专利名称：牛分枝杆菌lip突变体蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及基因工程技术，特别是牛分枝杆菌溶血磷脂酶突变体蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
牛结核病被国际兽疫局(OIE)列为B类动物疫病，是一种人兽共患传染病，可以通过吸入含菌气溶胶或食用受污染的乳制品而从牛传染到人。牛分枝杆菌是引起牛结核病 (bTB)的病原体，侵染宿主广泛，可感染多种家畜和野生动物，对人类和动物健康构成巨大危害。
溶血磷脂酶(Lysophospholipase)(以下简称LIP)广泛分布于哺乳类动物的组织和细胞中，在控制体内溶血磷脂的水平以保持正常的生物学功能方面起着重要作用。溶血磷脂酶可以催化溶血磷脂水解为磷酸甘油和溶血磷脂酸，是催化溶血磷脂失活的主要途径，被认为在调节生物活性脂质水平中起关键作用，溶血磷脂是磷脂代谢的中间产物，通常呈低水平地广泛分布于各种生物的细胞膜上，具有除垢剂样特性和溶膜特征，是一种很强的生物活性因子，磷脂代谢是结核分枝杆菌的各种代谢途径中最重要的一条途径，许多脂类都被发现与结核分枝杆菌的致病性和病原性有关系，有资料提出，脂类可以作为一种碳源，在慢性感染期促进了结核分枝杆菌的生长，在长期的结核杆菌休眠期它或许能贮存所需的能量并且可以作为膜脂形成所必须的一种贮藏形式，体内的脂类的贮藏对分支杆菌的生长很重要，并且对结核杆菌适应宿主细胞的环境也很重要。
利用基因工程重组技术，对牛分枝杆菌溶血磷脂酶蛋白进行克隆、原核表达、纯化及免疫印迹分析，进一步研究牛分枝杆菌溶血磷脂酶蛋白的功能，从而为掌握牛结核分枝杆菌的演化和致病机理以及控制该病具有十分重大的意义。目前涉及这一领域的研究尚处于空白。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种牛分枝杆菌LIP突变体蛋白；
本发明的目的之二是提供牛分枝杆菌LIP突变体蛋白制备方法；
本发明的目的之三是提供牛分枝杆菌LIP突变体蛋白的一种用途。
本发明的目的按照下述方案实现
一种牛分枝杆菌LIP突变体蛋白，其LIP蛋白中心区的2个半胱氨酸(Cys)分别突变成甘氨酸(Gly)和丝氨酸(kr)。
一种制备牛分枝杆菌LIP突变体蛋白的方法，其工艺过程包括
1)构建含pET 30a/LIP的基因工程菌；
2)利用改进的培养基扩大培养后，用IPTG诱导表达；
3)裂解菌体，溶解包涵体，纯化LIP突变体蛋白；
上述构建含pET 30a/LIP的基因工程菌的工艺过程为按照NCBI公布的NC_002945序列和编码甘氨酸和丝氨酸残基的密码子GGT、GGT、GGC和AGT、AGT、AGC的密码子设计合成并扩增其成熟蛋白的PCR引物，以牛分枝杆菌染色体DNA为模板，进行PCR扩增；扩增产物经琼脂糖电泳，回收720bp左右DNA片段，与pGEM-Teasy载体连接，转化DH5 α 感受态细胞；纯化重组质粒，用EcoR I酶切鉴定，并测序，测序正确的阳性质粒经Mc I/ KpnI双酶切后，与用经过Me I/Kpnl双酶切的pET 30a(+)连接后，转化到BL21 (DE3)菌株，用上述引物做菌落PCR，筛选阳性克隆，得到含有表达载体的宿主菌。
上述改进的培养基为蛋白胨15g，酵母提取物30g，葡萄糖5g，NaCl 10g，甘油 5ml，将上列组分溶解于900ml水中高压灭菌，冷却到50°C，随后加入IOOml灭菌的KC1， KH2PO4及Na2HPO4的溶液，使终体积为100ml，用0. 22um的滤膜过滤除菌。
上述裂解菌体，溶解包涵体，纯化LIP突变体蛋白的工艺过程为取出经IPTG诱导表达的菌液离心分离，菌体用裂解缓冲液重悬，在冰浴条件下超声破碎，离心，沉淀即为包涵体，将获得的包涵体蛋白用低浓度变性剂和/或温和去垢剂TritonX-IOO洗涤，沉淀用含 8mol/L尿素的包涵体溶解液溶解，溶解后的上清加适量上样缓冲液，混勻，进行SDS-PAGE， 电泳结束后用预冷的0. 25mol/L KCl浸泡胶至显示出乳白色的蛋白条带，切下目的条带放入透析袋内，用水平电泳洗脱装置洗脱目的蛋白，结束前，将透析袋换个方向电泳15min，电泳结束后，收集透析袋内的蛋白溶液，置于新透析袋，以PBS缓冲液透析过夜，透析后的样品，取上清液测定蛋白浓度，并进行SDS-PAGE电泳。
上述牛分枝杆菌LIP突变体蛋白作为抗原开发试剂盒。
本发明还对牛分枝杆菌LIP突变体蛋白的复性进行了验证
本发明采用透析复性，将洗脱的蛋白放入透析袋，依次用含有(T6mol/L浓度梯度的尿素的基础缓冲液(60mmol/L Tris HCl,2mmol/L EDTA，5mmol/LGSH，10%甘油，8mmol/ L PMSF)按浓度梯度由大到小，进行透析复性，每个浓度在4°C透析4、h，最后在pH 7. 4的 PBS缓冲液中透析过夜。
本发明提供了一种可高效表达LIP突变基因工程菌hherichia coliPET30/LIP。 该菌具有kana抗性，对人体无害，且在IPTG的诱导下，能够大量表达LIP突变体蛋白。
本发明还将获得的LIP突变体蛋白按《分子克隆》所述方法进行 Western-blotting.将纯化的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转膜后，加牛结核病阳性血清 (1 50比例稀释)，洗涤，加二抗(兔抗牛)和显色，结果发现LIP突变体蛋白能与牛分枝杆菌阳性血清发生特异性血清学反应。
本发明应用基因工程技术，首次在体外表达并获得了具有活性的牛分枝杆菌LIP 突变体蛋白，并且建立了纯化、复性的方法；利用本发明的方法，LIP蛋白的表达量可达 20mg/L培养基。
本发明揭示了牛分枝杆菌LIP突变体蛋白能够与牛分枝杆菌阳性血清发生特异性血清学反应，因此可以用牛分枝杆菌LIP突变体蛋白作为抗原来开发试剂盒。
图1是LIP的PCR扩增产物的电泳图，1为Marker，3和4为扩增产物；
图2是pET 30a-LIP重组载体的&ic I/Kpn I双酶切电泳图，1为Marker，2、3为重组载体；
图3是转化子经IPTG诱导pET 30a_LIP突变体蛋白表达的电泳图，1、2为空载体对照，3为蛋白Marker，4-9分别是重组蛋白在诱导2h、3h、4h、5h、6h、12h的IPTG诱导表达。
图4是纯化后的LIP突变蛋白电泳图，其中1为蛋白Marker，2为收集管；其中 1.低分子质量蛋白Marker ;2.纯化的重组蛋白；
图5是LIP突变体蛋白经Wfestern blotting显影后的图，其中3为蛋白Marker， 1、2为表达蛋白；
图6是牛分枝杆菌LIP突变体基因片段的核苷酸序列表；
图7是牛分枝杆菌LIP突变体蛋白表达载体构建示意具体实施例方式
1、基因工程菌的构建
根据GenBank中报道的牛分枝杆菌溶血磷脂酶基因核苷酸序列，用primer5. 0软件设计引物，并由上海Mgon公司合成。引物序列如下
LIP-S :5，-ATATGGTACCGAGCATGCCCGCCGCTACGAC-3‘(横线为 Kpn I 酶切位点)，
LIP-AS 5 ’ -GTACGAGCTCCTACAACCGCTCGGTGAGCCAG-3 ’ (横线为 c I 酶切位点)。
采用CTAB方法提取牛分枝杆菌基因组DNA。以牛分枝杆菌染色体DNA为模板，以 LIP-S、LIP-AS为引物，参照TaKaRa Ex Taq PCR试剂盒对溶血磷酯酶基因进行PCR扩增。 PCR反应总体积为50 μ L，模板DNA添加量为0. 5 μ g。PCR程序95°C热变性!Min ；再95°C 热变性lmin、60°C退火lmin、72°C延伸lmin，30个循环；然后72°C延伸IOmin0
反应产物经琼脂糖电泳(图1)，用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司B 型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收720bp左右DNA片段后，与pGEM-Teasy载体连接，转化DH5ci感受态细胞；再用北京天根生物医学科技有限公司的质粒小提试剂盒纯化提取重组质粒，测序，测序正确的阳性质粒经Me I/Kpnl双酶切后，与用经过Me Ι/Κρη I双酶切的pET30a (连接过夜，转化到BL21 (DE3)菌株，用上述PCR引物做菌落PCR，快速筛选克隆， 所得克隆再经Me Ι/Κρη I双酶切(图幻及0嫩测序鉴定。经上述筛选获得hherichia coli PET30/LIP。
2、重组蛋白的表达及纯化
培养基的制备蛋白胨15g，酵母提取物30g，葡萄糖5g，NaCl 10g，甘油5ml，将上列组分溶解于900ml水中高压灭菌，冷却到50°C，随后加入IOOml灭菌的KC1，KH2PO4及 Na2HPO4的溶液，使终体积为100ml，用0. 22um的滤膜过滤除菌。
将含有表达载体的宿主菌接种到改良的液体培养基，待菌生长到A6tltl约0. 8时，加终浓度为1. 2mmol/L IPTG，37°C分别诱导2h,3h,4h,5h,6hU2h后，取出菌液离心，菌体用裂解缓冲液(60mmol/L Tris HCl, 1. Ommol/L EDTA,40mmol/L NaCl，4%甘油，pH = 8. 0)重悬，在冰浴条件下超声破碎，8000-10000rpm/min，离心lOmin，沉淀即为包涵体，上清和沉淀用SDS-PAGE电泳检测(图幻。结果在预期的30ku处出现特异的、大量表达的蛋白条带，表达量占菌体总蛋白53.3%。
将获得的包涵体蛋白依次用洗涤液1(含lOmmol/L Tris HC1，0. 2mol/L尿素， 0. 5 % Triton X-100,10mmol/L EDTA，pH 8.0)和洗涤液 II (lOmmol/L TrisHCl,0. 5 % Triton X-100, lOmmol/L EDTA, pH 8.0)洗涤。然后用变性缓冲液(8mol/L 尿素，0. 5mol/L NaCl,20mmol/L Tris HCl，pH 7.8)溶解，溶解后的上清加适量上样缓冲液，混勻，进行 SDS-PAGE。电泳结束后用预冷的0. 25mol/LKCl浸泡胶至显示出乳白色的蛋白条带，切下目的条带放入透析袋内，用夹子将透析袋的两端夹紧。用水平电泳洗脱装置洗脱目的蛋白，一般洗脱3- 左右。结束前，将透析袋换个方向电泳15min。电泳结束后，收集透析袋内的蛋白溶液，置于新透析袋，以PBS缓冲液透析过夜。透析后的样品，取上清测定蛋白浓度，并进行SDS-PAGE电泳(图4)。
3、蛋白质的透析复性
将洗脱的蛋白放入透析袋依次在加有6mOl/L、3mOl/L、lmOl/L、0mOl/L尿素的基础缓冲液 60mmol/L Tris HCl,2mmol/L EDTA,5mmol/L GSH，10%甘油，8mmol/LPMSF)中进行透析复性，每个浓度在4°C透析4、h，最后在pH 7. 4的PBS缓冲液中透析过夜。复性结束后，利用美国Millipore 30KD蛋白收集管在4°C，5000rpm/min离心lOmin，弃去沉淀，上清即为复性好的蛋白。
4、Western-blotting按《分子克隆》所述方法进行。将纯化的蛋白样品进行 SDS-PAGE电泳，转膜后，加牛结核病阳性血清(1 50比例稀释)，洗涤，加二抗(兔抗牛) 和显色，结果发现LIP突变体蛋白能与牛分枝杆菌阳性血清发生特异性血清学反应(图5)。 具体步骤如下
SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在转移缓冲液中浸泡30min，将浸泡过的与胶同样大小的NC膜和滤纸，按纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫的结构，装入转印夹。转印时凝胶侧接负极，NC膜侧接正极，电泳槽冰浴，20V恒压转印池。转印结束后，置于封闭液中室温振摇封闭Ih ；取出NC膜置于用封闭液稀释好的牛结核病阳性血清阳性血清内，室温振摇池；PBST洗涤3次，每次5min ；置于用封闭液稀释好的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛的抗体溶液中，室温振摇Ih ；PBST洗涤3次，每次5min ；最后将NC膜浸入DAB溶液中显色，用蒸馏水冲洗终止反应。
5、牛分枝杆菌LIP突变体蛋白的核苷酸序列与编码的氨基酸序列
采用全自动测序仪对LIP突变体基因片段的核苷酸序列进行了测定。目的基因片段大小为720bp。测序结果表明，STI毒素中心的2个Cys分别成功突变成Ser和Gly，其它核苷酸序列与NCBI报道的序列一致。其序列表见图6。
权利要求
1.一种牛分枝杆菌LIP突变体蛋白，其LIP蛋白中心区的2个半胱氨酸(Cys)分别突变成甘氨酸(Gly)和丝氨酸(kr)。
2.一种制备牛分枝杆菌LIP突变体蛋白的方法，其工艺过程包括1)构建含PET30a/LIP的基因工程菌；2)利用改进的培养基扩大培养后，用IPTG诱导表达；3)裂解菌体，溶解包涵体，纯化LIP突变体蛋白。
3.如权利要求2所述的制备牛分枝杆菌LIP突变体蛋白的方法，构建含pET30a/LIP的基因工程菌的工艺过程为按照NCBI公布的NC_0(^945序列和编码甘氨酸和丝氨酸残基的密码子GGT、GGT、GGC和AGT、AGT、AGC的密码子设计合成并扩增其成熟蛋白的PGR引物，以牛分枝杆菌染色体DNA为模板，进行PCR扩增；扩增产物经琼脂糖电泳，回收720bp左右DNA 片段，与PGEM-T easy载体连接，转化DH5 α感受态细胞；纯化重组质粒，用EcoR I酶切鉴定，并测序，测序正确的阳性质粒经Me Ι/Κρη I双酶切后，与用经过Mcl/Kpn I双酶切的 PET 30a (+)连接后，转化到BL21(DE3)菌株，用上述引物做菌落PCR，筛选阳性克隆，得到含有表达载体的宿主菌。
4.如权利要求2所述的制备牛分枝杆菌LIP突变体蛋白的方法，其改进的培养基为 蛋白胨15g，酵母提取物30g，葡萄糖5g，NaCl 10g，甘油5ml，将上列组分溶解于900ml水中高压灭菌，冷却到50°C，随后加入IOOml灭菌的KC1，KH2PO4及Na2HPO4的溶液，使终体积为 100ml，用0. 22um的滤膜过滤除菌。
5.如权利要求2所述的制备牛分枝杆菌LIP突变体蛋白的方法，其裂解菌体，溶解包涵体，纯化LIP突变体蛋白的工艺过程为取出经IPTG诱导表达的菌液离心分离，菌体用裂解缓冲液重悬，在冰浴条件下超声破碎，离心，沉淀即为包涵体，将获得的包涵体蛋白用低浓度变性剂和/或温和去垢剂TritonX-IOO洗涤，沉淀用含8mol/L尿素的包涵体溶解液溶解，溶解后的上清加适量上样缓冲液，混勻，进行SDS-PAGE，电泳结束后用预冷的0. 25mol/L KCl浸泡胶至显示出乳白色的蛋白条带，切下目的条带放入透析袋内，用水平电泳洗脱装置洗脱目的蛋白，结束前，将透析袋换个方向电泳15min，电泳结束后，收集透析袋内的蛋白溶液，置于新透析袋，以PBS缓冲液透析过夜，透析后的样品，取上清液测定蛋白浓度，并进行 SDS-PAGE 电泳。
6.牛分枝杆菌LIP突变体蛋白作为抗原开发试剂盒。
全文摘要
本发明是一种牛分枝杆菌LIP突变体蛋白及其制备方法和应用，牛分枝杆菌LIP突变体蛋白中心区的2个半胱氨酸(Cys)分别突变成甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)。制备牛分枝杆菌LIP突变体蛋白的方法，工艺过程包括1)构建含pET 30a/LIP的基因工程菌；2)利用改进的培养基扩大培养后，用IPTG诱导表达；3)裂解菌体，溶解包涵体，纯化LIP突变体蛋白。本发明应用基因工程技术，首次在体外表达并获得了具有活性的牛分枝杆菌LIP突变体蛋白，并且建立了纯化、复性的方法；利用本发明的方法，LIP蛋白的表达量可达20mg/L培养基。
文档编号C12R1/32GK102533691SQ20091011748
公开日2012年7月4日 申请日期2009年9月30日 优先权日2009年9月30日
发明者周晶, 徐广贤, 李敏, 王玉炯, 贾浩 申请人:宁夏大学