一种检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；(3)检测：进行PCR扩增；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断气溶胶样本中是否含有牛分枝杆菌或/和结核分枝杆菌。本发明还公开了特异性引物(如SEQIDNO.1、2所示)以及试剂盒(由特异性引物、pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成)。本发明的方法，既可用于养殖场气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的检测与鉴定，也可用于临床血液、血清、奶样、组织等样本的检测与鉴定。
【专利说明】一种检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002]牛分枝杆菌(Mycobacterium,bovis)及结核分枝杆菌(Mycobacterium,tuberculosis)均可引起牛和人等人畜共患的结核病(Tuberculosis, TB),前者以感染牛为主，后者以感染人为主，该病被世界动物卫生组织(OIE)定为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。调查表明约10%的人结核病是由牛分枝杆菌引起的，在有结核病奶牛的地区，人的结核病感染率高达75%。全球每年有超过900万的新发结核病病例，近年结核病出现复苏趋势，亚洲和非洲部分国家结核病的发病率和死亡率持续增长。根据卫生部疾病预防控制局2012年统计的数据显示，2012年我国有951508人感染结核病，其中死亡2662人。该病因其易传染，全年均可发生，呈世界性流行，严重危害世界养牛业和人类健康。
[0003]结核病主要经呼吸道、消化道感染，目前可以确认，人和牛吸入含有结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的气溶胶是主要感染方式。在养殖场环境中感染结核病的牛可随咳嗽、喷嚷以及呼出的气体将结核菌排出体外，漂浮在空气中，在其活动的环境中形成气溶胶结核菌的污染，健康人及动物吸入后即可感染，严重危害养殖场环境中的人和动物。目前，还没有应用SYBRGreen I实时突光定量PCR技术开展养殖场环境中气溶胶牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的研究报道。
【发明内容】
[0004]针对上述现有技术，本发明提供了一种采集并快速检测养殖场气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法。本发明的方法可以检测养殖场气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌，并且具有简捷快速、灵敏特异、低廉准确，实用性强等优点。利用本发明的方法可以对养殖场环境中的牛分枝杆菌与结核分枝杆菌气溶胶流行与传播进行实时监测，为养殖场结核病的防控提供技术支持，也可以开展结核病的流行病学调查，为结核病的科学防控提供理论支撑。
[0005]针对现有技术中对结核病的研究现状及危害的分析，本发明选择牛分枝杆菌与结核分枝杆菌分泌性蛋白MBP70基因所共有的序列设计合成引物，建立SYBRGreen I实时荧光定量PCR,可对养殖场气溶胶中牛分枝杆菌及结核分枝杆菌与其它病原进行区分,并在养殖场中开展结核病的流行病学调查，对养殖场中不同环境中，包括动物饲养舍、运动场、挤奶厅及产房等采集牛分枝杆菌与结核分枝杆菌气溶胶样品，利用SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的含量及其分布情况，以期为养殖场人畜共患的结核病传播机制研究提供新的技术手段。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]—种采集并快速检测养殖场气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，步骤如下:
[0008](I)采集气溶胶样本；
[0009]进一步地，采集气溶胶样本的方法为:采用国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-1mpinger,简称AGI),以IOmLpH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集养殖场环境中的气溶胶样本；
[0010](2)提取气溶胶样本的基因组总DNA ；
[0011]进一步地，提取基因组总DNA的方法为:将采集到的IOmL气溶胶样本在室温下12000r/min离心3min，弃上清液，应用细菌基因组DNA试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)提取总DNA，每个样本用50 μ LddH2O溶解；
[0012](3)检测:以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreen I实时荧光定量PCR，具体如 下:
[0013]所述试剂盒由特异性引物、pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒、SYBRGreen I实时荧光定量PCR试剂(现有技术中已有的常规试剂)和ddH20组成；
[0014]所述PEASY-T3-MPB70阳性标准质粒是由序列为SEQIDN0.3所示的DNA片段与PEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术；
[0015]所述特异性引物的序列如下:
[0016]MPB70-F:5/ -TGACCAGCATCCTGACCTACC-3' (SEQIDN0.1 所示)；
[0017]MPB70-R:5/ -CGGCGTTACCGACCTTGA-3' (SEQIDN0.2 所示)；
[0018]扩增反应体系为20 μ L，包括 2X SYBRPremixExTaqII 10 μ L，模板 2 μ L，10 μ mol/L的上游引物和下游引物各0.5 μ L，RNaseFreeddH207 μ L。
[0019]反应条件为:预变性95°C 30s，然后95°C变性5s、60°C退火延伸30s进行40个循环，每个循环结束后采集荧光信号；溶解曲线的条件为95°C 10s、65°C 60s，升温至95°C，最后50°C 30s反应结束。
[0020](4)建立标准曲线和溶解曲线:建立PEASY-T3-MPB70阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；
[0021](5)判断:若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有牛分枝杆菌或/和结核分枝杆菌；若溶解曲线为一条直线，贝1J表明气溶胶样本中不含有牛分枝杆菌以及结核分枝杆菌。
[0022]本发明建立的SYBRGreen I实时荧光定量PCR方法，通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测，最低浓度为2.19X10°个拷贝/μ L。对牛结核分枝杆菌、结核分枝杆菌、禽分枝杆菌、副结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌等制备的模板DNA在建立的检测方法下进行扩增，结果表明仅有牛结核分枝杆菌和结核分枝杆菌有阳性扩增，与其他菌株无交叉反应，特异性强。
[0023]对3个不同浓度的阳性标准品进行了批内检测和批间检测，计算出批内变异系数和批间变异系数，其批内误差和批间误差均小于5%。批内和批间重复试验Ct值的统计学分析表明:相同稀释度标准质粒Ct值之间差异均不显著(Ρ>0.05)。
[0024]本发明的检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，既可用于养殖场气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的检测与鉴定，也可用于临床血液、血清、奶样、组织等样本的检测与鉴定。本发明的方法可用于养殖场环境中临床样本的直接检测，也可用于科学研究等非疾病的诊断。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1:SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌标准品扩增曲线(荧光定量PCR仪自动生成)，图中，曲线1-7代表4.38X 106-4.38X 10°拷贝数/反应的标准品的扩增曲线，曲线8为阴性对照。
[0026]图2 =SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌标准曲线(突光定量 PCR 仪自动生成),使用 LightCycler* 480 II GeneScanningSoftwareVersionl.5的AbsQuant/2ndDerivativeMax分析模式分析，结果各点在一直线上，各参数值为Error:0.0216, Efficiency: 1.731, Slope:-4.196，模板同图1。
[0027]图3 =SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌溶解曲线(荧光定量PCR仪自动生成)，为单一峰，模板同图1。
[0028]图4 =SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌特异性扩增曲线(荧光定量PCR仪自动生成)，其中，曲线I和2的模板分别为牛结核分枝杆菌和结核分枝杆菌，均为S型曲线；曲线3-10分别为:禽分枝杆菌、副结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌，均为一条直线，扩增反应为阴性；曲线11为阴性对照。
[0029]图5 =SYBRGreen I实时定量PCR方法检测养殖场牛分枝杆菌与结核分枝杆菌气溶胶样本扩增曲线。其中，各曲线模板为:1:质粒标准品2.19X102拷贝数/yL，2:为气溶胶检测阳性样本，3-5为气溶胶检测阴性样本，6为阴性对照。
【具体实施方式】
[0030]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0031]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032]下述实施例中所用一些材料、试剂和菌株如下:
[0033]MS-1型多功能微生物采样器(青岛众瑞智能仪器有限公司)，LightCycler"480 II荧光定量PCR仪(罗氏公司)，梯度PCR仪(TaKaRa公司)。细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号:DP302)、琼脂糖凝胶回收试剂盒(目录号:DP209)和高纯度质粒小提中量试剂盒(目录号:DP107)购自天跟生化科技(北京)有限公司；pEASY-T3载体试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司。SYBR* PremixExTaq?II (TIiRNaseHPlus)试剂盒(CodeN0.:RR820A)、LATaq(CodeN0.:RR02MA)均购自宝生物工程(大连)有限公司。牛结核分枝杆菌、结核分枝杆菌、禽分枝杆菌、副结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌均为临床分离株，为山东省农科院奶牛研究中心疾病实验室保存。
[0034]参考GeneBank 中 MycobacteriumbovisMPB70 基因(EU683971.1)的保守区域利用PrimerExpress3.0软件设计一对特异性引物(如SEQIDN0.1、2所示),由华大基因合成,预期扩增DNA产物135bp。
[0035]实施例1牛分枝杆菌与结核分枝杆菌检测方法的建立[0036]1、牛结核分枝杆菌MPB70基因的扩增
[0037]以已知M.bovis标准菌株为材料提取的DNA作为模板，应用上游引物和下游引物进行扩增。反应体系为50 μ L =IOXLAPCRBufferII (Mg2+Plus) 5 μ L、
2.5mMdNTPMixture8 μ L、LATaq0.5 μ L (5U/ μ L)、模板 2 μ L，10 μ mol/L 的上、下游引物分别为I μ L，灭菌超纯水32.5 μ L。反应程序为94°C预变性3min，然后进入94°C 30s, 58°C 30s，72°C 30s,共进行30个循环；72°C延伸lOmin，最后停止于4V。对PCR产物进行琼脂凝胶电泳鉴定。然后按照琼脂糖凝胶回收试剂盒的说明进行切胶回收。
[0038]2、质粒标准阳性模板的制备
[0039]将回收的目的片断克隆至PEAST-T3载体，重组质粒送华大基因进行测序，将测序结果与序列表中SEQIDN0.3所示的序列进行比对，正确的重组质粒为阳性，将其命名为PEAST-T3-BMP70。
[0040]将pEAST-T3-BMP70质粒作为阳性标准品，用紫外分光光度计测定PEAST-T3-BMP70质粒浓度为450ng/ μ L，按照下述公式计算出每μ L质粒中的DNA拷贝数，结果拷贝数为2.19 X 101°拷贝/ μ L。
[0041]质粒拷贝数浓度(copies/μ L)=质粒浓度X (6.02 X IO23)/DNA碱基数X 2 X 324.5 (碱基的平均分子量) [0042]3、SYBRGreen I实时荧光定量PCR的扩增条件的建立
[0043]设立引物终浓度梯度为0.2~1.0moI/L,以确定反应的最佳引物浓度；设立温度梯度为59-65°C，根据PCR扩增结果，选取最佳退火温度。以Ct最小值、荧光最高值、熔解曲线显示只有单特异峰为标准，分别对退火温度、引物浓度、循环条件进行优化(接下来的步骤4中的各项参数即为优化结果)。
[0044]4、标准曲线的建立
[0045]将质粒pEAST-T3-BMP70按10倍进行倍比稀释至2.19X 106_2.19X10°拷贝数/μ L,以每一个标准品(每一浓度平行做3管重复)和待测样本为模板进行SYBRGreen I实时荧光定量PCR扩增。扩增反应体系为20 μ L:2 X SYBRPremixExTaqII 10 μ L，质粒PEAST-T3-BMP70:2 μ L，浓度为 10 μ mol/L 的 BMP70 上游引物和下游引物(如 SEQIDN0.1、2所示)各0.5 μ L，RNaseFreeddH207 μ L。同时设置空白对照(以等量RNaseFreeddH2O代替模板)。然后进行扩增，反应程序如下:
[0046]预变性:95°C30s (升温速率 4.4°C /s)，Icycle0
[0047]PCR:分析模式:定量分析，95°C 5s(升温速率4.4°C /s), 60 °C 30s(升温速率
2.2V /s, AcquisitionMode:Single),40cycleso
[0048]融解:分析模式:融解曲线，95°C IOs (升温速率4.4 °C /s),60°C I分钟(升温速率 2.2°C /s), 95。。(升温速率 0.11°C /s, AcquisitionMode: Continuous, Acquisitions: 5per°C )，Icycle0
[0049]降温:50°C30s (升温速率 2.2°C /s)，Icycle0
[0050]如图1、2、3所示，根据待测样品中目的基因的拷贝数，便可以推导出养殖场环境中气溶胶牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的浓度(Copies/m3air)。结果说明本方法能有效地检测养殖场环境中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的浓度。
[0051]5、特异性检测[0052]按照上述步骤4建立的SYBRGreen I实时荧光定量PCR方法进行特异性试验，检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的特异性结果，如图4所示，I和2号曲线分别是以牛分枝杆菌和结核分枝杆菌为DNA模板的扩增曲线，3-11分别是禽分枝杆菌、副结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌和ddH20为模板，均没有特异性荧光曲线。证实所设计的引物扩增牛分枝杆菌与结核分枝杆菌异性好，与其它检测菌株无交叉反应。因此，步骤4用BMP70上游引物和下游引物建立的SYBRGreen I实时突光定量PCR检测方法可用于鉴定未知样本是否有牛分枝杆菌与结核分枝杆菌核酸的存在。
[0053]实施例2养殖场不同环境中待检测气溶胶样品中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测
[0054]1、牛分枝杆菌与结核分枝杆菌气溶胶样品的制备
[0055]在奶牛场的不同环境中(奶牛舍、运动场、挤奶厅、产房等)，应用MS-1型空气微生物采样箱，通过国际标准的AGI采样器采集牛分枝杆菌与结核分枝杆菌气溶胶样本。采样器放置高度为距地面1.5m，然后将10mLpH7.0的PBS(0.01% (V/V)牛血清白蛋白)注入Proton采样器，同时滴加一滴橄榄油。将Porton冲击式稳流器的一端接到主机入气口上，另一端用橡胶管连接到Proton采样器的出气口上。采样流量为12.5L/min，采样时间为20min。采样结束后将采样器内的采集液收集到IOmL离心管保存用于检测。
[0056]2、气溶胶模板DNA制备
[0057]气溶胶收集液12000r/min离心3min，弃上清，采用细菌基因组DNA提取试剂盒制备DNA模板。将所有 模板溶于50 μ LddH2O, _20°C存储备用。
[0058]3、SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测
[0059]反应体系与反应条件同实施例1中的步骤4，数据的收集和扩增曲线的生成由仪器自带软件GeneScanningSoftwareVersionl.5完成。结果如图5所示，1:质粒标准品
2.19X102拷贝数/yL，2:为气溶胶检测阳性样本。3-5:为气溶胶检测阴性样本，6:为阴性对照。根据待测样品中目的基因的拷贝数，便可以推导出奶牛场不同环境中气溶胶牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的浓度。
[0060]结果说明本方法能灵敏地检测出奶牛场不同环境中的气溶胶牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的浓度。
【权利要求】
1.一种检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，其特征在于:步骤如下: (1)采集气溶胶样本； (2)提取气溶胶样本的基因组总DNA； (3)检测:以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenI实时荧光定量PCR，具体如下: 所述试剂盒由特异性引物、PEASY-T3-MPB70阳性标准质粒、SYBRGreen I实时荧光定量PCR试剂和ddH20组成； 所述pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒是由序列为SEQIDN0.3所示的DNA片段与PEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒； 所述特异性引物的序列如下:
MPB70-F:5/ -TGACCAGCATCCTGACCTACC-3'；
MPB70-R:5/ -CGGCGTTACCGACCTTGA-3'； (4)建立标准曲线和溶解曲线:建立pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线； (5)判断:若溶解曲 线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有牛分枝杆菌或/和结核分枝杆菌；若溶解曲线为一条直线，贝1J表明气溶胶样本中不含有牛分枝杆菌以及结核分枝杆菌。
2.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，其特征在于:所述步骤(1)中，采集气溶胶样本的方法为:采用全玻璃液体冲击式采样器，以IOmLpH值7.0的磷酸盐缓冲液为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集气溶胶样本。
3.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，提取基因组总DNA的方法为:将采集到的IOmL气溶胶样本在室温下12000r/min离心3min，弃上清液，应用细菌基因组DNA试剂盒提取总DNA，每个样本用50 μ LddH2O 溶解。
4.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，PCR的扩增反应体系为20 μ L，包括2X SYBRPremixExTaqII 10 μ L，模板2 μ L，10 μ mol/L的上游引物和下游引物各0.5 μ L, RNaseFreeddH207 μ L。
5.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，PCR的反应条件为:预变性95°C 30s，然后95°C变性5s、60°C退火延伸30s进行40个循环，每个循环结束后采集荧光信号；溶解曲线的条件为95°C 10s,65V 60s，升温至95°C，最后50°C 30s反应结束。
6.用于检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的特异性引物，其特征在于:序列如下:
MPB70-F:5/ -TGACCAGCATCCTGACCTACC-3'；
MPB70-R:5/ -CGGCGTTACCGACCTTGA-3'。
7.权利要求6所述的特异性引物在制备检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的试剂盒中的应用。
8.权利要求6所述的特异性引物在检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌中的应用。
9.一种检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒由特异性引物、pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒、SYBRGreen I实时荧光定量PCR试剂和ddH20组成；所述pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒是由序列为SEQIDN0.3所示的DNA片段与PEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒； 所述特异性引物的序列如下: MPB70-F:5/ -TGACCAGCATCCTGACCTACC-3'； MPB70-R:5/ -CGGCGTTACCGACCTTGA-3'。
10.权利要求9所述 的试剂盒在检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103981260SQ201410188964
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】何洪彬, 赵贵民, 王洪梅 申请人:山东省农业科学院奶牛研究中心