一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；(3)检测：采用特异性引物和试剂盒进行PCR扩增；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断气溶胶样本中是否含有布鲁氏杆菌。本发明还公开了特异性引物(如SEQIDNO.3～9所示)以及试剂盒(由特异性引物、pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成)。本发明的方法既可用于养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的检测与鉴定，也可用于临床血液、血清、奶样、组织等样本的检测与鉴定。
【专利说明】一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测及鉴别诊断养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002]气溶胶(aerosol)是指悬浮在气体中的固体和/或液体微粒与气体载体共同组成的多相体系。根据微粒的成分可以划分为生物气溶胶和化学气溶胶。在气溶胶的体系中，把具有生命的气溶胶粒子和活性粒子以及由有生命活性的机体所释放到空气中的各种质粒统称为生物气溶胶，又称为微生物气溶胶，主要分为细菌气溶胶、病毒气溶胶和真菌气溶胶等，与人类及动物的健康密切相关。养殖场环境中的微生物气溶胶的分布可造成以呼吸道传播性的传染病的暴发与流行，给畜牧业生产和人类健康带来严重危害，尤其是当前集约化、高密度养殖环境下更容易形成微生物气溶胶性的疾病流行。因此，通过监测养殖场环境中气溶胶微生物，可以有效地预警预测传染病的暴发流行。
[0003]布鲁氏杆菌病(Brucellosis，也称布氏杆菌病)是由布鲁氏杆菌属细菌引起的人、畜共患的常见传染病。布鲁氏杆菌属于兼性胞内寄生的革兰氏阴性短小杆菌，无鞭毛，不形成芽孢，有荚膜，是在严格厌氧条件下不生长的需氧菌，其外膜蛋白、脂多糖等成分是决定其感染力的主要因素。在家畜中以牛种布鲁氏杆菌(B.abortus)、羊种布鲁氏杆菌(B.melitensis)和猪种布鲁氏杆菌(B.suis)最常发生,且可由牛、羊、猪传染给人。本病广泛分布于世界各地，每年4~8月为本病的高发季节，与牛羊繁殖、流产及牛羊肉的消费有关，高危人群是牛羊的 饲养、屠宰、兽医、畜产品加工等从业人员。我国目前在人、畜间仍有发生，给畜牧业和人类的健康带来严重的危害。
[0004]现有技术中，实验室检测布鲁氏杆菌病原的方法主要有细菌染色、分离培养和核酸检测，核酸检测主要是常规PCR法。目前，尚无常规PCR方法检测养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的研究。
[0005]SYBRGreen I实时荧光定量PCR可以利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线检测目的基因并进行定量分析，同时结合溶解曲线Tm差异进行鉴别诊断的技术。该技术具有敏感性高、特异性强，重复性好等优点；此外操作简便、价格低廉、结果直观，在临床检测和对疾病进程的研究上具有很高的实用价值。目前，还没有应用SYBRGreen I实时荧光定量PCR技术开展养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的研究报道。
【发明内容】
[0006]针对上述现有技术，本发明提供了一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法。本发明通过采集养殖场不同环境中布鲁氏杆菌气溶胶样本，提取布鲁氏杆菌基因组DNA，应用SYBRGreen I实时荧光定量PCR技术检测布鲁氏杆菌属细菌，同时根据溶解曲线Tm值的不同对气溶胶中牛种布鲁氏杆菌、羊种布鲁氏杆菌和猪种布鲁氏杆菌进行鉴别诊断。利用本方法可以对养殖场环境中的布鲁氏杆菌气溶胶流行与传播进行实时监测，为养殖场布鲁氏杆菌的防控提供技术支持，也可以开展布鲁氏杆菌病的流行病学调查，为布鲁氏杆菌病的科学防控提供理论支撑。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0008]一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，步骤如下:
[0009](I)采集气溶胶样本；
[0010]进一步地，采集气溶胶样本的方法为:采用国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-1mpinger,简称AGI),以IOmLpH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集养殖场环境中的气溶胶样本；
[0011](2)提取气溶胶样本的基因组总DNA ；
[0012]进一步地，提取基因组总DNA的方法为:将采集到的IOmL气溶胶样本在室温下12000r/min离心5min，弃上清液，应用细菌基因组DNA试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)提取总DNA ；
[0013](3)检测:以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreen I实时荧光定量PCR，具体如下:
[0014]所述试剂盒由特异性引物、pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒、SYBRGreen I实时荧光定量PCR试剂(现有技术中已有的常规试剂)和ddH20组成；
[0015]所述pEASY- T3-VirB10阳性标准质粒是由序列为SEQIDN0.10所示的DNA片段与PEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术；
[0016]所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对；
[0017]所述通用型检测引物对的序列如下:
[0018]VirB10-2-F:5/ -TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3'，如 SEQIDN0.3 所示；
[0019]VirB10-2-R:5/ -TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3'，如 SEQIDN0.4 所示。
[0020]所述布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对的序列具体如下:
[0021]牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:
[0022]Abortus-F:5/ -GCGGCTTTTCTATCACGGTATTC-3'，如 SEQIDN0.5 所示；
[0023]Abortus-R:5/ -GACCGCATTCATGGGTTTCG-3'，如 SEQIDN0.6 所示；
[0024]羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:
[0025]Melitensis-F:5/ -AACAAGCGGCACCCCTAAAA-3'，如 SEQIDN0.7 所示；
[0026]Melitensis-R:5/ -CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3'，如 SEQIDN0.8 所示；
[0027]猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:
[0028]Suis-F:5/ -CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3'，如 SEQIDN0.8 所示；
[0029]Suis-R:5' -ACCGGAACATGCAAATGAC-3'，如 SEQIDN0.9 所示。
[0030]扩增体系为:20 μ L的扩增体系，包括2X SYBRPremixExTaqII 10 μ L，模板2 μ L，10 μ mol/L的上游引物和下游引物各0.5 μ L，RNaseFreeddH207 μ L。
[0031]扩增条件为:预变性95°C 30s，然后按照95°C变性5s、62°C退火延伸30s进行40个循环，每个循环结束后采集荧光信号；溶解曲线的条件为95°C 10s、65°C 60s，升温至95°C，最后50°C 30s反应结束。
[0032](4)建立标准曲线和溶解曲线:建立pEASY-T3_VirB10阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；
[0033](5)判断:当所用特异性引物为通用检测引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有布鲁氏杆囷；
[0034]当所用特异性引物为布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对时，若对应于牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛种布鲁氏杆菌；
[0035]若对应于羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有羊种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有羊种布鲁氏杆菌；
[0036]若对应于猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有猪种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有猪种布鲁氏杆菌。
[0037]布鲁氏杆菌四型分泌系统(TypeIVsecretionsystems, T4SS)是布鲁氏杆菌重要的致病力因子，它由VirBl……VirB12十二个蛋白组成，其中VirBlO蛋白为跨膜通道的组成成分，是T4SS的核心结构组份，是主要的功能蛋白，本申请的发明人通过实验研究发现，其在布鲁氏杆菌属中高度保守，可作为布鲁氏杆菌属检测的靶基因。发明人还发现，布鲁氏杆菌IS711 (InsertionSequence711)插入序列在不同的种布鲁氏杆菌基因组中高度保守，并且在拷贝数上存在差异，因此，本发明将牛种布鲁氏杆菌种特异性上游引物定位在IS711插入序列的上游基因alkB上，羊种的特异性上游引物定位在IS711插入序列的上游基因BMEI1162上，猪种上游引物定位在IS711插入序列的3'末端，下游引物定位在BSS2_11621基因座前100的核苷酸位点，根据PCR扩增片段大小，即可以鉴别检测牛种布鲁氏菌生物1、2和4型，羊种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌生物I型。
[0038]本发明的检测及鉴别诊断养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，对养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌而言，能检测到的最低量为12.8个拷贝/μ L。本发明的方法既可用于养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的检测与鉴定，也可用于临床血液、血清、奶样、组织等样本的检测与鉴定。本发明的方法可用于养殖场环境中临床样本的直接检测，也可用于科学研究等非疾病的诊断。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1:牛种、羊种和猪种布鲁氏杆菌VirBlO基因序列比对图；应用DNAStar7.1中MegAlign 软件的 ClustalWMethd 分析获得。
[0040]图2:布鲁氏菌通用型SYBRGreen I实时定量PCR检测标准曲线，图中1_8的模板分别对应为标准阳性质粒1.28 X IO8-L 28 X IO1拷贝数/ μ L。
[0041]图3:布鲁氏菌通用型SYBRGreen I实时定量PCR检测溶解曲线，模板同图2，水平直线为阴性对照，模板为ddH20。
[0042]图4:布鲁氏菌通用型SYBRGreen I实时定量检测PCR特异性曲线，其中1_3的模板分别为牛种布鲁氏杆菌A19株、羊种布鲁氏杆菌M5-90株、猪种布鲁氏杆菌S2株；4_11分别为:大肠杆菌(DH5a)、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、结核杆菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌；12为阴性对照。
[0043]图5:布鲁氏菌通用型SYBRGreen I实时定量PCR灵敏度曲线，图中1_8的模板分别对应为标准阳性质粒1.28 X IO8-L 28 X IO1拷贝数/ μ L。
[0044]图6:布鲁氏菌通用型SYBRGreen I实时定量PCR重复性曲线，模板同图5，每个模板同时进行3个重复。
[0045]图7:布鲁氏菌通用型SYBRGreen I实时定量PCR方法检测养殖场布鲁氏杆菌属气溶胶样本扩增曲线。其中各曲线模板，1:阳性标准质粒pEASY-Y3-VirB101.28X 106拷贝数/ μ L，2:阳性标准质粒pEASY-Y3-VirB101.28X IO4拷贝数/ μ L，3-30为气溶胶检测样本,其中al、a7、al8、a24为气溶胶布鲁氏杆菌阳性。
[0046]图8:牛种布鲁氏杆菌溶解曲线，模板为牛种布鲁氏杆菌A19株。
[0047]图9:羊种布鲁氏杆菌溶解曲线，模板为羊种布鲁氏杆菌M5-90株。
[0048]图10:猪种布鲁氏杆菌溶解曲线，模板为猪种布鲁氏杆菌S2株。
[0049]图1lA:牛种、羊种和猪种布鲁氏杆菌分型的溶解曲线；图1lB =SYBRGreen I实时定量PCR鉴别牛、羊和猪种布鲁氏杆菌气溶胶样本溶解曲线。其中al、a7、al8、a24为气溶胶布鲁氏菌阳性样本。
【具体实施方式】
[0050]下面结合实施 例对本发明作进一步的说明。
[0051]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0052]下述实施例中所用一些材料、试剂和菌株如下:
[0053]MS-1型多功能微生物采样器(青岛众瑞智能仪器有限公司),LightCycler*480 II荧光定量PCR仪(罗氏公司)。细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号:DP302)、琼脂糖凝胶回收试剂盒(目录号:DP209)和高纯度质粒小提中量试剂盒(目录号:DP107)购自天跟生化科技(北京)有限公司；大肠杆菌(DH5 a )、PEASY-T3载体试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司。SYBRe PremixExTaq?I I (TIiRNaseHPlus)试剂盒(CodeN0.:RR820A) ,LATaq (CodeN0.:RR02MA)均购自宝生物工程(大连)有限公司。牛布氏杆菌活疫苗A19株(新疆天康畜牧生物技术股份有限公司)、羊种布鲁氏杆菌M5-90株(中牧实业股份有限公司)、猪种布鲁氏杆菌活疫苗S2株(哈药集团生物疫苗有限公司)。金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、结核杆菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌均为临床分离株，为山东省农科院奶牛研究中心疾病实验室保存。
[0054]实施例1引物的设计与合成
[0055]对牛种(GenBank:AF226278.1，序列表中序列 10)、羊种(GenBank:DQ861303.1)和猪种(GenBank:AF141604.1) VirBlO基因序列比对发现其高度保守，见图1。根据GeneBank中牛布鲁氏杆菌VirBlO基因保守序列，设计全长扩增引物(如SEQIDN0.1、2所示)，用于阳性标准质粒的构建(表1中的序列1、2);采用PrimerExpress3.0软件，设计一对特异性引物(如SEQIDN0.3、4所示)，用于布鲁氏杆菌属通用型检测(表1中的序列3、4)。分别根据GeneBank 中牛种布鲁氏杆菌 AlkB 基因与 IS711 序列(GenBank: AF148682.1，如 SEQIDN0.11所示)，山羊种布鲁氏杆菌插入序列IS711(GenBank:JF939171.1，如SEQIDN0.12所示)，猪种布鲁氏杆菌S1330株染色体序列(GenBank:CP006962.1的第1618935~1619107位的核苷酸基序，如SEQIDN0.13所示)，采用PrimerExpress3.0软件,分别设计牛种、山羊种和猪种布鲁氏杆菌特异性鉴别检测引物(表1中的序列5~9，如SEQIDN0.5~9所示)。
[0056]表1引物寡核苷酸序列
[0057]
【权利要求】
1.一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，其特征在于:步骤如下: (1)采集气溶胶样本； (2)提取气溶胶样本的基因组总DNA； (3)检测:以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenI实时荧光定量PCR，具体如下: 所述试剂盒由特异性引物、pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒、SYBRGreen I实时荧光定量PCR试剂和ddH20组成； 所述pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒是由序列为SEQIDN0.10所示的DNA片段与PEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒； 所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对； 所述通用型检测引物对的序列如下:
VirB10-2-F:5/ -TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3'；
VirB10-2-R:5/ -TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3'； 所述布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对的序列具体如下: 牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:
Abortus-F:5/ -GCGGCTTTTCTATCACGGTATTC-3'；
Abortus-R:5/ -GACCGCATTCATGGGTTTCG-3'； 羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:
Melitensis-F:5/ -AACAAGCGGCACCCCTAAAA-3'；
Melitensis-R:5/ -CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3'； 猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:
Suis-F:5/ -CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3'；
Suis-R:5/ -ACCGGAACATGCAAATGAC-3'； (4)建立标准曲线和溶解曲线:建立pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线； (5)判断:当所用特异性引物为通用检测引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有布鲁氏杆菌； 当所用特异性引物为布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对时，若对应于牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛种布鲁氏杆菌； 若对应于羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有羊种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有羊种布鲁氏杆菌； 若对应于猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有猪种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有猪种布鲁氏杆菌。
2.根据权利要求1所述的检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，其特征在于:所述步骤(1)中，采集气溶胶样本的方法为:采用全玻璃液体冲击式采样器，以IOmLpH值.7.0的磷酸盐缓冲液为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集气溶胶样本。
3.根据权利要求1所述的检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，提取基因组总DNA的方法为:将采集到的IOmL气溶胶样本在室温下.12000r/min离心5min，弃上清液，应用细菌基因组DNA试剂盒提取总DNA。
4.根据权利要求1所述的检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，其特征在于:所述步骤⑶中，PCR的扩增体系为:20μL的扩增体系，包括2XSYBRPremixExTaqII10μL，模板2 μ L，10 μ mol/L的上游引物和下游引物各0.5 μ L, RNaseFreeddH207 μ L。
5.根据权利要求1所述的检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，PCR的扩增条件为:预变性95°C30s，然后按照95°C变性5s、62°C退火延伸30s进行40个循环，每个循环结束后采集荧光信号；溶解曲线的条件为95°C 10s、65°C60s，升温至95°C，最后50°C 30s反应结束。
6.用于检测布鲁氏杆菌的特异性引物，其特征在于:所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对，具体如下: 所述通用型检测引物对的序列如下:
VirB10-2-F:5/ -TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3'；
VirB10-2-R:5/ -TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3'； 所述布鲁氏杆菌牛种 、羊种和猪种鉴别检测引物对的序列具体如下: 牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:
Abortus-F:5/ -GCGGCTTTTCTATCACGGTATTC-3'；
Abortus-R: 5' -GACCGCATTCATGGGTTTCG-3'； 羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:
Melitensis-F:5/ -AACAAGCGGCACCCCTAAAA-3'；
Melitensis-R:5/ -CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3'； 猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:
Suis-F:5/ -CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3'；
Suis-R:5/ -ACCGGAACATGCAAATGAC-3'。
7.权利要求6所述的特异性引物在制备用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒中的应用。
8.权利要求6所述的特异性引物在检测布鲁氏杆菌中的应用。
9.一种用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒由特异性引物、pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒、SYBRGreen I实时荧光定量PCR试剂和ddH20组成； 所述pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒是由序列为SEQIDN0.10所示的DNA片段与PEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒； 所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对； 所述通用型检测引物对的序列如下:
VirB10-2-F:5/ -TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3'；
VirB10-2-R:5/ -TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3'； 所述布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对的序列具体如下:牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:Abortus-F:5/ -GCGGCTTTTCTATCACGGTATTC-3'；Abortus-R:5/ -GACCGCATTCATGGGTTTCG-3'；羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:Melitensis-F:5/ -AACAAGCGGCACCCCTAAAA-3'；Melitensis-R:5/ -CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3'；猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:Suis-F:5/ -CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3'；Suis-R:5/ -ACCGGAACATGCAAATGAC-3'。
10.权利要求9所述的 试剂盒在检测布鲁氏杆菌中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103981261SQ201410188981
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】何洪彬, 赵贵民, 王洪梅 申请人:山东省农业科学院奶牛研究中心