是，仅用它们自身并不能解释整个生物质生产。例如，叶大小并不总是与生物质相关，因为叶大小可存在显著的变化。此外，作物应对胁迫的能力是生物质生产的重要决定因素。因此，为了提高树木的生物质生产，需要改变几种因素。
[0008]此外，木质密度是生物质生产提高的重要性状，木质密度的提高使得运输体积减少,并且单位体积中含有更多的能量含量。因此，即使总生物质不增加,增加密度也是有意义的。密度的重要性还在于其显示出，高度和直径可测量生长的提高并不与木质密度的减少相偶联。
[0009]一种增加生长的方式是了解更多的基因功能并且使用这些信息增加生长和生物质生产。这些基因功能的知识和使用这些知识的方法描述于本专利中。
[0010]大多数基因已在许多植物中得到鉴定，例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Arabidopsis Genome Initiative2000)和欧美杨(Populus tremulaX tremuloides)(Sterky 等 2004)以及毛果杨(Populus trich ocarpa) (Tuskan 等 2006)。
[0011]Hertzberg等2001和Schrader等2005已经使用转录谱分析来显示木质部发育过程中数千个基因的转录序位(transcriptional hierarchy)并提供表达数据。这些数据可利于进一步阐明具有未知功能的许多基因White等1999 ；Aharoni等2000。
[0012]仍存在的一个问题是如何鉴定参与调节细胞分裂以及其它生长相关过程的可能最重要的基因。在本发明中，我们检测了许多转录因子的用途，在过表达时其导致出人意料的生长增加。选择转录因子进行分析的原因是已知它们在活生物(包括植物)中是许多(如果不是大多数的话)过程的部分调节子。预计，拟南芥含有1500种不同的转录因子，根据序列同源性其可分为约30个亚类(Riechmann等2000)。某些转录因子在植物中的功能与所调节的基因紧密相关，例如，尽管转录因子亚类(如MYB类)中的转录因子是相似的，但是已知它们调节植物中若干不同的过程。转录因子是通过抑制或活化特定基因或含有不同基因的基因组区域的转录起始来调苄基因转录的蛋白质。
[0013]特别地，以前已经有过在植物中靶向转录因子，以发现可用于改变植物特征的基因。例如在W002 / 15675中，分析了很多转录因子，并提到了它们中许多的可能应用。US2007 / 0039070描述并列出了很多按树(Eucalyptus)和福射松(Pinus radiata)的转录因子基因，并推测了这些基因的用途。本文中，我们给出了在显著增加生长方面具有工业意义效果的特定转录因子，并有实验数据的支持。
[0014]尽管，从使用DNA阵列技术进行的表达研究、基因组测序和EST程序得到的结果显然可验证基因在何处何时表达，但是仅从这些类型的分析工具不太可能阐明基因的生物和/或技术功能。为了分析和验证基因功能，必须进行功能表征，例如通过基因失活和/或基因过表达来实现。但是 ，为了能够鉴定目的基因以及最出人意料的商业特征，必须基于功能性分析以及用多种标准测量生长增加来评价候选基因。
[0015]MYB转录因子。本文给出的基因之一(SEQ ID NO:12)属于MYB类转录因子。在拟南芥中，MYB转录因子家族预计有约180个成员(Riechmann等2000)。在植物中已经发现了MYB基因的几种不同功能(Jin和Martinl999)。更具体地说，就我们所知，与SEQ ID NO:12密切相关的基因未显示出参与调节生长速度和生物质生产。密切相关的基因AT2G01060和AB192880显示参与生物胁迫应答，US2003101481和Katou等2005。
[0016]SET结构域转录因子(Ng等2007)。本文给出的基因之一 SEQ ID NO:11属于SET结构域类转录因子。SET结构域蛋白质通过调节染色质结构来调节转录。已知拟南芥基因组含有至少29种有活性的set结构域蛋白。就我们所知，与SEQ ID N0:11密切相关的基因未显示出参与调节生长速度和生物质生产。
[0017]bHLH类转录调节子在植物中是一个大的转录因子类别，例如在拟南芥中，预计有约139个成员(Riechmann等2000)。bHLH蛋白已经显示参与了许多不同的过程,有关水稻中的综述参见Xiaoxing等2006。本文给出的基因之一 SEQ ID NO: 10属于bHLH类转录因子。就我们所知，与SEQ ID:10密切相关的基因未显示出参与调节生长速度和生物质生产。
[0018] 基因SEQ ID:9属于同源盒(Homeobox)类基因。与使用构建体TF0013过表达的基因最接近的拟南芥同源物预计为AT1G23380。与使用构建体TF0013过表达之基因相关的马铃薯(Solarium tuberosum)同源物的过表达降低了生长、节间长度和叶片大小(US7265263)。过表达与构建体TF0013过表达之基因相关的拟南芥同源物改变了叶片形态(US7265263, US20070022495和W001036444)。通过改变构建体TF0013过表达的基因的表达水平来提高产量和生物质生产，这在之前是未知的。
[0019]IAA / AUX类转录因子是主要发现于植物中的一小类转录因子(预计在拟南芥中有26个成员，Riechmann等2000)。对应于SEQID:13的基因属于该类，其由Moyle等2002描述。就我们所知，与SEQ ID:13密切相关的基因未显示参与调节生长速度和生物质生产。
[0020]WRKY基因家族。WRKY转录因子家族在植物中是一个大的基因家族。预计水稻中有超过90个成员，预计拟南芥有74个成员(Ulker和SomSSich2004)。与WRKY基因最相关的功能之一是伤口和病原体防御信号转导，以及与非生物胁迫相关的信号转导，和针对非生物和生物胁迫的抗性。
[0021]本文给出的基因中有八个属于WRKY类转录因子。
[0022]SEQ ID:4和SEQ ID:7属于WRKY基因的一个亚类。就我们所知，与SEQ ID:4和SEQ ID:7密切相关的基因未显示出参与调节生长速度和生物质生产。
[0023]SEQ ID:1属于WRKY基因的另一个亚类。与基因SEQ ID:1密切相关的拟南芥同源物(AT2G23320)被认为参与C / N感受(US20060272060)、改变叶片大小(US7238860、US20030226173、US20040019927 和 TO02015675)以及改变种子蛋白质含量(US20030226173)。根据专利申请W004087952，还认为AT2G23320参与对过氧化物胁迫的反应和适应。US20040019927、US7238860、US20030226173、W002015675 提到基因 AT2G23320涉及叶片大小提闻和树闻增加，并推测该基因的过表达可用于增加生长和生物质生广。在本文中我们显示，SEQ ID:1可用于树木中，从而以工业显著程度增加生长。
[0024]SEQ ID:6属于WRKY基因的一个亚类，该亚类与SEQ ID:1所属亚类相关，但是明显不同于这一基因类别。与该基因密切相关的基因已知在拟南芥中是基础抗性的负调节物。Journot-Catalino等2006。认为密切相关的基因AT4G31550与种子异戊二烯基脂类和种子叶黄素水平相关(US20060195944和US20070022495以及W001035727)。另一个预测的SEQID:6的拟南芥同源物AT2G24570被认为参与C / N感受(US20070022495和20060272060)。就我们所知，与SEQ ID:6密切相关的基因未显示出参与调节生长速度和生
物质生产。
[0025]SEQ ID:2属于WRKY基因的另一个亚类。就我们所知，与SEQ ID:2密切相关的基因未显示出参与调节生长速度和生物质生产。
[0026]SEQ ID:3和SEQ ID:5属于一个大的含有2个WRKY结构域的WRKY基因类别。根据专利申请W02007003409，SEQ ID:3和SEQ ID:5的许多含有两个WRKY结构域的相关同源物被认为在水稻(Oryza sativa)中参与改变种子产量和花数。通过改变表达水平来提高生长和生物质生产的用途之前是未知的。
[0027]SEQ ID:8属于WRKY基因的另一个亚类。密切相关的拟南芥基因AT4G23810已知减少植物大小，并参与改变种子蛋白质含量(US20030226173)。另一个相关的拟南芥同源物(ATSG24110)已知参与改变种子蛋白质含量和诱导早开花(US20030226173)。就我们所知，与SEQID:8密切相关的基因未显示出参与调节生长速度和生物质生产。

【发明内容】

[0028]本发明涉及可用于增加生长的新基因。通过使用着眼于基于多种标准的组合来分析生长行为的分析平台发现了所述基因。本发明提供了产生转基因植物的方法，其通过改变选自满足所述标准的一组基因的一种或多种基因的表达来实现。因此，本发明涉及用于表型修饰植物和转基因植物以及通过特异性杂交方法获得的植物的方法，所述植物具有改变的基因表达，从而导致修饰的生长表型。本发明还提供了用于本发明方法的构建体。另外，本发明涉及所述植物的植物细胞或植物后代，以及本发明植物产生的具有出人意料的优良性能的木材。
[0029]使用该分析平台分析的许多基因显示令人感兴趣的并且经常是出人意料的商业特性。因此，本发明的一个方面提供了产生与其野生型相比具有出人意料高生长的植物的方法，其包括改变(增加)植物中属于转录因子序列SEQ ID:1-13、97-115之一的至少一种基因的基因产物的水平。
[0030]可通过将在温室中在18小时光周期、22°C / 15°C (白天/夜晚)的温度下培养八周且每周用1:100稀释的Weibulls Rika S NPK7-1-5施肥的一组转基因植物与相同条件下培养的一组野生型植物进行比较，来观察所述生长的增加。
[0031]本发明的另一个方面提供了本发明的转基因植物或者有意改变(增加)了 SEQID:1-13,97-115之一种基因的水平并包含重组多核苷酸的植物的植物细胞或植物后代。
[0032]本发明的另一个方面提供了由具有如上所述特征的目的植物产生的生物质和其产物。
[0033]本发明的另一个方面提供了包含至少一种本文所述序列的DNA构建体。
[0034]最后，本发明的一方面提供了包含根据本发明的DNA构建体的植物细胞或植物后代。【专利附图】

【附图说明】
[0035]图1显示了具有所示四种不同数据点线性回归线的高度生长曲线实例，黑色回归线显示最大高度生长速度。
[0036]发明详述
[0037]定义
[0038]在详细讨论本发明之前，首先定义下列术语和习惯用语:
[0039]术语“转基因植物”指含有在相同物种、变种或栽培种的野生型植物中不存在的遗传物质的植物。所述遗传物质可包括转基因、插入诱变事件(例如通过转座子或T-DNA插入诱变)、活化标签序列、突变序列、同源重组事件或通过嵌合修复术(chimeraplasty)修饰的序列。通常，外源遗传材料是通过人为操纵引入植物中的。该术语还指已经插入遗传物质作为选择标记的植物。这些选择标记的实例包括卡那霉素、潮霉素、膦丝菌素、氯磺隆、甲氨蝶呤、庆大霉素、大观霉素、咪唑啉酮、d-氨基酸和草甘膦。
[0040]在本发明上下文中，术语“生长”包括初生生长，其包括茎和根的延长，还包括植物的次生生长， 其包括从形成层产生次生组织——“木质”，以及茎和根周长的增加。因此，“提高的生长”这一表述在上下文中涉及在相同生长条件下生长时，转基因植物与转基因植物所来源的野生型植物相比生长的提高。如下所述，如果植物满足下文实施例中所定义的“生长差异选择标准”至少之一的话，则转基因植物表征为具有提高的生长。
[0041]术语“表型”在本文上下文中指单个植物的总体物理表现，例如生长。上下文中所用的不同生长表型的实例列于下表1.2中。
[0042]术语“基因”广义地表示与生物学功能相关的任何DNA区段。基因包括编码序列和/或其表达所需的调节序列。基因还包括非表达DNA核酸区段，其例如形成其它蛋白质的识别序列(例如启动子、增强子或其它调节区)。可从多种来源获得基因，包括从目的来源克隆或者从已知或预测的序列信息合成，并且可包括设计具有所需参数的序列。
[0043]“过表达”表示由引入宿主细胞的SEQ ID NO: 1_13、97_115的DNA或类似序列编码的多肽或蛋白质的表达，其中所述多肽或蛋白质通常不存在于宿主细胞中，或者其中所述多肽或蛋白质以高于通常编码所述多肽或蛋白质的内源基因所表达的水平存在于所述宿主细胞中。
[0044]本发明蛋白质的过表达可通过下述方式实现，首先构建嵌合基因，其中编码区与能够指导基因在所需发育阶段在所需组织中表达的启动子有效连接。嵌合基因可包含来源于相同基因的启动子序列和翻译前导序列。还可提供编码转录终止信号的3'非编码序列。本嵌合基因还可包含一个或多个内含子以利于基因表达。合适的启动子可以是CaMV35S启动子，其可与作为载体的农杆菌(Agrobacterium) —起使用。
[0045]术语“RNA干扰”或“RNAi ” 一般表示双链RNA分子或短发夹RNA改变与其具有显著同源性或完全同源性的核酸序列之表达的方法。
[0046]术语“RNAi下调”表示一种或多种RNAi物质介导的核酸序列表达减少。术语“RNAi物质”表示引发RNAi的独特RNA序列。
[0047]术语“光周期”指每天的光照和黑暗周期。
[0048]术语“核酸构建体”、“DNA构建体”和“载体”表示用于转化植物或其它生物的基因序列。核酸构建体或DNA构建体可以能在转化植物中指导蛋白质或核酸序列的表达，例如反义RNA。通常，这些核酸构建体或DNA构建体至少包含与Y和:V翻译调节元件有效连接的预期基因产物编码区或者预期核酸产物。在一些实施方案中，这些核酸构建体或DNA构建体是嵌合的，即由来自不同来源的序列混合物组成。但是，非嵌合核酸构建体或DNA构建体也可用于本发明。
[0049]在与例如细胞、核苷酸、载体、蛋白质或多肽一起使用时，术语“重组的”通常表示所述细胞、核苷酸或载体已通过引入异源(或外源)核酸或者改变天然核酸而被修饰，或者表示所述蛋白质或多肽已通过引入异源氨基酸而被修饰，或者所述细胞来源于经这些修饰的细胞。重组细胞表达在天然(非重组)形式细胞中不存在的核酸序列(例如基因)，或者表达异常低表达或者根本不表达的天然核酸序列(例如基因)。术语“重组的”在修饰细胞时表示该细胞复制异源核酸，或者表达异源核酸所编码的肽或蛋白质。重组细胞可含有天然(非重组)形式细胞中不存在的基因。重组细胞还可含有天然形式细胞中存在的基因，其中所述基因通过人工手段进行了修饰并重新引入细胞中。该术语还涵盖下列细胞，其含有经修饰的细胞内源核酸,而不从该细胞除去所述核酸；这些修饰包括通过基因替换、定点突变和相关技术获得的修饰。
[0050]术语“核酸序列”表示单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的多聚体。除非具体限定，否则该术语涵盖含有已知天然核苷酸类似物的核酸序列，所述类似物具有与参考核酸 相似的结合特性，并且以类似于天然核苷酸的方式代谢。除非另有陈述，否则特定的核酸序列还暗示涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子替换)和互补序列以及明确显示的序列。
[0051]“多核苷酸”是包含多个聚合的核苷酸残基的核酸序列，例如至少约15个连续的聚合核苷酸残基，任选地至少约30个连续核苷酸，至少约50个连续核苷酸。在许多情况中，多核苷酸包括编码多肽(或蛋白质)或其结构域或片段的核苷酸序列。另外，所述多核苷酸可包含启动子、内含子、增强子区、多腺苷酸化位点、翻译起始位点、5'或3'非翻译区、报告基因、选择标记等。多核苷酸可以是单链或双链DNA或RNA。多核苷酸任选地包含修饰碱基或经修饰主链。多核苷酸可以是例如基因组DNA或RNA、转录本(例如mRNA)、cDNA、PCR产物、克隆的DNA、合成的DNA或RNA等。多核苷酸可包括有义或反义方向的序列。
[0052]术语“多肽”广义地用于定义直链氨基酸残基，包括天然的及其合成类似物。
[0053]在本发明上下文中，“互补”表示两个核苷酸序列彼此精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸某些位置的核苷酸能够与DNA或RNA分子对应位置的核苷酸形成氢键，则该寡核苷酸和DNA或RNA被认为在该位置彼此互补。在寡核苷酸中足够个数的核苷酸可与靶DNA或RNA中对应核苷酸形成氢键使得形成稳定复合物时，认为DNA或RNA链彼此互补。
[0054]因此，在上下文中，表述“互补序列”或“互补”还表示将在严格条件下与本发明的核酸分子退火的核苷酸序列。
[0055]术语“严格条件”指高严格、弱严格或低严格的一般条件。
[0056]术语“严格度”是本领域中公知的，用于表示进行核酸杂交的条件(温度、离子强度以及其他化合物例如有机溶剂的存在情况)。与“弱”或“低”严格度条件相比，使用“高严格度”条件时，仅在具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间会发生核酸碱基配对。测试杂交的合适条件包括在5 X SSC中预浸泡，以及在20%甲酰胺、5 XDenhardt溶液、50mM磷酸钠、pH6.8和50mg变性超声处理的小牛胸腺DNA的溶液中在约40°C下预杂交I小时，然后在添加了 IOOmM ATP的相同溶液中在约40°C下杂交18小时，之后用2XSSC、0.2% SDS在40°C下清洗滤膜30分钟(低严格度)，优选50°C (中严格度)，更优选65°C (高严格度)，甚至更优选约75°C (非常高的严格度)。有关杂交方法的更多细节可见于SambiOOk等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor, 1989。
[0057]术语“杂交”广义地用于表示互补或部分互补的核酸序列之间的结合，例如使其分离的变性过程的反转。杂交通过互补核苷或核苷酸碱基之间的氢键键合发生，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen、反Hoogsteen氢键键合等。DNA中常见的四种核苷碱基是G、A、T和C，其中G与C配对，A与T配对。在RNA中，T被尿嘧啶(U)代替，其与A配对。核苷碱基中参与形成标准双链体的化学基团组成Watson-Crick面。数年之后,Hoogsteen显示嘌呤核苷碱基(G和A)除了沃森-克里克面之外还具有Hoogsteen面，其可从双链体外被识另O，并且用于通过氢键键合结合嘧啶寡核苷酸，由此形成三螺旋结构。
[0058]“子序列”或“片段”是完整序列的任何一部分。因此，片段或子序列指分别包含较长氨基酸序列(例如多肽)或核酸(例如多核苷酸)的一部分的氨基酸或核酸序列。
[0059]在本文上下文中，术语“同源性”表示两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相似性，其由参数“序列同一性”描述。
[0060]术语“序列同一性”表示相同长度的两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间同源性程度的定量测量。如果比较不同长度的两个序列，则它们必须将其进行比对以给出最佳可能匹配，允许插入缺口或者在多肽序列或核苷酸序列末端截短。序列同一性可以通过
【权利要求】
1.产生与其野生型相比生长和/或生物质受到调节的植物的方法，其包括改变该植物中至少一种基因的基因产物水平，所述基因包含选自下列的核苷酸序列: a)SEQ ID NO:1_10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)与SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。
2.根据权利要求1的方法，所述方法步骤包括: (i)提供包含选自下列的核苷酸序列的表达载体 a)SEQ ID NO:1-10、12、13、97_115 的核苷酸序列；或 b)与SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列；或 c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，以及 d)与所述多核苷酸序列有效连接的至少一个调节元件，其中所述至少一个调节元件控制所述多核苷酸序列在靶植物中的表达； (?)将所述表达载体引入至少一种植物中；和 (iii)选择与其野生型相比生长和/或生物质受到调节的至少一种转基因植物。
3.根据权利要求1的方法，其包括 i)选择表达选自下列的至少一种核苷酸序列的植物物种 a)SEQ ID NO:1_10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)与SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段， ?)将i)中选择的植物物种与i)中选择的相同或另一植物物种进行杂交， iii)选择与i)中所选植物物种相比至少一种选自下列的核苷酸序列的表达受到调节的植物 a)SEQ ID NO:1-10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)与SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段， iv)任选地，将iii)中所得植物回交一次或多次，并选择与任何i)中所用植物物种和/或iii)中所得植物相比至少一种选自下列的核苷酸序列的表达受到调节的植物 a)SEQ ID NO:1_10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)与SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述受到调节的表达通过引入遗传修饰来实现，优选在编码包含SEQ ID NO:1-10、12、13、97-115多肽或这些多肽之同源物的基因座中引入。
5.根据权利要求4的方法，其中所述修饰通过下列之一来实现:使用SEQID NO:1-10,.12、13、97-115中一种或多种作为该方法任何步骤中的标记物的T-DNA活化、TILLING、同源重组、定点诱变或定向育种。
6.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述调节是生长和/或生物质的产量提高。
7.根据权利要求1、2、4-6中任一项的方法，其包括提供重组DNA构建体的步骤，所述构建体包含选自下列的核苷酸序列: a)包含选自SEQID NO:1-10、12、13、97-115之序列的核苷酸序列； b)与核苷酸序列a)互补的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段； d)与a)、b)和c)中任一序列具有至少60%同一'丨生的核酸序列；和 e)在严格条件下与核苷酸序列a)、b)或c)杂交的核苷酸序列。
8.根据权利要求1、2、4-7中任一项的方法，其中所述核苷酸序列编码包含多肽(a)的保守性替换变体的多肽。
9.根据权利要求1、2、4-8中任一项的方法，其中所述核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替换。
10.根据权利要求1、2、4-9中任一项的方法，其中所述子序列或片段与权利要求7的(a)中所述核苷酸序列的保守结构域具有至少65%的序列同一性。
11.根据权利要求7至10中任一项的方法，其中所述重组DNA构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性启动子。
12.根据权利要求7至10中任一项的方法，其中所述重组DNA构建体在包含权利要求7所定义核苷酸序列的转录盒之前还包含强组成型启动子，所述转录盒之后是植物功能性内含子，之后是反向的权利要求4中所定义核苷酸序列。
13.根据权利要求7至12中任一项的方法，其中所述方法还包括用所述重组DNA构建体转化植物的可再生细胞以及从所述转化细胞再生转基因植物的步骤。
14.与其野生型相比生长和/或生物质受到调节的植物，其包含能够改变该植物中至少一种基因的基因产物水平的核苷酸，其中所述至少一种基因包含选自下列的核苷酸序列: a)SEQ ID NO:1_10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)与SEQID NO:1-10、12、13、97-115的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。
15.转基因植物，其包含重组多核苷酸(DNA构建体)，所述重组多核苷酸(DNA构建体)包含选自下列的核苷酸序列: a)包含选自SEQID NO:1-10、12、13、97-115之序列的核苷酸序列； b)与核苷酸序列a)互补的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段； d)与a)、b)和c)中任一序列具有至少60%同一'丨生的核酸序列；和 e)在严格条件下与核苷酸序列a)、b)或c)杂交的核苷酸序列。
16.根据权利要求15的转基因植物，其中所述核苷酸序列编码包含a)或d)多肽之保守性替换变体的多肽。
17.根据权利要求15至16中任一项的转基因植物,其中核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替换。
18.根据权利要求15至17中任一项的转基因植物，其中所述子序列或片段与权利要求16所述核苷酸序列的保守结构域具有至少65%的序列同一性。
19.根据权利要求15至18中任一项的转基因植物，其中所述重组DNA构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性启动子。
20.根据权利要求14至19中任一项的转基因植物，其中所述重组DNA构建体在包含权利要求4中所定义核苷酸序列的转录盒之前还包含强组成型启动子，所述转录盒之后是植物功能性内含子，之后是反向的权利要求16中所定义核苷酸序列。
21.植物的植物细胞或植物后代，所述植物可以是根据权利要求14至20中任一项的转基因植物。
22.植物生产的木材，所述植物可以是根据权利要求14至20中任一项的转基因植物。
23.DNA构建体，其包含权利要求7至10所述的至少一种序列。
24.植物细胞或植物后代，其包含权利要求23的DNA构建体。
25.权利要求1-24中任一项的核苷酸序列，其中所述a)的序列选自SEQIDNO:1、4、6、7、9、10、101、102、104、106 和 107。
【文档编号】C12N15/11GK103911392SQ201410108913
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2008年12月18日 优先权日:2007年12月28日
【发明者】芒努斯·赫茨贝里, 里希凯希·巴勒劳, 大卫·约恩森, 利努斯·默勒, 帕埃尔·琼森 申请人:瑞典树木科技公司