专利名称：一种基于Ipr1基因构建的巨噬细胞异性打靶载体和重组细胞的制作方法
一种基于Iprl基因构建的巨噬细胞异性打靶载体和重组细胞技术领域
本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及一种基于Iprl基因构建的巨噬细胞异性表达载体和重组细胞。
背景技术：
牛结核病是由M.bovis引起的一种人畜共患传染病，在发展中国家是牛疾病中最具灾难性的疾病之一(Berrada and Bar jas-Ro jas，1995)。牛型结核分枝杆菌主要侵害牛， 牛结核病是由牛分枝杆菌所引起的一种人畜共患的的慢性传染病，其病变特征为病牛逐渐消瘦，在组织器官中形成结节性肉芽肿和干酪样坏死。牛结核病因其易传染，危害严重，因此世界动物卫生组织将其列为B类传染病，我国将其列为二类动物传染。其传播流行影响着畜牧业的持续发展和人类的健康。所以，控制牛结核病是一个关系到控制人类结核病能否成功的重要因素。但是目前对结核病的治疗只能采用抗生素治疗，如链霉素、卡那霉素等。长期使用抗生素会使细菌产生抗药性，所以寻求一种新的治疗结核病的方法迫在眉睫。
随着分子生物学和分子遗传学及基因工程技术的发展与完善，为动物抗病育种提供了新的思路。体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力(GOO J,et al.An approach for producing transgenic cloned cows by nuclear transfer of cells transfected with human alpha 1-antitryp sin gene[J]. Theriogenology,2006,65(9) 1800-1812.)，该技术的优点是基因转移在体细胞培养阶段进行，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植(SCNT)，这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本(Wheeler MB, WaktersE Μ.Transgenic technology and applications in swine[J]. Therioge nology,2001,56 1345-69.)。2006年，美国科学家Maga等培育出在乳腺中特异表达人溶菌酶的转基因山 ^ (Maga EA et al. Consumption of milk from transgenic goat expression human lysozyme in the mammary gland result in modulation of intestinal microfluro[J]. Transgenic Res, 2006，15 :515-519)。2009年，西北农林科技大学生物工程研究所培育出在乳腺中特异表达人防御素的转基因奶牛。现在对于体细胞转基因和克隆技术掌握的比较成熟。
2005年pan等发现结核病的发生是与胞内病原体抗性基因I(Iprl)有关，该研究证明对结核杆菌易感的动物是由于机体没有Iprl表达，且该基因仅在巨噬细胞中表达 (Pan H,et al. Iprlgene mediates innate immunity to Tuberculosis[J] · Nature，2005， 434(7034) :767-772)。这为研究防治结核病提供了新的可能利用体细胞转基因和体细胞克隆相结合的方式，使得缺少Iprl表达的牛通过生物技术手段实现Iprl表达，以达到抗结核病的目的。发明内容3
本发明解决的问题在于提供一种基于Iprl基因构建的巨噬细胞异性表达载体和重组细胞，并以构建的包含Iprl巨噬细胞特异性打靶载体的新生牛耳成纤维细胞系作为核供体细胞的，为预防及控制牛结核病的传播和流行奠定坚实的基础。
本发明是通过以下技术方案来实现
一种重组Iprl基因，在Iprl基因的上游连接牛巨噬细胞特异性启动子MSRl，构成重组基因MSRl-Iprl。
所述的重组Iprl基因中，Iprl基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，MSRl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
所述的重组Iprl基因，在MSRl的上游连接如SEQ. ID. NO. 3所示的同源臂LA，在 Iprl的下游连接如SEQ. ID. NO. 4所示的同源臂SA，构成重组基因LA-MSRl-Iprl-SA。
在LA与MSRl之间还设有两个Loxp序列，两个Loxp序列之间设有抗生素正筛选基因。
在通用型打靶载体上克隆重组基因MSRl-Iprl，并克隆包含牛观号染色体SP-A与 MATlA基因之间间隔序列的同源臂。
所述的通用型打靶载体为PA2T，在SVpolyA与Loxpl序列之间克隆如SEQ. ID. NO. 3所示的同源臂LA，在Loxp2序列的下游克隆重组基因MSRl-Iprl，并在重组基因 MSRl-Iprl的下游克隆如SEQ. ID. NO. 4所示的同源臂SA，得到重组打靶载体pLMIS。
所述以新生牛耳成纤维细胞为宿主细胞，通过转染重组打靶载体pLMIS，将目的基因Iprl整合到宿主细胞的基因组。
所述的目的基因Iprl整合到牛28号染色体SP-A与MATlA基因之间。
所述的宿主细胞为8 10代的新生牛耳成纤维细胞，将酶切后线性化的重组打靶载体pLMIS通过电穿孔转染的方式转染宿主细胞。
所述的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果
1、本发明构建了重组Iprl基因MSRl-Iprl，通过在Iprl基因5'端连接 MSRl启动子使Iprl基因在牛的巨噬细胞中特异的高效表达；并进一步构建重组基因 LA-MSRl-Iprl-SA,使目的基因定点整合在牛28号染色体SP-A与MATlA基因之间。
2、本发明将目的基因Iprl定点插入到牛观号染色体SP-A和MATlA之间，构建了 Iprl巨噬细胞特异性打靶载体pLMIS，将其转染到新生牛耳成纤维细胞，通过G418和GCV 正负筛选，构建转基因的新生牛耳成纤维细胞系，通过PCR和Southern blot鉴定证实目的基因Iprl定点整合到新生牛耳成纤维细胞的基因组。
3、本发明以定点整合Iprl的新生牛耳成纤维细胞为供体细胞，通过体细胞核移植的方法，生产出转Iprl基因的克隆牛5头，其中1头死亡。通过多重PCR，3' -PCR和 Southern blot检测确定死亡的(TDl)和4头存活的牛(TLl 4)为定点插入Iprl的转基因克隆牛。提取TDl肝组织和肺组织总RNA，实时定量PCR检测SP_A、SP_D、MAT1A和MBL-A 的表达。结果表明，与正常牛相比，这4个基因的表达没有显著性差异。
4.本发明以定点整合Iprl的新生牛耳成纤维细胞为供体细胞核移植生产出的转基因牛(TLl 4)的外周血单核细胞(PBMC)，用M. bovis感染后，裂解细胞，检测胞内荷菌量，结果表明转基因牛PBMC胞内荷菌量明显低于正常牛。
图1是ECORl和I^stl双酶切鉴定pMD-Iprl载体的结果图2是MSRl启动子扩增的电泳检测结果；
图3是同源臂LA扩增的电泳检测结果；
图4是同源臂SA扩增的电泳检测结果；
图5是重组载体pMIGS的构建流程图6是重组打靶载体pLMIS的构建流程图7是重组打靶载体pLMIS的部分元件连接示意图8是Iprl基因插入牛28号染色体的插入位点示意图9是pLMIS酶切鉴定结果图10是筛选的重组阳性单克隆细胞放大示意图(100X)；
图11是阳性单克隆细胞的PCR鉴定结果图12是阳性单克隆细胞的Southern blotting鉴定结果图13是阳性单克隆细胞的核型分析图14是阳性单克隆细胞作为供核细胞得到的囊胚；
图15是转基因牛多重PCR检测结果；
图16是转基因牛3' -PCR检测结果；
图17是转基因牛Southern blot检测结果；
图18是转基因牛插入位点两端基因定量结果；
图19是转基因牛PBMC中Iprl的表达检测结果；
图20是转基因牛PBMC感染M. bovis后胞内荷菌量检测结果；具体实施方式
本发明首先从牛血液基因组扩增MSRl启动子及同源长臂和短臂，并将Iprl基因和上述片段连接到通用型打靶载体PA2T上，构建成巨噬细胞特异性打靶载体pLMIS，其次用电转染法将线性化的PLMIS导入新生牛耳成纤维细胞，经G418和GCV正负筛选获得阳性细胞克隆，经PCR和Southern blot鉴定，证实目的基因Iprl定点整合到新生牛耳成纤维细胞的基因组。对生成的克隆牛的检测结果表明所得的牛为定点插入Iprl的转基因克隆牛，并且能够抵抗M. bovis感染。
下面结合附图和实验对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明解释的而不是限定。
1、巨噬细胞特异性打靶载体pLMIS的构建
1. 1目的基因Iprl的克隆
根据GeneID :AY845948所公布的Iprl基因序列设计引物Pl和P2，提取C57小鼠的肺组织总RNA，经反转录获得cDNA，以cDNA为模板用引物P1、P2进行PCR扩增，所述的引物对序列如下
IS :aggaacccct taactaatcc aggca ；
IA :gctgggacac tcagaggctc aaag ；
25μ L 的 PCR 反应体系为10 X PCR Buffer :5μ L，dNTP (2. 5mmol/L) :2 μ L， Pl (10 μ mol/L) : 1 μ L，Ρ2 (10 μ mol/L) : 1 μ L，LA 酶0. 3 μ L，模板 1 μ L,加超纯水至 25 μ L。
PCR反应条件为95 °C预变性5min ；95°C变性30s，64. 4°C退火45s，72°C延伸 2min, 35 个 PCR 循环；72°C再延伸 IOmin ；
将纯化后的PCR克隆在pMD-18T Vector的T位点，得到重组质粒pMD-Iprl，然后转化感受态细胞E. coli DH5ci，通过α-互补的蓝白斑筛选挑选重组子，摇菌、提质粒，经 ECORl和I^stl双酶切鉴定阳性重组质粒pMD-Iprl并送交南京金斯特公司测序。
酶切鉴定的结果如图1所示，其中泳道A为阳性重组质粒pMD-Iprl，泳道M为 Maker，可以看到pMD-Iprl载体被双酶切之后可以看到1614bp的目的条带。载体pMD-Iprl 测序结果显示，Iprl的测序与GeneID 公布的Iprl基因序列(AY845948)的⑶S区同源性为100%，Iprl基因具体的序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
1. 2MSR1基因启动子的克隆
根据MSRl序列(GenBank登陆号NC_007328)，从-862 +110设计引物序列，进行基因启动子的PCR扩增，引物序列如下
MS:ggaccatctc ttgatagaaa gtagg ；
MA :gtagacacac aaaaatacag agtagacc ；
PCR反应体系按照TaKafci公司的Ex Taq Premix说明书配置，在0. 2mL的PCR反应管中依次加入Ex Taq Premix 25 μ L、奶牛基因组DNA 1Μ1、上游引物MS lyL、下游引物 MA 1 μ L、ddH20 22 μ L ；
反应程序为94°C变性:3min后，94°C变性308，53.61退火458，721延伸lmin，进行30个循环，最后72°C延伸IOmin。
将回收纯化的PCR产物，其电泳鉴定结果如图2所示，可以看到972bp的目标片段，然后将PCR产物克隆在pMD 19-T Vector的T位点，得到重组质粒pMD_MSRl，然后转化感受态大肠杆菌DH5ci，蓝白斑筛选阳性菌落，提取质粒后，BamHI酶切鉴定重组质粒 pMD-MSRl，酶切鉴定正确后，送交南京金斯特有限公司进行序列测定，MSRl具体的序列如 SEQ. ID. NO. 2 所示。
1.3同源臂的扩增
根据血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒说明，提取奶牛基因组DNA。通过 NCBI Map Viewer上的牛沘号染色体序列，利用生物软件PrimePremier 5. 0从:35131 35147kb (NW_001494471. 2)设计引物序列如下
长臂扩增引物
LS :taccgtcttc tgaaactgct ctctgct ；
LA :gattacctct tggctttgtg actctgc ；
短臂扩增引物
SS:ggtgtaagtc tgtttgggtt catct ；
SA :gtagccttag aggactattc gcaa ；
PCR反应体系按照TaKafei公司的LATaq DNA聚合酶说明书配置，在0. 2mL的PCR 反应管中依次加入
10XPCR Buffer 5 μ L, dNTP Mixture (10 μ mol/L) 4 μ L、上游引物 LS/SS1 μ L、下游引物LA/SA 1 μ L, LA Taq DNA聚合酶0. 5 μ L (10U/μ L)、奶牛基因组DNA 1 μ L、超纯水 33. 5μ L ；
长臂反应程序为94°C变性:3min后，94°C变性30s，65. 6°C退火45s，72°C延伸 5min，进行30个循环，最后72°C延伸lOmin。
短臂反应程序为94°C变性:3min后，94°C变性30s，56. 3 °C退火45s，72 °C延伸 2min，进行30个循环，最后72°C延伸lOmin。
PCR产物回收纯化，长臂PCR产物LA(Long arm)鉴定结果如图3所示，可以看到获得了 4500bp左右的目标片段，短臂PCR产物SA(Short arm)鉴定结果如图4所示，可以看到获得了 1200bp左右的目标片段；然后将长臂PCR产物LA克隆在pMD 20-T Vector的T 位点，得到重组质粒pMD-LA ；短臂PCR产物SA克隆至pMD 18-T Vector的T位点，得到重组质粒pMD-SA ；并分别转化感受态大肠杆菌DH5ci，蓝白斑筛选阳性菌落，提取质粒后，SacI 酶切鉴定重组质粒PMD-LA与pMD-SA，送交南京金斯特有限公司进行序列测定。LA具体的序列如SEQ. ID. NO. 3所示，SA具体的序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
2、打靶载体pLMIS的构建
为了构建Iprl打靶载体，在上述构建的引物MS/MA的5'端添加酶切位点ClaI/ SpeI Pf 123 II ；IS/ΙΑ 的 5'端添加酶切位点 Pf 123 II /SpeI NheI ；LS/LA 的 5'端添加酶切位点SgsI/Bspl407I ；SS/SA的5 ‘端添加酶切位点Nhel/Spel。分别以pMD-MSRl、 pMD-Iprl、pMD-LA与pMD_SA为模板扩增添加酶切位点的启动子MSRl、目的基因Iprl、同源长臂LA与短臂SA,然后，除同源长臂LA克隆到pMD 20-T载体上之外，其余三条片段分别克隆到pMD 18-T载体上，构建成重组质粒pMSRl、plprl、pLA与pSA。
考虑到T载体的盛载能力有限，以pGEM-3Z为骨架载体，构建重组质粒pMIGS，参见图5所述的构建流程图，具体构建流程为
将pMD-MSRl、pGEM-3Z经EcoR I/Sal I双酶切后连接，将MSRl启动子克隆到 PGEM-3Z载体上构成重组质粒pMG ；
然后将pMG、pMD-Iprl经Pf 123 II /Spe I双酶切后连接，将Iprl克隆到MSRl的下游，构成重组质粒PMIG ；
再将pMIG、pMD-SA经Nhe I/Spe I双酶切后连接，将同源臂SA克隆到Iprl的下游，构成重组质粒pMIGS。
参见图6所示的构建流程图，重组打靶载体pLMIS的构建为
首先，将pMD-LA、通用型打靶载体pA2T (陈兴启，孙达权等，通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定，生物工程学报，2008)经Sgs I/Bspl407I双酶切后连接，将同源臂LA 克隆到SVployA与Loxpl之间，构建成重组载体pA2T_L ；
然后再将pMIGS、pA2T-L经Cla I/Spe I双酶切后连接，将MSRl-Iprl-SA克隆到 Loxp2的下游，构成重组打靶载体pLMIS。
所构建的重组打靶载体pLMIS中，参见图6所示的pLMIS的质粒图谱和图7所示的目的元件的连接示意图，可以看到在SVpolyA与Loxpl序列之间克隆有同源臂LA，在Loxp2 序列的下游有MSRl-Iprl，在重组基因MSRl-Iprl的下游克隆有同源臂SA，Loxpl与Loxp2 序列之间设有抗生素正筛选基因neo
所构建的重组打靶载体pLMIS，在转染宿主细胞之后，可以通过同源臂LA、SA的重组，将重组基因MSRl-Iprl插入到牛观号染色体SP-A与MATlA基因之间(参见图8所示的插入位点示意图)。
对所构建的重组打靶载体pLMIS，进行以下鉴定
以重组打靶载体pLMIS为模板，分别以IS/IA、MS/MA、LS/LA、SS/SA引物对进行扩增，确定每一个片段都被连接到载体上；
分别进行Sgsl/Clal双酶切鉴定和Sac II酶切鉴定；
以上鉴定结果如图9所示，其中1为=Trans 5K DNA Marker ；2 :LA扩增；3 Iprl扩增；4 :MSR1启动子扩增；5 :SA扩增；6 :Iprl_SA扩增；7 :SgsI/ClaI双酶切产物，得到5. 6kb 和11.6kb的片段；8 =Sac II酶切产物，得到17. 2kb的片段，9 质粒pLMIS ；10 =Trans 15K DNAMarker ；以上检测将结果均与预期结果一致，重组打靶载体pLMIS构建成功。
2、pLMIS转染新生牛耳成纤维细胞(BPFs)构建重组细胞系
2. 1新生牛耳成纤维细胞的培养
将BPFs解冻后，接种到含有2mmol/L的L-谷氨酰胺、5ng/mL bFGF和10 % FBS 的DMEM培养液中，于37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱内培养，每3d换液，在细胞密度达到 95%左右时传代。
选取8 10代传代的细胞达到90%汇合的新生牛耳成纤维细胞，作为用于转染的宿主细胞。
2. 2、G418和GCV筛选浓度的确定
以G418和GCV作为重组细胞的筛选药物，虽然只有细胞中存在neo基因时，细胞才能分解G418使其免受毒害，但在较低浓度下细胞也能生长，为排除细胞本身的适应性造成的假阳性，很有必要测定G418的最小致死浓度以确定基因打靶过程中G418的筛选浓度。 BFPs经过以不同浓度的G418进行筛选培养7d结果发现成纤维细胞全部死亡的最低G418 浓度是600 μ g/mL，所以采用600 μ g/mL G418作为BFPs的最小致死量。
哺乳动物细胞中虽然不存在HSV-tk基因，但是GCV在较高浓度条件下能改变细胞膜的通透性，从而导致细胞死亡，因此很有必要测定GCV的最大致死浓度以确定基因打靶过程中GCV的筛选浓度。用不同浓度的GCV (0 100 μ g/mL)处理正常非转染细胞，发现浓度大于10μ g/mL，作用IOd后细胞开始死亡，低于此浓度时对细胞无毒性。以0 10 μ g/ mL的GCV作用转染pA2T的BFPs时，发现作用IOd后，当GCV浓度小于5 μ g/mL时，细胞就大量死亡，所以将5 μ g/mL作为GCV的筛选浓度。
2. 3、细胞转染及筛选
在60mm培养皿培养的BPFs达到90%汇合时，消化悬浮细胞。吸取细胞悬液(细胞数量约2 X IO6)，离心后，用无血清培养液重悬，再次离心，弃去上清。用电转液悬浮细胞， 加入10 μ g SgsI酶切线性化后的重组打靶载体pLMIS，混勻，4°C放置lOmin，转移至0. 4cm 电转杯，在1250v/cm、lms条件下电穿孔，重复3次。
电击完毕后，在37°C放置lOmin，接种在IOcm培养皿中，添加IOmL含10% FBS的 DMEM培养液，于38°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱内培养。电转染3 后，换成含有600 μ g/ mL G418的DMEM培养液经行正筛选，待对照组细胞死完，将G418浓度减到300 μ g/mL继续培养3 4d ；然后在培养液中加入5 μ g/mL GCV进行负筛选，每2 3d更换一次培养液， 筛选10 13d后，可见有细胞克隆形成。8
将边缘清晰、生长旺盛的细胞克隆挑取后转移至96孔细胞培养板中。待细胞克隆长至80% 90%密度时，传代接种M孔板中。细胞数量扩增到一定数量，消化、分离出一半的细胞，提取基因组用于PCR鉴定，其余细胞继续扩增培养。挑取的单克隆细胞扩大培养后，可见细胞形态良好，生长活力旺盛，单克隆细胞放大示意图(100X)如图10所示。
2. 4、细胞单克隆的PCR及Southern blot鉴定
提取阳性重组细胞的基因组DNA，根据同源臂及Iprl的基因序列，设计鉴定引物 P1/P2，P3/P4和P3/P5，具体如表1所示
表IPCR鉴定扩增引物对
权利要求
1.一种重组Iprl基因，其特征在于，在Iprl基因的上游连接牛巨噬细胞特异性启动子 MSRl，构成重组基因MSRl-Ipr 1。
2.如权利要求1所述的重组Iprl基因，其特征在于，Iprl基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，MSRl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3.如权利要求1所述的重组Iprl基因，其特征在于，在MSRl的上游连接如SEQ. ID. NO. 3所示的同源臂LA，在Iprl的下游连接如SEQ. ID. NO. 4所示的同源臂SA，构成重组基因 LA-MSR1-Iprl-SA。
4.如权利要求3所述的重组Iprl基因，其特征在于，在LA与MSRl之间还设有两个 Loxp序列，两个Loxp序列之间设有抗生素正筛选基因。
5.一种重组Iprl基因构建的巨噬细胞特异性打靶载体，其特征在于，在通用型打靶载体上克隆重组基因MSRl-Iprl，并克隆包含牛28号染色体SP-A与MATlA基因之间间隔序列的同源臂。
6.一种重组Iprl基因构建的巨噬细胞特异性打靶载体，其特征在于，所述的通用型打靶载体为pA2T，在SVpolyA与Loxpl序列之间克隆如SEQ. ID. NO. 3所示的同源臂LA，在 Loxp2序列的下游克隆重组基因MSRl-Iprl，并在重组基因MSRl-Iprl的下游克隆如SEQ. ID. NO. 4所示的同源臂SA，得到重组打靶载体pLMIS。
7.基于权利要求6所述的重组Iprl基因构建的巨噬细胞特异性打靶载体构建的重组细胞，其特征在于，以新生牛耳成纤维细胞为宿主细胞，通过转染重组打靶载体pLMIS，将目的基因Iprl整合到宿主细胞的基因组。
8.如权利要求7所述的重组细胞，其特征在于，所述的目的基因Iprl整合到牛观号染色体SP-A与MATlA基因之间。
9.如权利要求7所述的重组细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为8 10代的新生牛耳成纤维细胞，将酶切后线性化的重组打靶载体pLMIS通过电穿孔转染的方式转染宿主细胞。
10.权利要求7所述的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。
全文摘要
本发明公开了一种基于Ipr1基因构建的巨噬细胞异性打靶载体和重组细胞，通过在Ipr1基因5′端连接MSR1启动子使Ipr1基因在牛的巨噬细胞中特异的高效表达；并进一步构建重组基因LA-MSR1-Ipr1-SA，使目的基因定点整合在牛28号染色体SP-A与MAT1A基因之间。构建了Ipr1巨噬细胞特异性打靶载体pLMIS，将其转染到新生牛耳成纤维细胞，通过G418和GCV正负筛选，构建转基因的新生牛耳成纤维细胞系，作为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚；胚胎移植后，生产出定点插入Ipr1基因的转基因牛5头，其中4头存活，转基因牛对M.bovis有抗性。
文档编号C12N15/12GK102517294SQ201110402670
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者何小宁, 张涌, 权富生, 王勇胜 申请人:杨凌科元克隆股份有限公司, 西北农林科技大学