一种热应激改变不同部位α受体介导的血管收缩功能促进肾血流的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种热应激改变不同部位α受体介导的血管收缩功能促进肾血流的检测方法，该方法使用敏感的离体血管张力描记技术记录大鼠肾动脉、肠系膜动脉、股动脉血管的张力，用实时定量的逆转录聚核酶链反应技术测定动脉平滑肌的mRNA水平研究α受体反应性改变的机制。结果显示热应激后，肾动脉α受体敏感性降低，股动脉α受体敏感性增加，引起血流的重新分配，提示热应激延迟预适应有肾脏保护效应。该方法灵敏度高，结果准确。
【专利说明】一种热应激改变不同部位α受体介导的血管收缩功能促进肾血流的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种热应激改变不同部位α受体介导的血管收缩功能促进肾血流的检测方法。
【背景技术】
[0002]大鼠热应激(Heat stress,HS)指大鼠置于高温环境，使直肠温度升至42°C，持续15分钟。可以诱发机体产生多种内源性物质而起到心血管保护作用，即产生预适应效应，热应激能诱发早期预适应(early preconditioning,EPC)数分钟内出现,持续2-3小时，同时诱发延迟预适应(delayed preconditioning, DPC),预适应后24小时重复保护，持续2-3天[1，2]。热应激可以引起类似于缺血-再灌注的心血管保护效应[3，4]。热应激预适应心脏保护作用表现为热应激后能耐受随后较长时间缺血损伤，减少严重缺血再灌注所引起的心肌梗塞范围，降低心率失常发生率，改善缺血时心肌细胞功能[5’6]。组织器官的功能正常与否与局部血流供应有关，血管的舒缩状态是影响支配组织血流量的重要因素，交感神经系统是体内调节血管张力的重要系统。我们猜测热应激可以改变不同部位血管平滑肌α肾上腺素受体的反应性，从而产生保护重要器官的效应，但未见文献报道。本实验用高灵敏的小血管张力描记技术研究热应激延迟预适应对大鼠肾动脉、肠系膜动脉、股动脉平滑肌α受体介导收缩功能的影响，考察热应激后α受体的反应性，并使用RT-PCR的方法考察热应激对不同部位动脉α !受体mRNA、α 2受体mRNA水平的影响。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于使用高灵敏的小血管张力描记技术，提供一种检测热应激延迟预适应对大鼠肾动脉、肠系膜动脉、股动脉平滑肌α受体介导收缩功能的影响的方法。
[0004]I材料与方法
[0005]1.1动物与试剂
[0006]成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF级，体重250~300g,由西安交通大学医学院实验动物中心提供。PowerLab数据记录和分析系统,软件Chart5.0以及硬件8通道桥式放大器(ADInstruments Co, Australia) ;FT03C 张力换能器(Grass InstrumentC0.Quincy, Mass.，U.S.A) ;Myograph恒温浴漕(丹麦DMT);红外线加热室(成都泰盟)；解剖显微镜，型号:SMZ168-TL，麦克奥迪实业集团有限公司。苯肾上腺素(phenyl印hrine，PE),乙酸胆喊(acetylcholine, ACh), 5-轻色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)购于 Sigma公司，浓度以浴槽中最终药物浓度表示。实验中使用分析纯化学试剂，双蒸水。
[0007]1.2热应激动物模型及动脉环的制备
[0008]大鼠腹腔内注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉，放入红外线加热的人造环境室(成都泰盟)，大鼠肛温计测量肛温，保持肛温42°C 15分钟，即完成热应激大鼠模型m。对照组同样麻醉，但是没有升温过程，自然苏醒。48小时后，实验大鼠二氧化碳麻醉，断头处死，迅速取出肾动脉、肠系膜动脉、股动脉浸入冷Krebs液(含mmol/L =NaCl119, NaHCO315,KC14.6、MgCl2L 2、NaH2PO4L 2、CaCl2L 5和葡萄糖5.5)中，显微镜下剥离血管周围组织，
0.1% Tritonx-1OO血管内灌注10秒，去除血管内皮，再用缓冲液冲洗10秒，当10 μ M乙酰胆碱引起的舒张率< 10%，认为内皮已被去除Μ。将处理好的动脉切成Imm长的圆筒段。实验分组为热应激组、对照组，每组大鼠14只。
[0009]1.3血管张力记录
[0010]在显微镜下，将动脉环套在DMT的金属丝上，其中一个连接FT03C?张力换能器，另一个连微调装置(调节负荷张力)，通过软件Chart5.0以及硬件PowerLabS通道桥式放大器，将血管负荷张力显示于屏幕。将安装好的动脉环置入含有5ml Krebs液的370C Myograph恒温浴槽，持续通入含95 % O2和5 % CO2的混合气体，pH保持7.4[8]。实验前，肾动脉环、股动脉环、肠系膜动脉环静息负荷均为2mN，每20分钟换液一次，稳定1.5小时。以K+-Krebs液(含K+63.5mmol/L)检验动脉环收缩性，两次收缩高度大于ImN且收缩幅度相差< 10%者用于实验。K+-Krebs 液组成为(mmol/L:NaC163.5、NaHC0315、KC163.5、MgCl2L 2、NaH2PO4L 2、CaCl2L 5和葡萄糖5.5)。运用累积浓度法在浴槽中加入PE，得到浓度反应曲线。
[0011]1.4实时定量的逆转录聚核酶链反应技术(RT-PCR)
[0012]从血管环上分离血管平滑肌，在RNApiV^f Iml中匀浆，制备匀浆液。按照试剂盒说明书，提取总RNA。提取的RNA孵育30分钟(42°C )，完成RNA向cDNA的逆转录过程。RT-PCR在Perkin-Elmer Real-time PCR扩增仪中进行。大鼠α丨受体和α 2受体的特异性引物根据基因数据库 体前引物:5’-CTC CAC TGT GCT GCC CTT C-3’ ；后引物:5’-TGCCAAAGG CCC AGT AGC-3，。α2 受体前引物:5，-TCATTG TCA CTG TGT GGG TCATC-3，;后引物:5’ -TGA GTG GCG GGAAGG AGA-3’。管家基因(ke印ing gene)GAPDH mRNA，在细胞内连续表达使之维持总量恒定，作为mRNA定量的参照。本研究仅以GAPDH作为mRNA定量的参照。GAPDH 前引物:5，-GGC CTT CCG TGT TCC TAC C-3’；后引物:5’ -CGG CAT GTC AGATCCACA AC3’。PCR扩增反应在50 μ I体积中进行，开始在50°C反应2分钟，95 °C反应10分钟，继续95°C反应15秒，60°C反应I分钟，完成40个PCR循环。反应结束后采用分离曲线分析法以确定PCR反应产物的特异性。受体的mRNA定量分析采用PCR循环阈值(Ct)比较法，以GAPDH的Ct值为内对照，计算α:受体和α 2受体的mRNA的相对表达量。
[0013]1.5统计学分析
[0014]数据以I ± S表示，收缩反应以激动剂引起收缩效应相对于63.5mmol/L钾引起的收缩效应百分数表达，反应特征表述为Emax (最大收缩百分率)和PD2 (产生一半最大收缩时所需要受体激动剂浓度的负对数)。收缩激动剂的浓度-效应曲线采用迭代最小二乘法契合出的Hill方程(GraphPad Prism4统计软件)估算该激动剂的Emax和pD2值。η =实验中使用的动物数，在同一只大鼠中获得的数据数超过I个值，则取平均值。统计分析及作图使用Prism4.0软件。Students' t检验用来比较两组间的数据，当P < 0.05时被认为有显著性。
【具体实施方式】[0015]2.1动脉对K+的收缩反应
[0016]血管平衡好后，K+诱导的收缩在对照组和热应激组的肾动脉、肠系膜动脉、股动脉没有明显差异。
[0017]2.2内皮去除
[0018]血管平衡好后，考察内皮去除是否完整，先加入20tM5_HT引起血管收缩，再加入10_5 μ MACh,结果显示在对照组和热应激组肾动脉、肠系膜动脉、股动脉ACh基本不引起血管舒张，认为内皮去除完全。预试验显示20tM5-HT可以引起血管强而稳定的收缩达I小时。
[0019]2.3热应激后苯肾上腺素对不同部位动脉的收缩反应
[0020]苯肾上腺素激动血管平滑肌上的α -肾上腺素受体，随着苯肾上腺素浓度增加，引起血管的收缩效应增强，生成浓度-收缩量效曲线。苯肾上腺素在对照组大鼠肾动脉、肠系膜动脉、股动脉引起强烈收缩，收缩效能排序为:肠系膜动脉(151±14) %>肾动脉(146±12)%>股动脉(112±12)%。热应激后，苯肾上腺素在不同部位动脉收缩效能排序发生了改变:肾动脉(230±24) %>肠系膜动脉(145±11) %>股动脉(94±10) %。需要注意的是，热应激后，肾动脉量效曲线的PD2值显著降低，而股动脉量效曲线的PD2值显著增闻。
[0021]2.4热应激后不同部位动脉α -肾上腺素受体mRNA表达
[0022]热应激后，大鼠肾动脉a i受体mRNA相对含量明显升高，而肠系膜动脉、股动脉α:受体mRNA水平与对照组比较差异无统计学意义(表2)。热应激后，肾动脉、肠系膜动脉、股动脉α 2受体mRNA水平与对照组比较，差异均无统计学意义。
[0023]本发明的优点是:本发明方法简单高效，结果准确。
[0024]3 讨论
[0025]文献报道延迟预适应保护效应在临床具有潜在的应用价值:治疗不稳定型心绞痛、可促使心肌对缺血缺氧产生内源性耐受反应，防治心肌梗死；预防心律失常。我们考察热应激延迟保护效应是否存在于其他组织器官。组织的功能与局部血流密切相关，苯肾上腺素可以通过激动α-肾上腺素受体调节血管张力，影响血流分布。血管的紧张性收缩决定血管口径的大小，而血管口径又是决定血管阻力和血流量的主要因素。血管内皮细胞可以释放血管活性物质如内皮素、降钙素基因相关肽等收缩或者舒张血管的生物活性物质干扰试验结果，因此在本实验中所用动脉均去除内皮。研究结果显示热应激的延迟预适应效应不影响大鼠肠系膜动脉的α受体反应性，可以影响大鼠股动脉、肾动脉血管平滑肌α受体反应性，影响血流分配，使股动脉张力增加，阻力增加，血流量减少；肾动脉张力减小，阻力减小，血流量增多。
[0026]α -肾上腺素受体在心血管系统调节中起重要作用。我们发现对照组大鼠交感神经兴奋时激动α受体在肠系膜动脉、肾动脉引起的最大收缩能力较在股动脉略强；从对交感神经的敏感性上看，股动脉最为敏感，其PD2值为7.40±0.09，肾动脉和肠系膜动脉的敏感性接近，口02值分别为6.97±0.05和6.70±0.09。有报道热应激引起大鼠血浆儿茶酚胺水平增高，心肌去甲肾上腺素水平出现翻转[9]，局部缺血实验显示α -肾上腺素受体介导的收缩增加[1°]。我们的研究结果显示与对照组比较，热应激后苯肾上腺素在大鼠肾动脉引起的收缩量效曲线明显右移，PD2值由热应激前的6.97±0.05降低到热应激后
5.68±0.08，表明热应激后肾动脉血管平滑肌α受体与苯肾上腺素的亲和力降低，敏感性显著降低。同时在肾动脉，我们还发现热应激后，兴奋α受体引起的最大能力明显增强，Emax增强了 1.58倍，达到了 230±24%。仔细分析热应激前后，苯肾上腺素激动肾动脉α受体引起的收缩量效曲线，显示在对照组大鼠，苯肾上腺素浓度大于10_8Μ时就可以引起肾动脉收缩，而热应激后苯肾上腺素浓度需大于10_6 5Μ时才引起大鼠肾动脉收缩，即热应激后激动α受体引起肾动脉收缩需要的苯肾上腺素浓度增加了 30余倍。热应激后苯肾上腺素引起的肾动脉收缩在浓度范围为10_7~10_6Μ时显著低于对照组，在高浓度时(> I(T5 5M)收缩大鼠肾动脉的能力增强，当苯肾上腺素浓度大于KT5M时，在热应激后的肾动脉引起的收缩显著增强。我们知道去甲肾上腺素血浆生理浓度约为10_8~10_7Μ，表明热应激后在去甲肾上腺素血浆生理浓度范围内大鼠肾动脉介导的反应性明显降低，肾血流量增加。
[0027]在肠系膜动脉，与对照组比较，热应激后苯肾上腺素引起的收缩量效曲线没有明显改变，热应激前后的量效曲线基本重合，提示热应激不影响交感神经系统对肠系膜血流量的调节。在股动脉，与对照组比较，热应激后苯肾上腺素引起的收缩量效曲线明显左移，最大收缩略有降低，PD2值显著增高，从对照组的7.40±0.09达到7.96±0.16，表明热应激后股动脉血管平滑肌上的α受体与苯肾上腺素的亲和力增强，敏感性显著增高，考虑到去甲肾上腺素血浆生理浓度约为10_8~10_7Μ，交感神经支配股动脉α受体产生收缩效应的能力增强，热应激后股动脉血流量减少。热应激后肾动脉、股动脉α受体反应性改变的可能机制与受体收缩的效率改变和/或受体数目改变即受体出现上调或者下调有关。
[0028]我们测定了热应激前后大鼠肠系膜动脉、肾动脉、股动脉的Ci1受体和Ci2受体mRNA水平。结果显示,肠系膜动脉,热应激前后α ι受体和α 2受体mRNA水平均没有明显改变，这与功能实验的结果一致。股动脉热应激前后h受体和Ci2受体mRNA水平也没有明显改变，股动脉在热应激后收缩量效曲线PD2值显著增高，这些结果表明热应激后股动脉α受体敏感性增高，由于交感神经收缩作用主要由\受体介导，推测是由于\受体的敏感性增加所致。在肾动脉，热应激后a i受体mRNA水平显著增加,而α 2受体mRNA水平变化不明显，功能实验 结果显示热应激后浓度-收缩量效曲线明显右移，并且Emax显著增加，表明a i受体可能出现上调，表达增强，但是受体与递质的亲和力下降，受体收缩效率降低。我们曾对培养的大鼠肠系膜动脉α受体上调的可能机制进行过研究[11]，发现转录抑制剂放射菌素D可取消培养血管对NA收缩反应的增强，MAPK抑制剂、细胞外信号调控蛋白激酶1/2抑制剂SB386023，U0126以及p38蛋白激酶抑制剂SB239063均能削弱培养血管对NA收缩反应的增强，因此推测，细胞内的MAPK信号转导途径被激活，调控Ci1受体的上调。以往在研究血管器官培养导致ETb受体上调时，也观察到了类似现象[12’13]。
[0029]实验表明，热应激后，在肾动脉，α-肾上腺素受体介导的收缩量效曲线PD2值明显降低，最大收缩能力增强。在股动脉，α-肾上腺素受体介导的收缩敏感性增加。大鼠热应激的延迟预适应效应，可致不同部位α-肾上腺素受体介导的收缩功能发生改变，引起血流的重新分布，保护了肾脏的供血，此作用与\受体与递质的亲和力改变有关，同时与Ci1受体mRNA水平改变有关。
[0030]参考文献
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【权利要求】
1.一种热应激改变不同部位α受体介导的血管收缩功能促进肾血流的检测方法，包括使用高灵敏的小血管张力描记。
2.如权利要求1 所述的方法，其中所述方法包括以下具体步骤:建立热应激动物模型和制备动脉环、记录血管张力、实时定量的逆转录聚核酶链反应、统计学分析。
【文档编号】C12Q1/68GK103981262SQ201410188999
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月7日 优先权日:2014年5月7日
【发明者】李洁, 林杰, 王俊杰, 曹永孝, 陈碧 申请人:李洁, 林杰, 王俊杰