山羊结核病pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种山羊结核病PCR检测试剂盒，本发明的实施例：山羊结核病PCR检测试剂盒，它包括250μL的PCRpremix缓冲液，150μL超纯水，50μL的MarkerDL2000，40μL浓度为10μmol/L的上引物及40μL浓度为10μmol/L的下引物，20μL阴性对照以及20μL阳性对照。本发明根据牛结核分枝杆菌特异性基因片段设计引物，利用该引物建立了快速、敏感、特异的诊断山羊结核病的PCR检测方法。将其应用在PCR快速检测试剂盒中，可快速检测出山羊结核病，并且具有良好的特异性及敏感性。本发明检测结果准确，并且快捷、灵敏，操作简单，使用效果好。
【专利说明】山羊结核病PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种山羊结核病PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]结核病(Tuberculosis)是由结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起人、畜、禽共患的一种慢性传染病。山羊结核病是由牛分枝杆菌(M.bovis)引起的一种人畜共患慢性传染病，该病被国际兽疫局(OIE)列为B类动物疾病，其传播和流行影响着畜牧业的持续发展和人类的健康。传统的牛结核分枝杆菌检测方法主要是细菌学检查，但由于繁琐费时、检出率低、灵敏度差，已不能满足当前疫病检疫的需要。分离培养需要周期长，一般需要广2个月。而传统的结核菌素皮内变态反应(PPD)检测方法，不断有报道存在非特异性反应。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是:提供一种山羊结核病PCR检测试剂盒，它可以快速检测山羊结核病，并且简便、灵敏、准确、特异性强。
[0004]本发明是这样实现的:山羊结核病PCR检测试剂盒，它包括250 μ L的PCR premix缓冲液，150 μ L超纯水，50 μ L的Marker DL2000，40 μ L浓度为10Mmol/L的上引物及40 μ L浓度为lOMmol/L的下引物，20 μ L阴性对照以及20 μ L阳性对照；上游引物的序列为:5’_ATCAGCGACTACCTGGCCGAAG-3’ ；下游引物的序列为:5’ - GTGGCGTGCCGTTCTCGTCG-3’。
[0005]阴性对照为超纯水。
[0006]阳性对照标准山羊`结核杆菌的PCR产物。
[0007]PCR premix 缓冲液由 3 mmol/ul 的 MgCl2, 500pmol/ul 的 dNTP 2.0 μ L, 25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ L Taq 酶组成，其 PH 值为 ρΗ8.3。
[0008]为了验证本发明的技术效果，进行了以下实验:
山羊结核病PCR诊断方法的建立
1、材料与方法
1、I 材料
1、1、I 病料病料来自贵州省贵阳市、遵义市、安顺市、六盘水市、铜仁地区、黔南、黔东南、瓮安县等几个规模化养羊场和养羊专业户的送检材料及采集的山羊血清(或全血)。
[0009]1、1、2菌株牛分枝杆菌参考菌株[编号为93006(4)]购自中国药品生物制品检定所(北京)。羊大肠杆菌，羊链球菌，羊魏氏梭菌，金黄色葡萄球菌，羊多杀性巴氏杆菌为贵州省畜牧兽医研究所畜禽重大疫病监测防制重点实验室保存。
[0010]1、1、3 主要试剂 Goldview、Tris、EDTA、DL2000、Taq DNA Polymerase (5U/μ L)及相应10 X TaqBuffer、dNTP等购自宝生物(大连)工程有限公司；TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由宝生物(大连)工程有限公司合成。改良罗氏培养基，本实验室吴位?行同志惠赠。[0011]1、2 方法
1、2、1引物设计与合成
参照GenBank中牛分枝杆菌的pnca基因序列，应用DNAStar软件，遵循引物设计的基本原贝IJ，设计I对引物。5 ’ -ATCAGCGACTACCTGGCCGAAG-3 ’；下游引物的序列为:5’ -GTGGCGTGCCGTTCTCGTCG-3’。
[0012]预计扩增目的片段大小为241 bp，引物由宝生物(大连)工程有限公司合成。
[0013]1、2、2山羊结核病细菌培养
[0014]取新鲜全血接种于改良罗氏培养基上，37°C培养约15~30d，收集菌体进行抗酸染色镜检及PCR扩增。
[0015]1、2、3 核酸的提取取待检病料样品共约500mg，加入500 μ LPBS缓冲液，待检样品研磨后12000r/min离心取上清用于细菌基因组的提取。细菌基因组的提取参照TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA — 20°C保存。
[0016]1、2、4 PCR 扩增 PCR 反应在 25 μ L 体系中进行，Primerl/2 各 2 μ L、10 X TaqBuffer5 μ L>dNTP mixture4 μ L、Taq DNA polymerase0.5 μ L、ddH20加至 25 μ L,反应程序:94°C 5min ；94°C 30s,55°C lmin，72°C lmin，30 个循环；最后 72°C延伸 lOmin。取 5 μ LPCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
[0017]1、2、5 PCR反应条件的优化
[0018]对PCR反应条件，包括退火温度(53°C、55°C、58°C、60°C )，引物浓度(5 μ mol/L、10 μ mol/L、20 μ mol/L), Taq DNA polymerase浓度(0.5U、1U、2U、3U3.5U),以确定最佳反应条件，同时以双蒸水作为空白对照。多重PCR反应在50 μ L反应体系中进行，包括上下游引物各 2 μ L, IOXTaq BufferlO μ L, dNTP mixture8 μ L ；Taq DNA polymerasel μ L 用双蒸水补足至 50 μ L0 反应条件为:94°C 5min ；94°C lmin, 54 ~60°C lmin, 72°C lmin, 30 个循环；最后72°C延伸lOmin。取5 μ LPCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
[0019]1、2、6敏感性试验
[0020]将提取的牛分枝杆菌基因组用TU — 1800蛋白质核酸仪测定浓度后，经10倍系列稀释的核酸用于PCR反应，以确定建立的PCR的敏感性。
[0021]1、2、7特异性试验
[0022]以牛分枝杆菌、羊大肠杆菌，羊链球菌，羊魏氏梭菌，金黄色葡萄球菌，羊多杀性巴氏杆菌，空白水对照为模板进行PCR反应，以确定建立的PCR的特异性。
[0023]1、2、8重复性试验
[0024]应用建立的PCR方法，重复检测DNA样品3次以检验结果的可靠性。
[0025]1、2、9PCR对临床样品的检测
[0026]对2009~2012年贵州省贵阳市、遵义市、安顺市、六盘水市、铜仁地区、黔南、黔东南、瓮安县等几个规模化养羊场和养羊专业户采集的154份病料及864份山羊血清(或全血)进行检测，同时进行细菌培养。
[0027]2、结果与分析
2、1山羊结核病细菌培养实验
取新鲜全血接种于改良罗氏培养基上，37°C培养约15~30d，可观察到米黄色、粗糙、隆起、不透明、边缘不整齐、呈颗粒结节的菌落，菌体进行PCR扩增。2、2山羊结核病PCR检测方法的建立以
牛结核分支杆菌的DNA为模板，进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段约为241bp，与预期扩增的目的片段大小相吻合；阴性对照样本未扩增出条带(见图1)。结果与预期一致，此方法可用于山羊结核病的扩增。
2、3敏感性检测
将提取的牛分枝杆菌基因组用TU — 1800蛋白质核酸仪测定浓度后，经10倍系列稀释的用于PCR反应，当稀释度为10_6时仍可见清晰目的扩增条带，该方法可以检出的羊结核病目的基因最低DNA模板量为0.62ng/L (见图2)，说明该方法有较好的敏感性，病毒含量极少的情况下也可被检出。
2、4特异性检测
以牛分支杆菌、羊大肠杆菌，羊链球菌，羊魏氏梭菌，金黄色葡萄球菌，羊多杀性巴氏杆菌的DNA为模板进行PCR扩增，除牛分支杆菌扩增出I条约241bp的条带外，其它细菌及阴性对照均未见特异性片段(见图3)，说明建立的方法具有较好的特异性，如病料中含其它病菌也不受影响。
2、5重复性检测
应用建立的PCR方法，重复检测牛分枝杆菌细菌基因组3次结果均一致，说明建立的PCR方法具有良好的重复性。
2、6PCR的应用
对从贵州养羊场(专业户)采`集的154份临床病料利用建立的山羊结核病PCR方法进行检测，共检测出57份阳性样品，阳性率为53.2% (82/154)，细菌学检验阳性48份，血清(或全血)864份，检测出361份阳性样品，阳性率为41.8%( 361/864)，平均阳性率为43.5%(443/1018)，高于细菌学检验结果，说明临床检出率高，适合于临床诊断。
3、讨论
3.1
随着分子生物学的发展，PCR方法已经成为众多病原检测和分析的主要手段。本发明建立的山羊结核病PCR检测方法能够对临床样品进行快速、准确的检测及鉴定，结果表明，该诊断方法敏感性好、特异性高，具有广阔的应用前景。
3.2试验结果表明，采用PCR反应系统，敏感性结果显示最低核酸检测量为为0.62ng/L，特异性试验表明，除牛结核分枝杆菌的特异扩增带(241bp)外，同时检测羊大肠杆菌，羊链球菌，羊魏氏梭菌，金黄色葡萄球菌，羊多杀性巴氏杆菌，结果均为阴性。结果表明，该PCR方法具有很好的特异性和敏感性，可用于临床山羊结核病的早期快速诊断。
[0028]由于采用了上述技术方案，本发明根据牛结核分枝杆菌特异性基因片段设计引物，利用该引物建立了快速、敏感、特异的诊断山羊结核病的PCR检测方法。将其应用在PCR快速检测试剂盒中，可快速检测出山羊结核病，并且具有良好的特异性及敏感性。本发明检测结果准确，并且快捷、灵敏，操作简单，使用效果好。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]附图1为牛分支杆菌PCR扩增；
M: DL2000 ；1:牛分支杆菌PCR结果，2:阴性对照；附图2为PCR敏感性试验；
M: D2000 ;1~7:10-1~I(T7倍比稀释的DNA PCR结果；
附图3为PCR特异性试验；
M: DL2000 ；1:牛分枝杆菌PCR产物；2:大肠杆菌PCR产物；3:羊链球菌PCR产物；4:羊魏氏梭菌PCR产物；5:金黄色葡萄球菌PCR产物；6:羊多杀性巴氏杆菌PCR产物；7:空白水对照。
【具体实施方式】
[0030]本发明的实施例:山羊结核病PCR检测试剂盒，它包括250 μ L的PCR premix缓冲液，150yL超纯水，50yL的Marker DL2000，40 μ L浓度为10Mmol/L的上引物及40yL浓度为lOMmol/L的下引物，20 μ L阴性对照以及20 μ L阳性对照；；上游引物的序列为:5’ -ATCAGCGACTACCTGGCCGAAG-3’；下游引物的序列为:5’ - GTGGCGTGCCGTTCTCGTCG-3’；阴性对照为超纯水；阳性对照标准山羊结核杆菌的PCR产物；PCR premix缓冲液由3 mmol/ul的MgCl2，500pmol/ul 的 dNTP 2.0 μ L，25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ L Taq 酶组成，其 PH值为ρΗ8.3。`
【权利要求】
1.一种山羊结核病PCR检测试剂盒，其特征在于:它包括250 μ L的PCR premix缓冲液，150yL超纯水，50yL的Marker DL2000，40 μ L浓度为10Mmol/L的上引物及40yL浓度为lOMmol/L的下引物，20 μ L阴性对照以及20 μ L阳性对照；；上游引物的序列为:5’ -ATCAGCGACTACCTGGCCGAAG-3’ ；下游引物的序列为:5’ - GTGGCGTGCCGTTCTCGTCG-3’。
2.根据权利要求1所述的山羊结核病PCR诊断试剂盒，其特征在于:阴性对照为超纯水。
3.根据权利要求1所述的山羊结核病PCR诊断试剂盒，其特征在于:阳性对照为标准山羊结核杆菌的PCR产物。
4.根据权利要求1所述的山羊结核病PCR检测试剂盒,其特征在于:PCRpremix缓冲液由 3 mmol/ul 的 MgCl2, 500pmol/ul 的 dNTP 2.0 μ L, 25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ LTaq酶组成，其PH值为ρΗ8. 3。
【文档编号】C12Q1/04GK103509859SQ201310346637
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年8月9日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】冉懋韬, 余波, 谭诗文, 王凡, 艾玉萍 申请人:贵州省畜牧兽医研究所