专利名称：重组人干扰素-α-2b-BCG的生产方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术，具体是一种适合于工业化生产重组人干扰素-a-2b-BCG的生产方法。
背景技术：
卡介苗(BCG)是一种由毒力极强的牛型分枝杆菌形成的生物免疫调节剂，全世界广泛用于预防结核病，已证明其有高度的安全性和极少的严重并发症。膀胱腔内灌注BCG在预防肿瘤复发、治疗残留肿瘤和原位癌等方面已经取得了令人满意的临床疗效，但仍有30%-45%的病人对腔内BCG灌注治疗无反应，长期随访的患者甚至可达50%。此外，腔内BCG灌注亦可引起膀胱局部和全身反应，5%患者可出现严重并发症，O. 5%甚至可以危及生命，也使BCG腔内灌注用于预防和治疗浅表膀胱肿瘤受到一定的限制。卡介苗的工业制备通常采用培养瓶静置培养收获菌膜地方法，其步骤为BCG种子液接种于装有苏通马铃薯培养基的培养瓶中，39°C恒温、静置培养7-14天，收集菌膜压干后，移入盛有不锈钢珠瓶内，钢珠与菌体的比例应根据研磨机转速，控制在一适宜的范围，并尽可能在低温下研磨，加入适量无致敏原保护液，并稀释成一定浓度的原液。虽然操作成本低廉，但是操作复杂，生长缓慢，生产过程可控性差。中国专利1597931公开了一种重组干扰素卡介苗菌株及其制备方法，菌种保藏号CGMCC No. 1121。其是将构建的phIFN-a-2B穿梭质粒，转导到BCG内，构建出rBCG-hIFN-a -2B菌株。这样制备的本发明由于能够分泌干扰素IFN-a -2B，在达到同样甚至增加免疫效果的条件下可较野生型BCG降低用量，从而降低了毒副作用；避免了直接使用细胞因子所带来的高额费用和反复灌注的缺点；能够在最为合适的时间和部位分泌细胞因子。因此，为其应用于膀胱肿瘤的治疗奠定了基础。但是，上述重组人干扰素- a -2b_BCG的制备尚处于实验室水平，远远不能满足临床治疗的批量需要，因此，大批量生产重组人干扰素- a -2b_BCG势在必行。
发明内容
本发明就是为了解决工业化大批量生产重组人干扰素-a -2b_BCG的问题，而提供一种重组人干扰素-a -2b-BCG的生产方法。本发明是按照以下技术方案实现的。一种重组人干扰素-a -2b-BCG的生产方法，其生产步骤是
a.采选重组干扰素-a_2b-BCG菌种并接种于含卡那霉素30微升/毫升的新鲜改良的苏通马铃薯液体培养基中，获得一级活化种子液；
b.按体积百分比将1-4%的一级活化种子液接种至改良的苏通马铃薯液体培养基中，震摇培养7、天获得浓度达标准0D_的A值=2，得二级种子液；· c.发酵罐内最终装料容积比6 7:10改良的苏通马铃薯液体培养基高压灭菌后，按体积百分比在培养基内加入2-6%的二级种子液，发酵运行7 10天，取样涂玻片抗酸染色检测无污染，检测OD6tltl值达2. O以上，收集发酵液；
d.发酵液离心，取沉淀物用O. OlM磷酸缓冲盐溶液洗涤，再次离心收获菌种。所述重组人干扰素-a -2b-BCG的生产方法，其改良的苏通马铃薯液体培养基121°C 30min高压灭菌后，稳定于35 38°C，接入过滤空气的通气速度1.0 SLPM，转速150rpm稳定2h后，确定溶氧度DO-I值为100%，PH稳定至7. O 7. 5，根据溶氧度80 90%关联调节通气速度保持I. (Γ2. O SLPM和转速15(T400 rpm，进行发酵培养。所述重组人干扰素-a -2b-BCG的生产方法，其采选重组干扰素-a _2b_BCG菌种是冷冻或低温保存重组干扰素-a _2b-BCG种子批的液体培养复苏菌种。所述重组人干扰素-a -2b-BCG的生产方法，其改良的苏通马铃薯液·体培养基是按以下重量份数比的原料制备的，
a.马铃薯200份切块，去离子蒸馏水中煮沸2(Γ30分钟，静置冷却后过滤，_20°C冷冻12 24h，静置于常温水中浸泡至完全溶化后，脱脂棉过滤，G3砂芯漏斗抽滤；滤汁经速冻结冰后再解冻，薯细胞聚呈棉絮状沉淀，过滤去沉淀得澄清薯汁；
b.所得薯汁及称取的天门冬素4份、柠檬酸2份、磷酸氢二钾O.5份、硫酸镁O. 5份柠檬酸高铁铵O. 05份、O. 1%硫酸锌I份、蒸馏水300-500份，加热至全部溶解，用G3滤斗过滤除杂质，加入甘油60份至溶解，加蒸馏水到1000份；
c.用纯氢氧化铵矫正PH至7.2 7. 7，分装，经15磅121°C，20分钟灭菌备用。按照本发明方法生产的重组人干扰素-a_2b-BCG，单次生产量大，生长过程易检测，培养条件参数可控，可以更好的根据生长过程调节培养过程中酸碱度、氧气和营养物质的需求，直接收获富集的散在菌体，避免了研磨等容易造成污染的操作。
图I是本发明的生产工艺流程 图2是发酵培养菌体镜下均匀散在的分布 图3是静置培养菌体成团成片聚集的油镜X 1000镜下分布 图4是重组hIFN- α -2Β- BCG-PCR产物电泳 图5是重组hIFN- a -2B-BCG的PCR产物测序图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。一.生产步骤，参见图I。I.种子活化
冷冻或低温保存重组干扰素-a -2b-BCG种子批的液体培养复苏，菌种采选后接种于含卡那霉素30微升/毫升的新鲜配制的改良的苏通马铃薯液体培养基50mL中，恒温35 38 °C、转速10(T200rpm、饱和湿度下培养7 14天获得一级活化种子液。2. 二级种子制备
新鲜的活化种子液按1-4%比例接种至改良的苏通马铃薯液体培养基50mL中，含卡那霉素30微升/毫升，于2000mL烧瓶中震摇，35 39°C、饱和湿度下、10(T200rpm震摇培养7 9天获得二级种子(浓度达标准0D_的A值=2)。
3.发酵制备
(1)培养基采用改良的苏通马铃薯液体培养基，培养基配置后调节PH至7.(Γ7. 5，体积约3 4升(美国NBS BI0FL0415的工作容积5升发酵罐为例)，高压灭菌后开始发酵时的最终装料容积比6 7:10 ;
(2)培养基121°C30min高压灭菌后，稳定于35 38°C，接入过滤空气的通气速度1.0SLPM (stard liter per minute),转速 150rpm 稳定 2h 后，确定溶氧度(D0-1)值为 100%,PH约稳定至7.0 7. 5。(3)取二级种子新鲜培养液50mL (标准OD6tltl的A值为2时的BCG种子液，加料比2飞％)无菌情况下经加料孔加入发酵罐；
(4)设定发酵参数，接入过滤空气通气的起始速度I.O SLPM，起始转速150rpm，根据溶氧度80 90%关联调节通气速度保持I. (Γ2. O SLPM和转速15(T400 rpm，温度维持35 39°C，消泡剂采用sigma玉米油；
(5)发酵运行7 10天，取样涂玻片抗酸染色检测无污染，检测0D_值达2.O以上收获物料，参见图2、3。4.离心富集洗涤收获沉淀
收集发酵液，采用大容量水平转子离心机4000rpm (3752g)离心1(Γ 5分钟后，取沉淀用O. OlM磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，再次离心收集沉淀。憐酸缓冲盐溶液(phosphatebuffer saline, PBS) NaCl 8g, KCl 0. 2g,Na2HP04*12H20 3. 63g, KH2P04 0. 24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7. 4，加水定容至1L，高压灭菌后常温保存备用。二.改良的苏通马铃薯培养基制备方法
1.马铃薯切块，不锈钢锅去离子蒸馏水中煮沸20分钟，静置冷却后脱脂棉纱布过滤，放置于_20°C冷冻12 24h，静置于室温或自来水中浸泡至完全溶解(禁止用热水和摇动)后，5飞层脱脂棉过滤，G3砂芯漏斗抽滤。马铃薯煮汁经过速冻结冰后再解冻时，汤汁中的薯细胞会聚成棉絮状沉淀，经过滤即可得无沉淀的澄清薯汁，利于发酵培养后发酵培养液进行离心沉淀分离富集菌体；
2.按附表I中各组分的量分别称取，倒入三角瓶内加蒸馏水，加热使全部溶解，用G3滤斗过滤除杂质,趁热加入甘油60ml，将其倒入量筒内加蒸馏水到IOOOml ；
3.用纯氢氧化铵NH40H约3ml矫正PH至7.2 7. 7 ；
4.制备种子液的培养基用三角瓶进行分装，经15磅121°C，20分钟灭菌备用；
表I改良的苏通马铃薯培养基成分
权利要求
1.一种重组人干扰素-a -2b-BCG的生产方法，其生产步骤是a.采选重组干扰素-a_2b-BCG菌种并接种于含卡那霉素30微升/毫升的新鲜改良的苏通马铃薯液体培养基中，获得一级活化种子液；b.按体积百分比将广4%的一级活化种子液接种至改良的苏通马铃薯液体培养基中，震摇培养7、天获得浓度达标准0D_的A值=2，得二级种子液；c.发酵罐内最终装料容积比6 7:10改良的苏通马铃薯液体培养基高压灭菌后，按体积百分比在培养基内加入2飞％的二级种子液，发酵运行7 10天，取样涂玻片抗酸染色检测无污染，检测OD6tltl值达2. O以上，收集发酵液；d.发酵液离心，取沉淀物用O.OlM磷酸缓冲盐溶液洗涤，再次离心收获菌种。
2.根据权利要求I所述重组人干扰素-a-2b_BCG的生产方法，其特征在于改良的苏通马铃薯液体培养基121°C 30min高压灭菌后，稳定于35 38°C，接入过滤空气的通气速度I.O SLPM，转速150 rpm稳定2h后，确定溶氧度DO-I值为100%, PH稳定至7. O 7. 5。
3.根据权利要求I所述重组人干扰素-a-2b-BCG的生产方法，其特征在于采选重组干扰素-a -2b-BCG菌种是冷冻或低温保存重组干扰素-a _2b_BCG种子批的液体培养复苏菌种。
4.根据权利要求I所述重组人干扰素-a -2b_BCG的生产方法，其特征在于改良的苏通马铃薯液体培养基是按以下重量份数比的原料制备的，a.马铃薯200份切块，去离子蒸馏水中煮沸2(Γ30分钟，静置冷却后过滤，_20°C冷冻12 24h，静置于常温水中浸泡至完全溶化后，脱脂棉过滤，G3砂芯漏斗抽滤；滤汁经速冻结冰后再解冻，薯细胞聚呈棉絮状沉淀，过滤去沉淀得澄清薯汁；b.所得薯汁及称取的天门冬素4份、柠檬酸2份、磷酸氢二钾O.5份、硫酸镁O. 5份柠檬酸高铁铵O. 05份、O. 1%硫酸锌I份、蒸馏水300-500份，加热至全部溶解，用G3滤斗过滤除杂质，加入甘油60份至溶解，加蒸馏水到1000份；c.用纯氢氧化铵矫正PH至7.2 7. 7，分装，经15磅121°C，20分钟灭菌备用。
全文摘要
本发明公开了一种重组人干扰素-α-2b-BCG的生产方法，其是将重组干扰素-α-2b-BCG菌种接种于含卡那霉素30微升/毫升的改良的苏通马铃薯液体培养基中，获得一级活化种子液，再按1-4%比例接种至改良的苏通马铃薯液体培养基中，获得OD600A值=2的二级种子液；发酵罐内改良的苏通马铃薯液体培养基高压灭菌后，按2-6%的比例加入二级种子液，发酵运行7-10天，收集发酵液，离心，取沉淀物用PBS洗涤，再次离心收获菌种。这样生产的重组人干扰素-α-2b-BCG单次生产量大，生长过程易检测，培养条件参数可控，根据生长过程调节培养过程中酸碱度、氧气和营养物质的需求，直接收获富集的散在菌体，避免了研磨等容易造成污染的操作。
文档编号C12R1/32GK102925400SQ20121041248
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年4月17日
发明者孙二琳, 韩瑞发 申请人:韩瑞发, 孙二琳, 天津市泌尿外科研究所