三七细胞悬浮培养的方法
【专利摘要】本发明公开了一种三七细胞悬浮培养的方法，包括如下步骤：1）三七根灭菌及愈伤组织的诱导：2）选择步骤1）经筛选、传代后的生长速度快、质地松散、嫩白色透明状的愈伤组织转移到液体培养基中进行悬浮培养，添加新鲜液体培养基，培养6-8天，将悬浮的大块愈伤组织过滤除去，滤过的悬浮细胞于更换后的液体培养基中继续悬浮培养，筛选分散度好、均匀、生长快、淡黄色透明的悬浮细胞作为种子，将种子于更换后的液体培养基中继续悬浮培养，获得高产皂苷的细胞株，本发明的方法具有快速可行，可以提供均一培养物的优点。工艺简单，成本低廉，重复性好。在短期内生产次级代谢物皂苷含量高。
【专利说明】三七细胞悬浮培养的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种三七细胞悬浮培养的方法，属于中药三七组织培养领域。
【背景技术】
[0002]三七[Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen]系五加科人参属植物，是我国特产的名贵药材之一，主产于云南文山，已有四百多年的栽培历史，是著名云南白药的重要成分，其具有滋补强壮，止血，活血化瘀，消肿止痛，抗肝炎，降压，降血脂，降血糖，抗衰老等多方面的药理作用和保健功能，开发前景广阔。三七虽早有栽培，但由于三七生态适应性差、地理分布窄、生长周期长，且种子寿命极短，常有严重的病虫害，给新品种的选育及大量繁殖带来了困难。三七的主要药用成分之一是皂苷，迄今三七的皂苷和多糖尚未人工合成。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能在人为控制条件下大量繁殖细胞，在短期内生产次级代谢物皂苷；另一方面为三七的快速繁殖、种质保存和生物技术育种提供技术支持的三七细胞悬浮培养的方法。
[0004]本发明的技术方案概述如下:
[0005]一种三七细胞悬浮培养的方法，包括如下步骤:
[0006]I)三七根灭菌及愈伤组织的诱导:将三七的根用清水洗净后，烘干，在超净工作台中用酒精喷洒三七根表面，火焰灼烧灭菌，用灭过菌的解剖刀在三七根表面割I~2cm的切口，并沿切口断开，把表皮内部的组织切成小块接到固体培养基上，在23±2°C，暗培养55-65天，再每隔4周继代培养一次，继代培养的次数为3-5次，进行筛选、传代；
[0007]2)三七细胞悬浮培养:选择步骤I)经筛选、传代后的生长速度快、质地松散、嫩白色透明状的愈伤组织按接种量为20g/L-25g/L转移到液体培养基中进行悬浮培养，每3-5天添加相当于所述液体培养基体积5%的新鲜液体培养基，培养6-8天，将悬浮的大块愈伤组织用纱布过滤除去，滤过的悬浮细胞按接种量为20g/L-25g/L于更换后的液体培养基中继续悬浮培养，每隔19-21天继代一次，筛选分散度好、均匀、生长快、淡黄色透明的悬浮细胞作为种子，将种子按接种量为20g/L-25g/L于更换后的液体培养基中继续悬浮培养，每隔19-21天继代一次，共继代3-5次，获得高产皂苷的细胞株，所述悬浮培养的条件:转速为110-130r.HiirT1的摇床培养，1000mL三角瓶中装400mL液体培养基，培养温度为23±2°C。
[0008]液体培养基用下述方法制成:在IL的MS液体培养基中加入2.0mg的2，4_ 二氯苯氧基乙酸，加入1.5mg苄基腺嘌呤，加入30g蔗糖，调pH=5.8~6.0，灭菌。
[0009]固体培养基用下述方法制成:在IL的MS液体培养基中加入2.0mg的2，4-二氯苯氧基乙酸，加入1.5mg苄基腺嘌呤，加入30g蔗糖，加入6~7g琼脂，调pH=5.8~6.0，灭菌。
[0010]本发明的优点:
[0011]本发明的方法具有快速可行，可以提供均一培养物的优点。工艺简单，成本低廉，重复性好。在短期内生产次级代谢物皂苷含量高。
【具体实施方式】
[0012]下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
[0013]本发明的三七根购于云南文山。
[0014]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0015]实施例1
[0016]液体培养基的制备方法为:
[0017]在IL的MS液体培养基中加入2.0mg的2，4_ 二氯苯氧基乙酸，加入1.5mg苄基腺嘌呤，加入30g蔗糖，调pH=5.8，在121 °C，0.1MP压力下灭菌25分钟备用。
[0018]实施例2
[0019]液体培养基的制备方法为:
[0020]在IL的MS液体培养基中加入2.0mg的2，4_ 二氯苯氧基乙酸，加入1.5mg苄基腺嘌呤，加入30g蔗糖，调pH=5.9，在121 °C，0.1MP压力下灭菌25分钟备用。
[0021]实施例3
[0022]液体培养基的制备方法为:
[0023]在IL的MS液体培养基中加入2.0mg的2，4_ 二氯苯氧基乙酸，加入1.5mg苄基腺嘌呤，加入30g蔗糖，调pH=6.0，在121 °C，0.1MP压力下灭菌25分钟备用。
[0024] MS液体培养基配方见表1.[0025]表1
[0026]
【权利要求】
1.一种三七细胞悬浮培养的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)三七根灭菌及愈伤组织的诱导:将三七的根用清水洗净后，烘干，在超净工作台中用酒精喷洒三七根表面，火焰灼烧灭菌，用灭过菌的解剖刀在三七根表面割I~2cm的切口，并沿切口断开，把表皮内部的组织切成小块接到固体培养基上，在23±2°C，暗培养55-65天，再每隔4周继代培养一次，继代培养的次数为3-5次，进行筛选、传代； 2)三七细胞悬浮培养:选择步骤I)经筛选、传代后的生长速度快、质地松散、嫩白色透明状的愈伤组织按接种量为20g/L-25g/L转移到液体培养基中进行悬浮培养，每3-5天添加相当于所述液体培养基体积5%的新鲜液体培养基，培养6-8天，将悬浮的大块愈伤组织用纱布过滤除去，滤过的悬浮细胞按接种量为20g/L-25g/L于更换后的液体培养基中继续悬浮培养，每隔19-21天继代一次，筛选分散度好、均匀、生长快、淡黄色透明的悬浮细胞作为种子，将种子按接种量为20g/L-25g/L于更换后的液体培养基中继续悬浮培养，每隔19-21天继代一次，共继代3-5次，获得高产皂苷的细胞株，所述悬浮培养的条件:转速为110-130r.HiirT1的摇床培养，1000mL三角瓶中装400mL液体培养基，培养温度为23±2°C。
2.根据权利要求1所述的一种三七细胞悬浮培养的方法，其特征是所述液体培养基用下述方法制成:在IL的MS液体培养基中加入2.0mg的2,4-二氯苯氧基乙酸,加入1.5mg苄基腺嘌呤，加入30g 蔗糖，调pH=5.8~6.0，灭菌。
3.根据权利要求1所述的一种三七细胞悬浮培养的方法，其特征是所述固体培养基用下述方法制成:在IL的MS液体培养基中加入2.0mg的2,4- 二氯苯氧基乙酸,加入1.5mg苄基腺嘌呤，加入30g蔗糖，加入6~7g琼脂，调pH=5.8~6.0，灭菌。
【文档编号】C12N5/02GK103923874SQ201410113439
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2014年3月25日
【发明者】高文远, 李静, 王娟 申请人:天津大学