蚊媒病毒常温收集、保存和检测方法
【专利摘要】蚊媒病毒常温收集、保存和检测方法，属于病毒的收集、保存及检测。本发明利用蚊虫吮吸糖液过程中唾液反吐同时排出病毒的生物学特性，把捕捉的蚊虫放入青霉素瓶中，并设计与蚊虫数量适应的纱笼和一定浓度的糖液饱和滴加RNA保存液的滤纸，在常温下以滤纸为病毒RNA载体收集病毒，于常温保存载体7天内进行实验室检测，分析准确，改变了冷链技术野外运输、携带和保存的麻烦，提高了病毒收集、保存效率，节省了人力物力。
【专利说明】蚊媒病毒常温收集、保存和检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于病毒的收集、保存及检测，特别是蚊媒病毒收集、保存及检测。
【背景技术】
[0002]媒介蚊虫携带的病原微生物中，病毒是引起严重疾病的主要的致病因而广受关注，如乙脑病毒、登革热病毒等。蚊虫监测只是蚊媒病监测的一个方面，要准确预测蚊媒病流行风险，其中重要的是掌握媒介蚊虫携带病原微生物的种类和数量。目前对蚊媒病毒监测的主要手段是对媒介蚊虫体内的病毒进行检测，该方法需要大量搜集蚊虫，并要求有冷链技术来保存蚊虫体内病毒的完整性，以带回实验室进行病毒提取分离、血清学及免疫学实验等，或者进行病毒RNA分析[Ritchie SA, et al.，2007]。在野外运输和携带上，冷链技术采用的液氮罐重量大，具有危险且使用不方便；在检测分析上，由于病毒RNA分析容易受蚊虫自身RNA干扰，病毒分离效率低，血清学和免疫学检测灵敏度不高；同时，搜集大量蚊虫进行病毒分析是一 项费力、费钱的工作，因而，需要有新的技术来替代目前的蚊媒病毒监测技术。
【发明内容】
[0003]本发明利用蚊虫取食过程中唾液反吐同时排出病毒的生物学特性，收集病毒，并将病毒RNA在常温下保存于载体7天以上，完成实验室检测，以提高病毒分离效率，节省人力和物力。
[0004]本发明的方法通过以下方式实现，其步骤为:
(1)在疑似蚊媒致病病毒区域，捕捉30-200只同一种类或不同种类的蚊虫并逐一地放入青霉素小瓶中，过夜，饥饿后，待进入步骤(2);
(2)按以下两种方法之一收集病毒:
(a)室温24~27°C下，把定性滤纸剪成3cm2若干份作为收集病毒的载体，每份滤纸中央标记滴加RNA保存液的位置，取若干个干净培养皿加10%蔗糖水，把医用棉球浸泡在培养皿中，将滤纸放在棉球上，再在滤纸标记位置滴加0.25ml RNA保存液，按每份滤纸30-70只蚊虫将步骤I)存活的蚊虫驱入放有培养皿的15~30cm3纱笼内，让蚊虫取食，每天换一次滤纸，共5~7天；
或者，(b)把步骤I)蚊虫按48小时间隔分批收集于青霉素小管中，-85°C冻存，用空斑试验检测蚊虫的感染病毒滴度，收集病毒液；之后，把定性滤纸剪成3cm2若干份作为收集病毒的载体，每份滤纸中央标记滴加RNA保存液和病毒液的位置，取若干个干净培养皿，放置医用棉球，将滤纸放在棉球上，在滤纸标记位置滴加0.25ml RNA保存液,再取病毒液于同一位置滴加0.25ml ；
(3)病毒保存
将步骤2) (a)蚊虫取食过的滤纸或步骤2) (b)滴加了蚊虫病毒液的滤纸作为病毒载体在室温24~27°C下分别放置，并在7天内进行检测；(4) 对被蚊虫取食过的载体提取病毒RNA
用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒规定方式提取病毒RNA ；
(5)PCR扩增及检测
设计PCR反应体系的病毒菌的5’，3’端保守序列引物及该引物的PCR反应条件；以PCR
反应产物凝胶成像及测序鉴定。
[0005]所述的方法的步骤I)进一步是捕捉的蚊虫置于青霉素瓶中过夜，使其饥饿；翌日，将存活的蚊虫驱入纱笼内，供8%蔗糖水，纱笼内温度24~27°C，昼夜温差<2°C，相对湿度70%~80%，光照时间12~14h，使其存活。
[0006]作为上述方法一种应用是乙脑病毒收集、保存及检测:步骤2)之(b)当感染的乙脑病毒液的病毒滴度为7.85 log PFU / ml时，收集病毒液。
[0007]所述的应用，其特征是所述步骤4) PCR扩增PCR反应体系(单位:微升)为=MgCl25 微升，Buffer 2.5 微升，dNTP 2.5 微升，Pl 0.5 微升，P2 0.5 微升，P3 0.5 微升，R I 微升，F I微升，模板RNA 4微升，H2O 7.5微升；该PCR反应体系以JE-251F和JE-925R为基因扩增引物，其中:
F: CGT TCT TCA AGT TTA CAg CAT TAG C ；
R: CCY RTG TTY CTG CCA AGC ATC CAM CC ；
PCR反应条件:①50°C 30分钟；(D 94°C 5分钟；(D 95°C解链30秒；(D 52°C退火I分钟；@72°C延伸60秒③~④45个循环；?72°C延伸15分钟；鉴定基因扩增片段为乙脑病毒条带700bp。
[0008]本发明利用蚊虫吮吸糖水过程中唾液反吐的同时也排出病毒的生物学特性，收集病毒，并将其病毒RNA保存于载体上，在常温保存7天之内供实验室分析检测。
[0009]本发明具有以下进步和意义:
以下图1飞随机抽样保存天数的诱导表达1%琼脂糖凝胶电泳分析结果表明:本发明利用蚊虫吮吸糖液过程中唾液反吐同时排出病毒的生物学特性，设计与蚊虫数量适应的纱笼和一定浓度的糖液饱和滤纸以在常温下收集病毒，并于常温中保存蚊虫病毒RNA载体在7天内随机地进行实验室检测，改变了冷链技术野外运输、携带和保存的麻烦，提高了病毒收集、保存效率，结果准确，节省了人力物力。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是本发明三带喙库蚊和致倦库蚊经口感染乙脑病毒常温保存第7天的PCR的凝胶照片。图中1:标准分子量蛋白质，2:诱导表达第7天的提取物。
[0011]图2是本发明减少三带喙库蚊和致倦库蚊数量经口感染乙脑病毒常温保存第3、4与5天PCR的凝胶照片。图中I为标准分子量病毒核酸,2、3、4为诱导表达第3、4与5天的提取物。
[0012]图3是本发明按方法(b)收集、保存及检测三带喙库蚊和致倦库蚊经口感染乙脑病毒常温保存后第6天和7天PCR的凝胶照片。图中I为标准分子量病毒核酸，2、3分别为诱导表达第6、7天的提取物。
[0013]图4是本发明感染乙脑病毒的三带喙库蚊以滤纸为载体在常温下保存I天的PCR检测的凝胶照片。图中I为标准分子量病毒核酸，2为诱导表达第I天的提取物。[0014]图5是本发明感染乙脑病毒的三带喙库蚊以滤纸为载体在常温下分别保存2天和7天的PCR检测的凝胶照片。图中I为标准分子量病毒核酸，2、3分别为诱导表达第2天和7天的提取物。
[0015]图1飞随机抽样保存天数的诱导表达结果表明:以载体提取病毒RNA扩增出的目的条带均为674bp左右，与预计的乙脑病毒引物扩增的cDNA片断大小相符，故使用该载体和方法能完成对蚊媒病毒的收集、保存和检测。
[0016]以下结合实施例对本发明做进一步说明，实施例包括但不限制本发明请求保护的内容。
【具体实施方式】
[0017]实施例1:
按方法(a)收集、保存及检测三 带喙库蚊和致倦库蚊经口感染乙脑病毒。
[0018]( I)用乙脑野毒株病毒的蚊虫感染实验模拟疑似蚊媒致病病毒区域捕捉的蚊虫。
[0019]在30cm3纱笼中放入若干个米粒大的饱吸乙脑病毒液的棉花球，该病毒液的乙脑毒株为乙脑野毒株中山(Nak)株，病毒滴度7.85 log PFU/ml，将羽化后I天、经24h饥饿的三带喙库蚊和致倦库蚊雌蚊228只驱入纱笼内，让蚊虫吮吸(经口感染)，过夜，翌日，将存活的蚊虫驱入青霉素瓶内过夜，青霉素瓶置于温度24~27°C，昼夜温差<2°C，相对湿度70%~80%屋内，给予光照12~14h，并提供8%蔗糖水，感染3天。
[0020]以存活的库蚊作为在疑似蚊媒致病病毒区域捕捉的蚊虫逐一地放入青霉素小瓶中，过夜，饥饿后，待进入步骤(2)。
[0021](2)收集病毒:
室温24~27°C下，把定性滤纸剪成3cm2共3份作为收集病毒的载体，每份滤纸中央标记滴加RNA保存液的位置，取3个干净培养皿加10%蔗糖水，把医用棉球浸泡在培养皿中，将滤纸放在棉球上，再在滤纸标记位置滴加0.25ml RNA保存液，按每份滤纸70只蚊虫将步骤
I)存活的蚊虫驱入放有培养皿的15~30cm3纱笼内，让蚊虫取食，每天换一次滤纸，共5天。
[0022](3)病毒保存:
将步骤2) (a)蚊虫取食过的滤纸作为病毒载体在室温24~27°C下分别放置，在第7天进行检测。
[0023](4)对被蚊虫取食过的载体提取病毒RNA:
使用AxyPr印体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(爱思进生物技术杭州有限公司)包括:①用灭菌手术剪将滤纸剪碎，放入1.5ml离心管中。取500ul MEM液进行洗脱，漩涡振荡5min, 12,000*g离心5 min,取上清作为样品。②收集300ul步骤I中样品,转入1.5ml离心管中，12,000*g离心5 min,取上清作为样品。③加入200ul Buffer V_L,镟润振荡混合均匀，静置5 min。④加75ul Buffer V-N,镟润振荡混合均匀，12,000*g离心5 min。⑤将上清转移到新的2ml离心管中，加入300ul异丙醇(1%冰乙酸)，上下倒置6_8次，混合均匀。⑥将制备管置于2ml离心管中，取步骤4中的混合液移入制备管中，6，000*g离心I min。⑦弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，加500ul Buffer W1A，室温静置I分钟，12，000*g离心I min。⑧弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，加800ul Buffer W2，12，000*g离心I min。⑨将制备管置回到2ml离心管中，12，000*g离心I min。⑩将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加40_60ul Bufffer TE nuclease-free),室温静置I min,12，000*g 离心 I min，洗脱 DNA/RNA。
[0024](5) PCR 扩增
PCR扩增PCR反应体系(单位:微升)包括=MgCl2 5微升，Buffer 2.5微升，dNTP 2.5微升，Pl 0.5微升，P2 0.5微升，P3 0.5微升，R I微升，F I微升，模板RNA 4微升，H2O
7.5微升；该PCR反应体系以JE-251F和JE-925R为基因扩增引物，其中:
F: CGT TCT TCA AGT TTA CAg CAT TAG C ；
R: CCY RTG TTY CTG CCA AGC ATC CAM CC。
[0025]PCR反应条件:①50°C 30分钟；(D 94°C 5分钟；(D 95°C解链30秒；(D 52°C退火I分钟72°C延伸60秒③~④45个循环；? 72°C延伸15分钟；鉴定基因扩增片段如图1，为乙脑病毒条带约674bp。
[0026]实施例2:
减少蚊虫数量，缩小纱笼至15cm3，按方法(a)收集、保存及检测三带喙库蚊和致倦库蚊经口感染乙脑病毒。
[0027]( I)用乙脑野毒株病毒的蚊虫感染实验模拟疑似蚊媒致病病毒区域捕捉的蚊虫。
[0028]将羽化后I天的30只三带喙库蚊雌蚊经24h的饥饿，每只库蚊驱入一只放有米粒大的饱吸乙脑病毒液的棉花球的青霉素小瓶中，其病毒毒株为乙脑野毒株中山(Nak)株，病毒滴度为7.85 log PFU/ml，让蚊虫吮吸(经口感染)，过夜。翌日，将存活的库蚊24只收集在15cm3纱笼内，室温24~27°C，昼夜温差<2°C，相对湿度70%~80%，人工光照12~14h条件下养殖，并提供8%蔗糖水，感染3天。
[0029]以存活的库蚊作为在疑似蚊媒致病病毒区域捕捉的蚊虫放入青霉素小瓶中，过夜饥饿后，把蚊虫驱入3cm2滤纸，放在8%蔗糖水浸泡的医用棉球上，滴加0.25ml RNA保存液病毒收集载体，让蚊虫取食，每天换一次载体，直到感染后第11天。被蚊虫取食过的载体进行乙脑病毒PCR检测。
[0030](2)病毒RNA提取与实施例1相同。
[0031 ] (3) PCR扩增和检测同实施例1。
[0032]结果:取经感染乙脑病毒24只库蚊保存3、4与5天的RNA载体，扩增目的条带约为 674 bp (图 2)。
[0033]实施例3:
按方法(b)收集、保存及检测三带喙库蚊和致倦库蚊经口感染乙脑病毒。
[0034](I)用乙脑野毒株病毒的蚊虫感染实验模拟疑似蚊媒致病病毒区域捕捉的蚊虫(与实施例1相同)。
[0035](2)收集病毒。
[0036]把步骤I)逐一收集于青霉素小管中的蚊虫_85°C冻存，按48小时间隔分5批共13组计211只蚊虫用空斑试验检测蚊虫的感染病毒滴度，收集病毒液。具体是:取出冻存的经口感染的三带喙库蚊和致倦库蚊，按感染日期进行分组，放入研磨器，用含3%双抗的Hanks液洗漆3次,研磨,每个研磨器加入1ml Hanks液,制成悬液,接种已长成单层的BHK21细胞。空斑实验采用6孔板，直径35 _，每孔接种蚊悬液0.2 ml，37°C吸附Ih后加甲基纤维素营养覆盖物覆盖，CO2培养箱继续培养，第5天用结晶紫溶液染色，计算空斑数及空斑形成单位。结果:13组计211只蚊虫中有11组出现病毒，阳性率为84.62%，阳性组的病毒滴度较高，多数结果在4个对数左右(见下表)。
[0037]表乙型脑炎野毒株(中山株)感染三带喙库蚊空测结果
【权利要求】
1.蚊媒病毒常温收集和保存、及检测方法，包括以下步骤: (1)在疑似蚊媒致病病毒区域，捕捉30-200只同一种类或不同种类的蚊虫逐一地放入青霉素小瓶中，过夜，饥饿后，待进入步骤(2); (2)按以下两种方法之一收集病毒: (a)室温24~27°C下，把定性滤纸剪成3cm2若干份作为收集病毒的载体，每份滤纸中央标记滴加RNA保存液的位置，取若干个干净培养皿加10%蔗糖水，把医用棉球浸泡在培养皿中，将滤纸放在棉球上，再在滤纸标记位置滴加0.25ml RNA保存液，按每份滤纸20-70只蚊虫将步骤I)存活的蚊虫驱入放有培养皿的15~30cm3纱笼内，让蚊虫取食，每天换一次滤纸，共5~7天； 或者，(b)把步骤I)收集于青霉素小管中的蚊虫_85°C冻存，按48小时间隔分批用空斑试验检测蚊虫的感染病毒滴度，收集病毒液；之后，把定性滤纸剪成3cm2若干份作为收集病毒的载体，每份滤纸中央标记滴加RNA保存液和病毒液的位置，取若干个干净培养皿，放置医用棉球，将滤纸放在棉球上，在滤纸标记位置滴加0.25ml RNA保存液,再取病毒液于同一位置滴加0.25ml ； (3)病毒保存 将步骤2) (a)蚊虫取食过的滤纸或步骤2) (b)滴加了蚊虫病毒液的滤纸作为病毒载体在室温24~27°C下分别放置，并在7天内进行检测； (4)对被蚊虫取食 过的载体提取病毒RNA 用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒规定方式提取病毒RNA ； (5)PCR扩增及检测 设计PCR反应体系的病毒菌的5’，3’端保守序列引物及该引物的PCR反应条件；以PCR反应产物凝胶成像及测序鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤I)进一步是把捕捉的蚊虫置于青霉素瓶中过夜，使其饥饿；翌日，将存活的蚊虫驱入步骤2)纱笼内，纱笼内温度24~27°C，昼夜温差<2°C，相对湿度70%~80%，光照时间12~14h，使其存活。
3.如权利要求1或2所述的方法在乙脑病毒收集、保存及检测中的应用，其特征是所述步骤2)之(b)当感染的乙脑病毒液的病毒滴度为7.85 log PFU / ml时，收集病毒液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是所述步骤4)PCR扩增PCR反应体系(单位:微升)为=MgCl2 5 微升，Buffer 2.5 微升，dNTP 2.5 微升，Pl 0.5 微升，P2 0.5 微升，P3.0.5微升，R I微升，F I微升，模板RNA 4微升,H2O 7.5微升；该PCR反应体系以JE-25IF和JE-925R为基因扩增引物，其中: F: CGT TCT TCA AGT TTA CAg CAT TAG C ； R: CCY RTG TTY CTG CCA AGC ATC CAM CC ； PCR反应条件:①50°C 30分钟?’②940C 5分钟；(D 95°C解链30秒；(D 52°C退火I分钟；@72°C延伸60秒③~④45个循环；?72°C延伸15分钟；鉴定基因扩增片段为乙脑病毒条带700bp。
【文档编号】C12Q1/70GK103981282SQ201410167943
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】余静, 范泉水, 张富强, 叶锋平, 郭平, 袁贵红 申请人:成都军区疾病预防控制中心军事医学研究所