一株弧菌fc509菌株及其培养方法与应用的制作方法

一株弧菌fc509菌株及其培养方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株弧菌FC509菌株及其培养方法与应用。该菌株于2014年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC?NO.8913，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明首次分离得到的弧菌（Vibrio?sp.）FC509菌株，可以制备糖胺聚糖裂解酶，该酶对透明质酸的比活为110,000U/mg、对硫酸软骨素的比活为45,000U/mg；酶活力是已知商品化糖胺聚糖裂解酶的几十到上百倍，可应用于医药及化妆品等领域，具有广阔的应用前景。
【专利说明】一株弧菌FC509菌株及其培养方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株弧菌FC509菌株及其培养方法与应用，属于微生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]糖胺聚糖(Proteoglycans, GAG)又称为粘多糖，是重复二糖单位组成的直链多糖。主要包括透明质酸(Hyaluronic Acid, HA),肝素/硫酸乙酰肝素(Heparin/HeparanSulfate, Hep/HS),硫酸软骨素 / 硫酸皮肤素(Chondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate,CS/DS),硫酸角质素(Keratan Sulfate, KS)。除硫酸角质素的二糖单位是由中性的D-半乳糖和N-乙酰葡糖胺组成以外，其它糖胺聚糖的二糖单位均是由己糖醛酸(D-葡萄糖醛酸/L-艾杜糖醛酸)与己糖胺(N-乙酰氨葡萄糖胺/N-乙酰半乳糖胺)组成。其中透明质酸结构相对简单，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成的二糖单位经β -1, 4-糖苷键连接而成。其它糖胺聚糖则由于各种修饰酶的作用使糖链变得异常复杂，主要表现在糖链中不同部位羟基(-0Η)和氨基(-ΝΗ2)的硫酸化，D-葡萄糖醛酸在C5-差向异构酶的作用下转变为L-艾杜糖醛酸，己糖胺二位氨基的乙酰化等。糖胺聚糖糖链结构的这种高度复杂性不是随机发生的，而是具有高度的时空特异性，是各种糖链合成相关酶在不同细胞组织和器官的不同发育阶段表达调控水平所致，不同的结构使其具有不同的功能，结构的复杂性赋予其功能的多样性。
[0003]糖胺聚糖广泛存在于动物细胞细胞表面和细胞基质中，通过与各种蛋白的特异相互作用参与了细胞的增值和分化、细胞间的识别、细胞转移、组织形态发生、癌变等各种生理和病理过程(Knudson and Knudsonl993, Perrimon and Bernfield2000, Karbownik andNowak2013)糖胺聚糖所具有的一系列重要的生物学功能使其成为重要的生物活性分子，在医药及功能食品中得到广泛应用，如肝素、硫酸软骨素、透明质酸(Noble2002，Jiang, Lianget al.2007)等。但由于糖胺聚糖结构的不均一'丨生，特别是硫酸化糖胺聚糖结构的高度复杂性，使不同来源和不同批次的同一种糖胺聚糖在活性上存在很大差异(Sugahara, Mikamiet al.2003) 0近年来的大量研究表明，糖胺聚糖的生物功能是通过多糖链中具有特殊结构的功能区与特定蛋白的特异相互作用来实现的，同一多糖链中存在不同结构的功能区，与不同的蛋白相互作用可以行使不同的功能，因此可以通过选择性部分降解糖胺聚糖多糖链，制备结构均一或相对均一的特定功能区寡糖用于医药及功能食品，该类产品不但结构和活性确定，而且还由于分子量小利于吸收而大大提高了利用率。
[0004]糖胺聚糖降解酶是研究糖胺聚糖构效关系的重要工具酶，主要包括微生物来源的裂解酶系和动物来源的水解酶系。根据底物的不同可分为透明质酸酶、硫酸软骨素/硫酸皮肤素降解酶、肝素/硫酸乙酰肝素降解酶、硫酸角质素降解酶四大类，其中大部分透明质酸酶可以同时降解非硫酸化及N-乙酰半乳糖胺4位(CS-A)或6 (CS-C)位羟基硫酸化的低硫酸化度硫酸软骨素区段，但降解速度远低于降解透明质酸。如来自绵羊和牛睾丸的透明质酸水解酶(Zaneveld, Polakoski et al.1973),可以在酸性PH下将透明质酸完全降解为四糖和六糖。而来自链霉菌的透明质酸裂解酶则只能降解透明质酸，终产物是非还原端带不饱和双键的四糖和六糖(Ohya and Kanekol970)。在动物体内一直未发现专一的硫酸软骨素/硫酸皮肤素降解酶家族，越来越多的研究显示哺乳动物体内硫酸软骨素/硫酸皮素的降解主要是由透明质酸酶家族的一些酶来完成的，最近透明质酸酶家族成员HYAL4被鉴定为一个硫酸软骨素水解酶(Yamada, Sugahara et al.2011) ?微生物来源的硫酸软骨素裂解酶(CSase),如CSase ABC和CSaseAC都表现出一定的透明质酸降解活性,但CSaseB是高度专一性硫酸皮肤素降解酶，对硫酸软骨素和透明质酸均无降解活性。利用各种糖胺聚糖降解酶所具有的不同底物选择性和产物多样性，可以对结构复杂的糖胺聚糖进行组成结构和功能研究，结合各种分离分析手段对多糖链中与靶蛋白结合的特定功能区进行鉴定，并最终用于高活性药用及功能寡糖的酶法制备。
[0005]糖胺聚糖作为胞外基质的主要组成成分构成了细胞与外界的一道防护屏障，保护机体细胞免受损伤，但是在疾病治疗中，致密的胞外基质抑制了药物在组织中的通透性和有效扩散，降低了药物的起效时间和疗效，尤其是对一些大分子药物，如胰岛素和抗体等蛋白类药物。多年来，透明质酸酶被广泛应用于临床，目前有三种美国食品与药品管理局(FDA)批准的商品化透明质酸酶可以利用，分别是牛睾丸来源的Amphadase,绵羊睾丸来源的Vitrase,和近来刚上市的人重组透明质酸酶Hylenex。临床上透明质酸酶的主要用途包括:作为助剂促进其它药物的吸收和扩散(Schuller, Castonguay et al.1991)；用于液体皮下灌注；用于透明质酸填充整形手术意外中透明质酸的降解消除；用于治疗与糖胺聚糖代谢紊乱蓄积相关的顽固性皮肤病，如糖尿病性硬肿症、硬皮病、瘢痕疙瘩等(PCT publications W000/38732 ；W001/45743;and German Patent N0.19963538)(Lee, Grummer et al.2010)。此外,大量报道证明,硫酸软骨素酶CSase ABC可以通过降解硫酸软骨素促进神经损伤中神经元轴突再生(Moon, Asher et al.2001, Bradbury, Moon etal.2002, Kwok, Afshari et al.2008, Bradbury and Carter2011)? [0006]综上所述，糖胺聚糖降解酶不仅是糖胺聚糖结构功能研究必不可少的工具，而且在糖胺聚糖活性寡糖制备和疾病治疗中有着重要的应用价值。但目前具有应用价值的高活力糖胺聚糖降解酶很少，因此从新型糖胺聚糖降解菌中分离和鉴定新型高效稳定的糖胺聚糖降解酶具有重要意义。

【发明内容】

[0007]本发明针对现有技术的不足，提供一株弧菌FC509菌株及其培养方法与应用。
[0008]一株弧菌(Vibrio sp.)FC509菌株，2014年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC N0.8913，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0009]弧菌(Vibrio sp.)FC509菌株，革兰染色阴性，细菌略弯曲，长0.8~3μπκ宽
0.5~1.5 μ m无芽胞和荚膜，有菌毛和一根单鞭毛，运动非常活泼。悬滴观察，可见其呈穿梭运动。
[0010]上述弧菌(Vibrio sp.) FC509菌株的培养方法,步骤如下:
[0011](I)取弧菌(Vibrio sp.)FC509菌株接种至液体培养基中，在温度为25~30°C、转数为150~300rpm的条件下,摇床培养8~16小时,制得种子液；
[0012](2)取步骤(1)制得的种子液，按5~10%的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25~30°C，溶氧为25~30%的条件下，扩大培养2~5小时，制得弧菌(Vibrio sp.)FC509菌液。
[0013]根据本发明优选的，所述液体培养基每升组分如下:
[0014]碳源I~10g、胰蛋白胨5~15g、酵母提取物3~8g、NaC120~40g、KH2P042~5g、K2HP045 ~10g、(NH4)2SO4I ~5g、MgSO4.7H201 ~5mg、FeSO4.7H202 ~4mg, pH 值为 6.5 ~
7.5 ；
[0015]所述碳源选自硫酸软骨素、透明质酸或肝素中的一种。
[0016]上述弧菌(Vibrio sp.)FC509菌株在制备糖胺聚糖裂解酶中的应用。
[0017]上述应用，步骤如下:
[0018](I)取弧菌(Vibrio sp.) FC509菌株接种至液体培养基中，在温度为25~30°C、转数为150~300rpm的条件下,摇床培养8~16小时,制得种子液；
[0019](2)取步骤(1)制得的种子液，按5~10%的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25~30°C，溶氧(即溶解氧饱和度)为25~30%的条件下，扩大培养2~5小时，加入硫酸软骨素，使硫酸软骨素的质量浓度为0.01~0.02%，继续培养24~72小时，制得弧菌(Vibrio sp.) FC509菌株发酵液；
[0020](3)取步骤(3)制得的弧菌(Vibrio sp.)FC509菌株发酵液，经固液分离，取液体，加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度为80%，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液进行透析去除硫酸铵，制得糖胺聚糖裂解酶。
[0021]根据本发明优选的，所述的固液分离为离心，条件为:12，000rpm离心20min。
[0022]有益效果
[0023]本发明首次分离得到的弧菌(Vibrio sp.)FC509菌株，可以制备糖胺聚糖裂解酶，该酶对透明质酸的比活为110，OOOU/mg、对硫酸软骨素的比活为45，000U/mg ;酶活力是已知商品化糖胺聚糖裂解酶的几十到上百倍，可应用于医药及化妆品等领域，具有广阔的应用前景。
【专利附图】

【附图说明】
[0024]图1、糖胺聚糖裂解酶HCDase的蛋白质三维结构模型；
[0025]图2、重组糖胺聚糖裂解酶HCDase表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)；
[0026]其中:M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD ;泳道1、对照菌株破壁前菌体，上样量10 μ L，泳道2、重组菌破壁前菌体，上样量10 μ L，泳道3、重组菌破壁后上清，上样量10 μ L，泳道4、经镍柱纯化的HCDase，上样量10 μ Lo
[0027]图3、ρ H值对糖胺聚糖裂解酶HCDase的活性影响曲线；
[0028]图4、温度对糖胺聚糖裂解酶HCDase的活性影响曲线；
[0029]图5、温度对糖胺聚糖裂解酶HCDase的稳定性影响曲线；
[0030]图6、pH值对糖胺聚糖裂解酶HCDase的稳定性影响曲线；
[0031]图7、金属离子对糖胺聚糖裂解酶HCDase活性的影响柱形图；
[0032] 图8、糖胺聚糖裂解酶HCDase降解透明质酸和硫酸软骨素所得产物的HPLC分析图；
[0033]图9、糖胺聚糖裂解酶HCDase不同时间降解透明质酸所得产物的HPLC分析图。
[0034]图10、FC509菌株的显微照片。
【具体实施方式】
[0035]以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中各参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。
[0036]实施例1、弧菌(Vibrio sp.) FC509菌株的获得
[0037]一株弧菌(Vibrio sp.)FC509菌株，2014年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC N0.8913，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0038]取土壤浸出液，上清液I mL加入到9mL无菌水中，稀释成合适10-1、10-2、10_3、10-4、10-5、10-6的浓度梯度，然后通过常规的稀释法或划线法接种涂布于唯一碳源分离培养基上，细菌培养于30°C恒温培养I天，菌落计数，然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落，重复划线接种于相应的全营养琼脂平板上，直至纯化得到单菌落，然后转接于相应的琼脂斜面上，以备后用。
[0039]把培养出来的菌 株，分别接种到唯一碳源液体培养基上，进行培养。200rpm30°C培养72h，观察菌液浑浊情况，以及取培养上清进行咔唑反应检测碳源的消耗情况。依据上述两个指标选择产酶菌株。将在各唯一碳源培养基中均浑浊以及咔唑反应数值较小的菌株挑取到全营养培养基上培养，并保种记为FC509。
[0040]所述的弧菌(Vibrio sp.)FC509菌株，革兰染色阴性，细菌略弯曲，长0.8~3μπκ宽0.5~1.5 μ m无芽胞和荚膜，有菌毛和一根单鞭毛，运动非常活泼。悬滴观察，可见其呈穿梭运动(如图10所示)。
[0041]上述唯一碳源培养基成分如下:
[0042]NaC130g、KH2P043g、K2HP047g、(NH4) 2S042g、MgSO4.7H205mg、FeSO4.7H202mg，硫酸软骨素5g，pH值为7.2。
[0043]实施例2、
[0044]弧菌(Vibrio sp.) FC509菌株的培养方法,步骤如下:
[0045](I)取弧菌(Vibrio sp.) FC509菌株接种至液体培养基中，在温度为28~30°C、转数为200rpm的条件下,摇床培养10小时,制得种子液；
[0046](2)取步骤(1)制得的种子液，按5~10%的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25~30°C，溶氧为30%的条件下，扩大培养2小时，制得弧菌(Vibrio sp.)FC509菌液。
[0047]根据本发明优选的，所述液体培养基每升组分如下:
[0048]硫酸软骨素5g、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaC130g、KH2P043g、K2HP047g、(NH4) 2S042g、MgSO4.7H205mg、FeSO4.7H202mg, pH 值为 7.2。
[0049]实施例3、[0050]弧菌(Vibrio sp.) FC509菌株在制备糖胺聚糖裂解酶中的应用，步骤如下:
[0051](I)取弧菌(Vibrio sp.) FC509菌株接种至液体培养基中，在温度为25~28°C、转数为300rpm的条件下,摇床培养16小时,制得种子液；
[0052](2)取步骤(1)制得的种子液，按5~10%的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25~30°C，溶氧为25%的条件下，扩大培养5小时，加入硫酸软骨素，使硫酸软骨素的质量浓度为0.01~0.02%,继续培养72小时，制得弧菌(Vibrio sp.) FC509菌株发酵液；
[0053](3)取步骤(3)制得的弧菌(Vibrio sp.)FC509菌株发酵液，经固液分离，取液体，加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度为80%，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液进行透析去除硫酸铵，制得糖胺聚糖裂解酶。
[0054]根据本发明优选的，所述的固液分离为离心，条件为12，000rpm20min。
[0055]酶活力单位定义:每分钟催化糖胺聚糖产生IymoL不饱和双键所需要的酶量。根据紫外法测糖胺聚糖裂酶酶活的方法(Yamagata, Saito et al.1968),测得Vibriosp.FC509菌株的液体培养基中酶活为3，000U/mL。
[0056]弧菌(Vibrio sp.) FC509菌株基因组DNA的提取 [0057]将弧菌(Vibrio sp.)FC509菌株接种至液体培养基(同实施例1)中，在30°C、200rpm的条件下，振荡培养至OD6tltl=0.8 ;取培养菌液40mL,在12，OOOrmp条件下离心25min,收集菌体沉淀，用20mL的溶菌酶缓冲液(IOmM Tris-HCl pH8.0)洗涤，在12，OOOrmp条件下离心25min，收集菌体沉淀；
[0058]上述菌体沉淀中，每管加入溶菌酶缓冲液12.0mL,得到约14.0mL的菌液，分别加入浓度为20mg/mL的溶菌酶各560 μ L，其终浓度约800 μ g/mL ;冰浴1.0h后，37°C温浴2h，至溶液粘稠；加入10wt%SDS0.82mL, 100mg/mL的蛋白酶K溶液60 μ L，52 °C水浴l.0h ;加Λ Tris-平衡过的酚/氯仿/异戊醇(体积比25:24:1) 15mL，轻轻颠倒混匀，至充分乳化；10，000g、4°C条件下离心10min，转移上清，加入2.0mL的NaAc-HAc (pH5.2,3.0Μ)缓冲液，以及17.0mL的无水乙醇，混匀；用1.0mL的枪头挑出丝状DNA，转移至1.5mL的EP离心管中，以70%乙醇(贮于-20 V),洗潘2次，微离心后弃上清；10，000g、4°C条件下离心3min，彻底弃掉上清；样品于无菌工作台中，酒精灯下风吹干燥；用无菌去离子水重悬溶解DNA样品，4°C过夜，得到大分子量基因组DNA。
[0059]弧菌(Vibrio sp.)FC509菌株基因组扫描及其序列分析。
[0060]将实施例2制得的大分子量基因组DNA进行测序(美吉生物公司)。用NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbl.nlm.nih.gov/)上的软件对测序结果进行分析。所用到的NCBI分析软件是Open Reading Frame Finder(0RF Finder,http://www.ncbl.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和Basic Local AlignmentSearch Tool (BLAST, http://blast.ncbl.nlm.nih.gov/Blast.cgi)0
[0061]NCBI分析结果显示Vibrio sp.FC509菌株基因组上携带一个糖胺聚糖裂解酶基因hcdase, hcdase基因编码区长2436bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。与Vibriofischeri ES114 的全基因组序列(NCBI 注册号:YP_206952.1)中 hyaluronate Iyase 基因的384个氨基酸有49%的同源性。
[0062]hcdase基因编码的糖胺聚糖裂解酶HCDase由778个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所不，蛋白质的理论分子量约为89kD。用Simple Modular ArchitectureResearch TooKSMART, http://smart.embl_heidelberg.de/)分析糖胺聚糖裂解酶 HCDase的结构信息，结果显示N端第I至第22个氨基酸是信号肽序列，第23-778位氨基酸序列属于糖胺聚糖裂解酶超家族。用SWISS-MODEL同源建模服务器(http://swissmodel.expasy.0rg)对糖胺聚糖裂解酶HCDase的蛋白质三维结构进行同源建模,最终得到的HCDase蛋白质三维结构模型如图1所示。
[0063]实施例4、HCDsae基因在大肠杆菌中的重组表达
[0064]以实施例2制得的大分子量基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物如下:
[0065]正向引物HCDase-F:GCCATGGATATGCAAGCGATGACCACCAGTTCACTG ；
[0066]反向引物HCDase-R:GCTCGAGTCGCACTGAAAATTGATAACTTTGTCC ；
[0067]正向引物下划线标注的是限制性内切酶Nco I位点，反向引物下划线标注的是限制性内切酶Xho I位点。Primerstar HS DNA聚合酶购自宝生物公司，PCR反应体系按照公司提供的产品说明操作。
[0068]PCR 反应条件:94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，68°C 1.5min，35 个循环；72°C延伸IOmin0
[0069]将PCR产物用Nco I和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切的PCR产物。将购于美国Novagen公司的产物pET_22b载体用Nco I和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切载体大片段。Nco I和Xho I均购于宝生物公司，酶与底物反应的体系、温度和时间均按照公司提供的产品说明操作。
[0070]将经过双酶切的PCR产物与同样经过双酶切pET_22b载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株后涂布于含有50 μ g/mL氨节青霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37°C培养14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有50 μ g/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养,提取质粒；将质粒用正向引物HCDase-F和反向引物HCDase-R进行菌液PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒送去生工生物公司测序，结果表明，在pET-22b的Nco I和Xho I酶切位点之间插入SEQ ID N0.1所示的hcdsae基因，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pET22b-HCDase。
[0071]将pET22b_HCDase转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Novagen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行重组糖胺聚糖裂解酶HCDase诱导表达。并用NiSepharose6Fast Flow (GE)凝胶对HCDase进行纯化,纯化条件按照GE公司的产品手册操作。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组糖胺聚糖裂解酶HCDase的纯化情况，结果如图2所示，纯化后的重组糖胺聚糖裂解酶HCDase在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。
[0072]实施例5、重组糖胺聚糖裂解酶HCDase的酶学性质分析
[0073]pH和温度对酶活性的影响
[0074]将质量浓度为1%透明质酸或硫酸软骨素底物、HCDase酶液、不同pH值的150mMHAc-NaAc、NaH2PO4-Na2HPO4、Tris-HCl 缓冲液以及水(pH 范围为 5.0 ~10.0)，按 2:1:3:4 (体积比)的比例混合后，在30°C反应60min，按前述的紫外法测酶活力。结果显示HCDsae在ρΗ8.0时达到最大活力，表明HCDase的最适反应pH为8.0 (如图3)。
[0075]在最适pH下，将 质量浓度为1%透明质酸或硫酸软骨素底物、HCDase酶液以及150mMNaH2P04-Na2HP04缓冲液(pH8.0)按2:1:3:4 (体积比)的比例混合，分别在不同温度(0°C~90°C)反应lOmin，按前述的紫外法测酶活力。结果显示HCDase在30°C时达到最大活力，表明HCDase的最适反应温度为30°C (如图4)。
[0076]pH和温度对酶稳定性的影响
[0077]将在不同温度((TC~70°C)下热处理Ih后的HCDase酶液与质量浓度为1%透明质酸或硫酸软骨素底物溶液按2:3 (体积比)的比例混合，然后在最适温度和最适pH下测定剩余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100%相对活力(relativie activity),结果表明HCDase在低于60°C的温度下具有较好的热稳定性(如图5)。
[0078]将在30°C，不同的pH (pH5~10)预孵育Ih后的HCDase酶液与质量浓度为1%透明质酸或硫酸软骨素底物溶液按2:3 (体积比)的比例混合，然后在最适温度和最适pH下测定剩余酶活，以不经过pH处理的酶液酶活定义为100%相对活力(relativie activity),结果显示在PH5-9的范围内，HCDase酶活仍保持60%以上，表明HCDase对pH值耐受范围较广(如图6)。
[0079]金属离子对HCDsae活性的影响[0080]将质量浓度为1%透明质酸或硫酸软骨素底物、HCDase酶液、150mM Tris-HCl缓冲液以及水按2:1:3:4 (体积比)的比例混合后，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的离子终浓度为ImM或10mM，然后在30°C反应60min，按前述的紫外法测酶活力。对照组为不加任何金属离子时HCDase的活性(设定为100%),结果图7所示。实验结果显示，K+、Na+、Fe2+、Mn2+ 能增加 HCDase 活性，Li+、Mg2+、Co2+、Ni2+、Cr3+、Fe3+ 对 HCDase 活性基本无影响，Ag+、Cu2+、Ca2+、Fe2+、Hg2+、Pb2+、Zn2+等其他离子对酶活呈现抑制作用(图7)。
[0081]实施例6、HCDase的酶活测定
[0082]将质量浓度为1%透明质酸或硫酸软骨素底物、HCDase酶液、150mM Tris-HCl缓冲液以及水按2:1:3 -A (体积比)的比例混合后，在最适温度和最适pH下反应2-10min,按前述的紫外法测酶活力(Yamagata, Saito et al.1968),同时用购于康为世纪公司的蛋白质定量试剂盒测定HCDase酶液的蛋白含量，结果表明重组HCDase对透明质酸的比活为110，OOOU/mg、对硫酸软骨素的比活为45，OOOU/mg。
[0083]实施例7、HCDase降解糖胺聚糖降解产物的高效液相(HPLC)分析
[0084]将质量浓度为1%透明质酸或硫酸软骨素底物、HCDase酶液、150mM Tris-HCl缓冲液以及水按2:1:3:4 (体积比)的比例混合后，在pH8.0，30°C条件下反应，选取不同酶解时间(0、0.25、l、5、15、30、120min)的产物进行HPLC分析。HPLC分析条件为凝胶柱:superdexpeptidel0/300GL (GE);流动相:0.2M 碳酸氢铵；流速:0.4mL/min ;检测条件:UV232nm。
[0085]结果如图8和图9所示，从图9可以看出随着降解时间的增加，产物聚合度随降解时间的延长而快速降低，最终转变成二糖。该结果表明HCDase属于内切糖胺聚糖裂解酶，可被用于糖胺聚糖寡糖的制备以及糖胺聚糖构效关系研究。
[0086]实施例8、糖胺聚糖裂解酶HCDase在药物中的应用
[0087]糖胺聚糖裂解酶HCDase可以用于增强药物的吸收或/和递送，包括但不限于经过皮肤途径辅助药物渗透。示例性的药物包括皮质类固醇如氢化可的松、泼尼松龙、倍氯米松丙酸酯、氟米松、去炎松、氯倍他索丙酸酯等；镇痛药和/或抗炎剂如对乙酰氨基酚、甲灭酸、氟芬那酸、双氯芬酸、双氯芬酸钠、阿氯芬酸、羟布宗、保泰松、布洛芬、氟比洛芬、水杨酸、薄荷醇、樟脑、萘普生等；抗高血压药如吲哚洛尔、茚诺洛尔、心痛定等；抗生素如青霉素、四环素、土霉素、新霉素、红霉素、氯霉素等；麻醉剂如利多卡因、苯佐卡因等以及其他药物。
[0088]通过敷布，纱布，或其它皮肤涂抹途径施用糖胺聚糖裂解酶。糖胺聚糖裂解酶溶液可以涂敷到合适的敷贴上(如5-6层纱布)。敷贴应覆盖受损区域，且敷贴本身用蜡纸或绷带固定。应用的制剂的量取决于损伤的面积，通常为5-lOOIU/cm2。敷贴应每天使用12-24小时，连续使用10-100天。
[0089]对于局部使用，溶液，悬浮液，凝胶剂，糊剂，软膏，乳膏或糖胺聚糖裂解酶的其他配方(有或没有另外的活性剂，都可以使用)。溶液等配方中包含制药和化妆品领域用于局部使用可接受的稀释剂，辅助剂和赋形剂的，这些其它配方主要包括缓冲剂如磷酸盐，柠檬酸盐，醋酸盐和其它有机酸盐、抗氧化剂如抗坏血酸、肽、蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，天然的或合成的油；氨基酸如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括纤维素或其衍生物，葡萄糖，乳糖，甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA ;糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；无机盐，如氯化钠，和非离子表面活性剂如吐温、聚乙二醇。
[0090]一种优选的，糖胺聚糖裂解酶制剂是糖胺聚糖裂解酶HCDase的冻干粉末悬浮或溶解在含有0.1% -10%蔗糖、1% -20%甘油的溶剂中，溶液的pH保持在6.5-8.5范围内。[0091 ] 糖胺聚糖裂解酶组合物可以通过口服给药或肠胃外给药，并且糖胺聚糖裂解酶组合物可以与合适的递送载体结合后给药。
[0092]可通过活性化合物与固体赋形剂的组合获得用于口服使用的糖胺聚糖裂解酶药物制剂。选择上述的混合物加入合适的附助剂混合使用。如果需要的话，合适的赋形剂是碳水化合物或蛋白质，例如糖、纤维素、牛血清白蛋白等。
[0093]糖胺聚糖裂解酶酶与药物(如氢化可的松，抗生素，维生素)组合。以口服凝胶剂，膏剂，或悬浮液的形式通过静脉内，皮下或肌内注射给药；或以软膏剂，乳膏剂，面罩局部给药；以及用作化妆品辅助剂，用于增强皮肤的吸收。
[0094]说明书中涉及的参考文献
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【权利要求】
1.一株弧菌(Vibrio sp.)FC509菌株，2014年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC N0.8913，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述弧菌(Vibriosp.)FC509菌株的培养方法，其特征在于，步骤如下: (1)取弧菌(Vibriosp.)FC509菌株接种至液体培养基中，在温度为25~30°C、转数为150~300rpm的条件下,摇床培养8~16小时,制得种子液； (2)取步骤(1)制得的种子液，按5~10%的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25~30°C，溶氧为25~30%的条件下，扩大培养2~5小时，制得弧菌(Vibrio sp.)FC509菌液。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基每升组分如下: 碳源I~10g、胰蛋白胨5~15g、酵母提取物3~8g、NaC120~40g、KH2P042~5g、K2HP045 ~10g、(NH4)2SO4I ~5g、MgSO4.7H201 ~5mg、FeSO4.7H202 ~4mg, pH 值为 6.5 ~7.5 ； 所述碳源选自硫酸软骨素、透明质酸或肝素中的一种。
4.权利要求1所述弧菌(Vibriosp.) FC509菌株在制备糖胺聚糖裂解酶中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤如下: (1)取弧菌(Vibriosp.)FC509菌株接种至液体培养基中，在温度为25~30°C、转数为150~300rpm的条件下,摇床培养8~16小时,制得种子液； (2)取步骤(1)制得的种子液，按5~10%的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25~30°C，溶氧为25~30%的条件下，扩大培养2~5小时，加入硫酸软骨素，使硫酸软骨素的质量浓度为0.01~0.02%,继续培养24~72小时，制得弧菌(Vibrio sp.)FC509菌株发酵液； (3)取步骤(3)制得的弧菌(Vibriosp.)FC509菌株发酵液，经固液分离，取液体，加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度为80%，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液进行透析去除硫酸铵，制得糖胺聚糖裂解酶。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的固液分离为离心，条件为12，000rpm20mino
【文档编号】C12R1/63GK103923857SQ201410159983
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】李福川, 韩文君, 王文爽, 赵梅 申请人:山东大学