专利名称：重组干扰素卡介苗菌株及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术，具体是一种重组干扰素卡介苗菌株及其制备方法。
背景技术：
膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，据统计大约75％的病例为浅表性膀胱癌，其中95％为高危浅表性肿瘤。高危浅表性肿瘤术后若不给予任何药物治疗，其近期复发率为60-90％。因此，预防膀胱肿瘤术后复发、治疗术后残余瘤与原位癌是临床亟待解决的重大问题。
卡介苗(BCG)是一种由毒力极强的牛型分枝杆菌形成的生物免疫调节剂，全世界广泛用于预防结核病，已证明其有高度的安全性和极少的严重并发症。膀胱腔内灌注BCG在预防肿瘤复发、治疗残留肿瘤和原位癌等方面已经取得了令人满意的临床疗效，但仍有30％-45％的病人对腔内BCG灌注治疗无反应，长期随访的患者甚至可达50％。此外，腔内BCG灌注亦可引起膀胱局部和全身反应，5％患者可出现严重并发症，0.5％甚至可以危及生命，也使BCG腔内灌注用于预防和治疗浅表膀胱肿瘤受到一定的限制。
近年来，干扰素(IFN)作为二线药物也用于膀胱灌注，治疗膀胱肿瘤。虽然其40％的缓解率明显低于BCG，但对部分BCG无反应的患者，IFN却有一定效果。此外，IFN的局部和全身毒性较小。因此，也引起了人们的高度重视。然而，该方案费用较高且需要多次反复灌注，影响了其进一步广泛应用。
基于上述BCG和IFN在膀胱肿瘤治疗方面应用结果，人们为了进一步提高膀胱肿瘤免疫治疗的疗效，采用小剂量BCG和IFN-α联合灌注。结果显示，该方案具有较好的耐受性和较高的完全反应率。在鼠膀胱癌模型的实验中也显示，BCG和IFN-α联合应用的疗效均优于二者单独应用。BCG和IFN-α联合应用时，由于降低了BCG的用量，从而减轻了其毒性，同时，又保持或提高了BCG的抗肿瘤活性。到目前为止，虽然IFN-α提高BCG的抗肿瘤作用的确切机制尚未清楚，但近来的研究结果显示，IFN-α可在以下几方面提高BCG的免疫活性(1)协同增加免疫细胞IFN-γ和IL-2的产生；(2)明显增加T细胞；(3)提高对膀胱肿瘤的直接作用，如抑制生长和诱导细胞因子(IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α)等。
中国专利1353183公开了“一种重组卡介苗菌株建立及其应用”，该发明通过构建一种携带有两种外源基因即IL-2基因和GFP基因的rBCG，使原有的BCG具有IL-2和GFP的功能，用猪苓多糖弥补生物制剂的不足，从而建立一种有效消除肿瘤细胞的方法。该发明的技术特征是利用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因，在穿梭质粒中插入IL-2基因片段，构成复合表达绿色荧光蛋白和白介素2重组BCG(rBCG-GFP-IL-2)菌株。
中国专利200410019473.2涉及一种“重组人共刺激分子卡介苗菌株及其制备方法”，菌种保藏号CGMCC No.1120。本发明首先进行hB7-2(IgC+IgV)片段聚合酶链反应并建立质粒pYL-hB7-2；经质粒转化，E.Coli-pYL-hB7-2单克隆菌落扩增、质粒提取和纯化；电泳、酶切及PCR反应鉴定pYL-hB7-2质粒卡介苗的电转化，rBCG-hB7-2单克隆菌落的挑选、扩增、鉴定。本发明与野生型卡介苗相比，在达到同样的甚至增加免疫效果的条件下，卡介苗用量降低，从而降低毒副作用；避免了直接使用细胞因子带来的高额费用和反复灌注的缺点；能在最为合适的时间和部位分泌细胞因子。一次接种可获得强而持久的抗肿瘤免疫。本发明可望为膀胱肿瘤临床治疗提供一种新型制剂。
发明内容
本发明为了降低卡介苗用量而减少其副作用，又能通过重组卡介苗的持续分泌细胞因子来解决直接使用细胞因子时所带来的高额费用及反复灌注的缺点，而提供一种重组干扰素卡介苗菌株及其制备方法。
本发明是按以下技术方案实现的。
一种重组干扰素卡介苗菌株，该菌株利用基因工程技术构建的phIFN-α-2B穿梭质粒，转导到BCG内，构建出rBCG-hIFN-α-2B菌株。该卡介苗菌株可以分泌hIFN-α-2B。
所述的重组干扰素卡介苗菌株，其phIFN-α-2B穿梭质粒含有phIFN-α-2BcDNA。
所述的重组干扰素卡介苗菌株，每毫升重组BCG菌液上清液的hIFN-α-2B含量平均为997.2pg。
一种重组干扰素卡介苗菌株的制备方法，该方法是phIFN-α-2B穿梭质粒的构建、转导并在BCG中的表达。
所述的制备方法，其hIFN-α-2BcDNA片段聚合酶链反应(PCR)反应。
上游引物CAAGggatccTGTGATCTGCCTCAAACCCACAG；下游引物GCCGgaattcTCATTCCTTACTTAAACTTTCTT。
所述的制备方法，其phIFN-α-2B质粒鉴定PCR反应上游引物5’ATCTTCACCATACGACGTCC 3’下游引物5’GTTAACTACGTCGACATCG 3’所述的制备方法，以含有hIFN-α-2B cDNA的质粒为模板进行PCR反应，然后将PCR产物纯化，利用BamHI、EcoRI进行双酶切反应，将酶切产物进行电泳，切胶回收DNA片段，即为具有粘性末端可用于连接的hIFN-α-2BcDNA；将pMAO-4质粒利用BamHI、EcoRI进行双酶切反应后电泳，切胶回收即为具有粘性末端的pMAO-4质粒片段；上述两个片段连接，形成phIFN-α-2B质粒。
本发明通过构建在BCG中具有高效表达分泌功能的穿梭质粒，将其转导到BCG中，使重组BCG能够分泌性表达hIFN-α-2B。该重组BCG与野生型BCG相比有以下创新之处①重组BCG能够分泌干扰素-α-2B，在达到同样甚至增加免疫效果的条件下可较野生型BCG降低用量，从而降低了毒副作用；②避免了直接使用细胞因子所带来的高额费用和反复灌注的缺点；③能够在最为合适的时间和部位分泌细胞因子。
重组BCG的生长情况和形态特征与野生型基本相同，传代10次后仍能稳定表达。
附图为重组pYL-hIFN-α-2B质粒示意图。
图中1 hIFN-α-2B基因序列 2卡那霉素抗性基因3 大肠杆菌复制起点 4分枝杆菌复制起点5 热休克蛋白60启动子 6信号序列。
具体实施例方式
下面结合附图及实施离对本发明进行详细说明。
一.材料与方法质粒载体质粒pMAO-4和含有hIFN-α-2B cDNA的质粒均由美国IOWA大学YI LUO教授提供。
二.方法(一)hIFN-α-2BcDNA片段PCR反应上游引物CAAGggatccTGTGATCTGCCTCAAACCCACAG，50μmol/l；下游引物GCCGgaattcTCATTCCTTACTTAAACTTTCTT，50μmol/l。
(二)pMAO-4质粒与hIFN-α-2BcDNA PCR产物的BamHI与EcoRI酶切pMAO-4质粒与hIFN-α-2BcDNA利用T4 DNA连接酶16℃水浴中过夜连接。
(三)质粒的转化每管加入100μl感受态细菌DH-5α，加入1μl phIFN-α-2B质粒，转化后样品接种到含30μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上。选择阳性菌落。在含有卡那抗性的LB固体培养基可出现许多散在淡黄色菌落。将这些单克隆菌落扩增并提取重组质粒。
(四)E.Coli-hIFN-α-2B单克隆菌落的扩增、WizardPureFection Plasmid DNAPurification System试剂盒提取质粒(五)phIFN-α-2B质粒的鉴定1.酶切重组质粒以BamHI和EcoRI进行双酶切后，电泳出现两条带，分别在500和5000bp处左右。
2.PCR上游引物5’ATCTTCACCATACGACGTCC 3’，80umol/l下游引物5’GTTAACTACGTCGACATCG 3’，80umol/l1％琼脂糖电泳，观察结果。以该对引物的上游引物进行的测序反应证明该质粒含有hIFN-α-2BcDNA序列，且与gene bank上序列完全相同。
3.测序4.将上述构建的phIFN-α-2B质粒为作模板。以pMAO-4质粒多克隆位点前的部分序列(5’ATCTTCACCATACGACGTCC 3’)作为引物进行测序。
(六)BCG的电转化1.感受态BCG的制备(1)7H9液体培养基的制备，A液7H9培养粉0.47g+Tween800.5ml+甘油0.5ml，加水至90ml，121℃高压灭菌(103.4Kpa)15分钟。B液Nacl 0.08g，牛血清白蛋白0.5g，葡萄糖0.2g，过氧化氢酶0.3ml，加水至10ml。0.22um滤膜过滤。待A液冷却至50℃时，加入已过滤的B液即为试验用7H9液体培养基。
(2)取购买的丹麦菌株BCG原浆液1ml，加入上述已配好的7H9液体培养基50ml中(不含抗菌素)放置到振荡摇床内。以150rpm速度连续振荡培养。取600nm处OD值为0.5左右BCG菌液50ml，冰浴1.5小时后4000rpm离心10分钟。弃上清，重悬沉淀。加入10％4℃预冷甘油20ml洗涤沉淀，再次离心。重复洗涤一次。以10％预冷甘油重悬沉淀并混匀分装到eppendorff管。直接用于电转或保存于-70℃备用。
2.电转前准备将5-15μg质粒DNA(溶于10-20μl液体)置于1.5ml管中。然后将100μl感受态BCG菌液倒入，使总体积不超过150μl，充分混合。加入到0.1cm的电转杯中。
3.电转条件电压1.8KV，电容25μF，电阻100Ω，0.1cm电转杯。
4.电转后处理电转后迅速将1ml不含卡那霉素的7H9培养基加入到电转杯中。混匀后转入7ml试管，180rpm振荡培养5小时。取200ul上述培养液涂布到含30ug/ml卡那霉素的7H10固体培养皿上，封口 膜严密封好培养皿，4～6周后选取阳性菌落。
(七)rBCG-hIFN-α-2B单克隆菌落的挑选、扩增及PCR模板的制备1.调取单个菌落接种到含有30μg/ml卡那霉素的10ml 7H9液体培养基中，振荡培养。当600nm处OD值为1.0左右时，取1ml菌液，10000rpm离心10分钟。
2.去上清，用双蒸水洗涤沉淀三遍，离心去上清。加入30μl双蒸水，混匀，煮沸10分钟。
3.10000rpm离心10分钟后，取上清液20μl作为模板进行PCR反应。
(八)hIFN-α-2B和野生型BCG混合培养与单纯野生型BCG培养比较为了探讨hIFN-α-2B是否影响BCG的正常生长，为重组BCG-hIFN-α-2B的建立提供依据，因此，将100万单位hIFN-α-2B与野生型BCG在7H9液体培养基中混合培养。将其结果与单纯培养的野生型BCG生长情况进行比较。从第一天到第七天它们均为近似对数生长，600nm处OD值单纯培养组从0.1升到1.29，混合培养组从0.1到1.33。第八天两者均稍有下降，分别为1.22和1.3。结果显示二者无显著性差异。
(九)phIFN-α-2B质粒转入BCG后重组BCG内、外表达产物的测定将对数生长期的野生型BCG制成感受态后，与上述已纯化的重组phIFN-α-2B质粒混合电转。4周左右在含有卡那抗性的7H10培养皿内开始出现少量散在的乳白色菌落，表面光滑，进行挑菌在含有卡那抗性的7H9液体培养基中扩增。菌液制作PCR反应模板。以根据hIFN-α-2B序列设计的一对引物进行PCR反应后电泳，在500bp处可出现一条条带。将该条带切胶回收测序，结果显示该条带即为hIFN-α-2BcDNA。
当重组BCG-hIFN-α-2B培养到600nm处10D值时，取1ml菌液离心，利用ELISA法测定上清液中hIFN-α-2B浓度作为细菌外含量，每毫升重组BCG菌液上清液的hIFN-α-2B含量平均为997.2pg；将离心后的沉淀物进行超声破碎后细菌内hIFN-α-2B含量平均为99.3pg。
(十)野生型BCG与重组BCG生长情况、形态学及活菌数比较从第一天到第七天两者均为近似对数生长期，600nm处OD值野生组从0.1升到1.29；重组组从0.13到1.2。第八天重组组进入平台期，为1.22，野生组稍有下降，也为1.22。野生型BCG与重组BCG生长无显著性差异。600nm处10D值野生型BCG活菌数为2.8×107CFU，重组型为2.6×107CFU。
重组BCG和野生型BCG抗酸染色均为阳性，均保持相互连接的特点。但重组BCG较野生型BCG稍大，余无明显异常。
连续传代10次后rBCG-hIFN-α-2B表达产物含量测定及形态学观察连续传代10次后再次利用ELISA法测定hIFN-α-2B含量。当培养到600nm处10D值时，每毫升重组rBCG-hIFN-α-2B细菌外hIFN-α-2B含量为990.3pg，菌体内为96.5pg。与第一代重组BCG相比基本相同，仍能分泌性表达hIFN-α-2B。形态学方面二者也未见明显差异。
该部分利用基因工程技术构建了phIFN-α-2B穿梭质粒，并将其转导到BCG内，构建出rBCG-hIFN-α-2B。测定了hIFN-α-2B在重组BCG内外的表达情况，同时还将其与野生型BCG生长与形态学特性进行了比较。进一步探讨了连续10代培养后hIFN-α-2B的分泌表达情况，为其应用于膀胱肿瘤的治疗奠定基础。
序列ctgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtagcaggaggaccttgatgctcctggcacagatgaggagaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatgactttggatttccccaggaggagtttggcaaccagtccaaaaggctgaaaccatccctgtcctccatgagatgatccagcagatcttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgggatgagaccctcctagacaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaagcctgtgtgatacagggggtgggggtgacagagactcccctgatgaaggaggactccattctggctgtgaggaaatacttccaaagaatcactctctatctgaaagagaagaaatacagcccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaacttgcaagaaagtttaagaagtaaggaatga本发明菌株分类命名为结核分枝杆菌，Mycobacteriumtuberculosis；已于2004年03月23日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市海淀区中关村北一条13号)保藏。菌种保藏编号CGMCC No.1121。
权利要求
1.一种重组干扰素卡介苗菌株，其特征在于该菌株利用基因工程技术构建的phIFN-α-2B穿梭质粒，转导到丹麦I型BCG菌株内，构建出rBCG-hIFN-α-2B菌株，该卡介苗菌株可以分泌hIFN-α-2B。
2.根据权利要求1所述的重组干扰素卡介苗菌株，其特征在于phIFN-α-2B穿梭质粒含有phIFN-α-2BcDNA。
3.根据权利要求1所述的重组干扰素卡介苗菌株，其特征在于每毫升重组BCG菌液上清液的hIFN-α-2B含量平均为997.2pg。
4.一种重组干扰素卡介苗菌株的制备方法，其特征在于该方法是phIFN-α-2B穿梭质粒的构建、转导并在BCG中的表达。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于hIFN-α-2BcDNA片段聚合酶链反应(PCR)反应上游引物CAAGggatccTGTGATCTGCCTCAAACCCACAG；下游引物GCCGgaattcTCATTCCTTACTTAAACTTTCTT。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于phIFN-α-2B质粒鉴定PCR反应上游引物5’ATCTTCACCATACGACGTCC 3’；下游引物5’GTTAACTACGTCGACATCG 3’。
7.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于以含有hIFN-α-2B cDNA的质粒为模板进行PCR反应，然后将PCR产物纯化，利用BamHI、EcoRI进行双酶切反应，将酶切产物进行电泳，切胶回收DNA片段，即为具有粘性末端可用于连接的hIFN-α-2BcDNA；将pMA0-4质粒利用BamHI、EcoRI进行双酶切反应后电泳，切胶回收即为具有粘性末端的pMA0-4质粒片段；上述两个片段连接，形成phIFN-α-2B质粒，转导到丹麦I型BCG菌株内，构建rBCG-hIFN-α-2B菌株。
全文摘要
本发明公开了一种重组干扰素卡介苗菌株及其制备方法，属于基因工程技术。本发明是将构建的phIFN－α－2B穿梭质粒，转导到BCG内，构建出rBCG－hIFN－α－2B菌株。这样制备的本发明由于能够分泌干扰素IFN－α－2B，在达到同样甚至增加免疫效果的条件下可较野生型BCG降低用量，从而降低了毒副作用；避免了直接使用细胞因子所带来的高额费用和反复灌注的缺点；能够在最为合适的时间和部位分泌细胞因子。因此，本发明为其应用于膀胱肿瘤的治疗奠定了基础。
文档编号C12N15/20GK1597931SQ200410020080
公开日2005年3月23日 申请日期2004年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者韩瑞发, 刘春雨, 姚智, 韩育植, 马腾骧 申请人:天津市泌尿外科研究所, 韩瑞发, 刘春雨, 姚智, 韩育植, 马腾骧