专利名称：一种适用于牛结核抗体检测的试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物细菌学技术领域。具体涉及一种适用于牛结核抗体检测的试剂盒及其应用。
背景技术：
牛结核病是一种由牛分枝杆菌引起的慢性消耗性人畜共患病，被国际动物卫生组织(OIE)定为B类动物传染病。2001年和2002年的部分统计结果表明我国个别省市奶牛结核病阳性率高达10％以上。牛结核病的防制主要是采用牛提纯结核菌素进行变态反应检疫，对检出的阳性牛进行隔离或扑杀，从源头上杜绝疾病传播。但是由于牛提纯结核菌素成分复杂，其特异性受其他非致病性分枝杆菌影响而出现假阳性，同时敏感性也较低，其诊断结果可信度不高，使“检疫-扑杀”政策的实施效果大打折扣。目前国际上诊断试剂的研究趋势是使用成分明确的抗原蛋白代替PPD进行牛结核病诊断(Pollock JM等，Tuberculosis，2001，81(1/2)65-69)。MPB70是牛分枝杆菌特异性分泌蛋白质，因其相对迁移率为0.7而得名(Harboe M等Infect Immun，1986，52(1)293-302)，分泌量占毒力牛分枝杆菌培养基蛋白总量10％，是牛分枝杆菌感染过程中重要的体液和细胞免疫目标抗原(Harboe M等，Am Rev Resp Dis，1984，129444-452)也是PPD的主要成分之一。MPB70最初由Nagai等人从BCG Tokyo 172株的培养基中纯化得到，通过SDS-PAGE测得分子量为18kD(Nagai S等Infect Immun，1981，31(3)1152-1160.)。其基因序列1989年被测定，推测出其蛋白序列有一个含30个氨基酸的信号肽，成熟蛋白质有163个氨基酸(Terasaka K等，Complete nucleotide sequence of immunogenic protein MPB70 fromMycobacterium bovis BCG，FEMS Microbiol Lett，1989，49(2-3)273-276具有热稳定性，等电点为4.8。Hewinson等人第一次在大肠杆菌中使用MPB70自身起始密码子进行了MPB70的异源表达，结果观察到了26kD和22kD两种分子量的MPB70蛋白质，22kD蛋白大量存在于细胞周质中，因此推测26kD是信号肽未剪切产物(Hewinson RG，等J Gen Microbiol，1993，139(6)1253-1259)。在BCG Tokyo和Moreau亚株之外的其他亚株中都没有发现MPB70所存在或仅微量表达(Miura K等，Infect Immun，1983，39(2)540-545)，在结核分枝杆菌中也仅微量表达(Wiker HG等，J.Immunol，1996，43374-380)。对PPD皮内变态反应阳性牛中分离出的49株环境分枝杆菌的研究发现，包括禽结核、副结核在内的各种分枝杆菌中无一含有MPB70蛋白质(Hughes MS等，Veterinary Microbiology，2005，108101-112)。MPB70在各分枝杆菌菌株间表达量的差异主要是由于Sigma因子(SigK基因)起始密码子的一个点突变引起(Charlet D等，Molecular Microbiology，2005，56(5)1302-1313)。
鉴于牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70的特性，利用该蛋白研制出快速、准确、安全、廉价的诊断试剂盒，将为牛结核病的防制和消灭提供有效工具。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，制备一种适用于牛结核抗体检测的试剂盒及其应用。本发明通过建立间接血凝方法，制备出一种特异性好、灵敏度高、快速、准确地检测牛结核病的抗体的试剂盒，为我国牛结核病防制提供一种新型试剂盒和新方法。
本发明通过以下技术方案实现本发明通过建立间接血凝方法，制备了一种适用于牛结核抗体检测的试剂盒，该试剂盒包含盒体、设在盒体内的V形底96孔反应板、牛结核分支杆菌野毒感染标准阳性血清、健康牛阴性血清、血清稀释液和1％致敏绵羊红细胞悬液。其中牛结核分支杆菌野毒感染标准阳性血清(诊断抗原)是利用牛分枝杆菌MPB70蛋白的重组大肠杆菌PHVO14Escherichia coliPHVO14，保藏在CCTCC，保藏编号CCTCC-M205135得到的。
其中的1％致敏绵羊红细胞悬液是用牛分枝杆菌特异性抗原蛋白MPB70致敏的红细胞，它是通过下列方法制备的将红细胞悬液中加入等体积的抗原蛋白MPB70，经水浴，搅拌；离心弃上清，用PBS洗涤2次，再用含1％兔血清的PBS洗涤一次，配成1％致敏绵羊红细胞悬液，加入0.01％硫柳汞，分装后放2-8℃保存，备用，即得到本发明所述的1％致敏绵羊红细胞悬液。
(一)包含牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70基因的克隆及在重组大肠杆菌中表达的制备方法，它包括下列步骤(1)以牛型分枝杆菌标准株(Mycobacterium bovis AF2122/97，该菌株的基因序列已经登录Genebank，，登录号为NC002945)细菌培养物加少量双蒸水煮沸10min裂解菌体，离心后取上清液作为PCR模板，通过PCR方法扩增得到牛型分枝杆菌mpb70基因片段的cDNA序列；在原核表达载体pET-28a的EcoRI和HindIII多克隆位点中定向插入牛型分枝杆菌mpb70基因片段的cDNA序列，构建得到原核表达载体pET-28a-mpb70；(2)将步骤(1)所说的原核表达载体pET-28a-mpb70转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，用卡那霉素抗性筛选单个重组菌，诱导该菌株，得到特异表达牛型分枝杆菌mpb70蛋白；(3)纯化步骤(2)所表达的MPB70蛋白，得到所需的诊断抗原。
(二)牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70表达纯化的具体步骤
将酶切和序列鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21DE3(购自Stratagene公司)株，挑取50μg/mL的卡那霉素抗性平皿上的阳性单菌落，加入含卡那霉素抗性的LB培养基中在37℃下剧烈振荡培养至对数生长期(OD600＝0.6-0.8)，向培养基中加入IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)进行诱导表达，设置0.4mM和0.8mM两个IPTG浓度梯度。37℃继续振荡培养，分别在诱导后第0、1、2、3小时取1mL细菌培养物，12000r/min离心收集菌体，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗沉淀并用40uL重悬，加入50uL 2×SDS上样缓冲液和10uL二硫苏糖醇(DTT)，100℃煮沸10min，取20uL一定量进行SDS-PAGE电泳分析(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主编(金冬雁，黎孟枫等译).分子克隆实验指南.第二版，北京，科学出版社，1992版)，观察分析外源基因表达情况。诱导的菌体经离心、超声波破碎(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主编(金冬雁，黎孟枫等译).分子克隆实验指南.第二版，北京，科学出版社，1992版)后提取包涵体，经纯化、变性、复性处理(参见实施例)后分装于-20℃保存备用。
(三)牛结核抗体试剂盒的应用(1)利用上述牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70蛋白建立间接血凝试验；(2)用步骤(1)所说的方法制备用于牛结核病的抗体检测试剂盒。
更详细的技术方案如下所述(1)牛分枝杆菌标准株(Mycobacterium bovis AF2122/97，由湖北出入境检验检疫局郭明星研究员惠赠，该菌株的基因序列已经登录Genebank，，登录号为NC002945)。本发明以牛分枝杆菌标准株(Mycobacterium bovis AF2122/97)基因组为模板，通过PCR扩增得到mpb70基因的cDNA，经测序分析确定该mpb70基因的cDNA序列与Genebank公布的基因序列进行比对，证明得到的基因序列如预期的基因序列大小一致参见附图2。
(2)原核表达载体pET-28a-mpb70的构建将牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70的cDNA序列定向插入到原核表达载体pET-28a(购自invitrogen公司)的EcoRI和HindIII多克隆位点。
(3)重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a-mpb70的构建将步骤(2)所述的原核表达载体转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，经卡那霉素抗性筛选得到阳性重组菌株。该菌株保藏在保藏在CCTCC，保藏日期2005年11月25日，保藏编号CCTCC-M205135。
(4)牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70蛋白基因在大肠杆菌BL21中的表达及表达蛋白的纯化方法将上述步骤(3)所述的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a-mpb70挑取单个菌落至LB培养基加卡那霉素至终浓度50μg/mL，37℃摇床培养12小时后放4℃冰箱过夜；用含50μg/mL卡那霉素的LB培养基将该菌液按1∶100比例稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃摇床培养至OD600≈0.6，用0.4mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷进行诱导，诱导3小时后进行SDS-PAGE电泳分析，诱导的菌体经离心、超声波破碎后提取包涵体，经纯化、变性、复性等处理后分装于-20℃保存备用。参照《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主编(金冬雁，黎孟枫等译).第二版，北京科学出版社，1992版)对纯化的蛋白进行斑点杂交分析，证实该重组大肠杆菌可以特异性地表达牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70，表达的蛋白以包涵体的形式存在大肠杆菌BL21中，且具有免疫学活性。
(5)牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70蛋白抗体检测和牛结核病间接血凝诊断方法的建立与试剂盒的制备1)1％致敏绵羊红细胞悬液的制备从步骤(4)中得到所述的包涵体中纯化mpb70表达蛋白；用牛分枝杆菌特异性抗原蛋白MPB70致敏红细胞，它是通过下列方法制备的，取制备好的含量为2.5％的红细胞悬液中加入等体积的含量为100μg/ml的抗原蛋白MPB70，置37℃下水浴30分钟，其间不断搅拌，离心弃上清；用pH7.2的PBS悬浮血球，压积离心洗涤2次；再用含1％正常兔血清PBS洗涤一次，最后用此液配成1％致敏绵羊红细胞悬液，加入0.01％硫柳汞，分装后放2-8℃保存、备用，即为本发明所述的1％致敏绵羊红细胞悬液。
2)阿氏(简称阿氏液参见何昭阳等主编，《动物免疫学实验技术》长春吉林科学技术出版社，2002)红细胞保存液的制备取葡萄糖2.05g，枸橼酸钠(Na3C6H507.2H2O)0.8g，枸橼酸0.55g，NaCl0.42g，用蒸馏水定容到100毫升，在121℃灭菌15分钟，置4度冰箱保存。
3)阴性对照血清的制备对经皮内变态反应、细菌培养和PCR验证的健康牛进行无菌采集血液，采得的血液于37℃静置1h，4℃静置过夜，分离血清；无菌过滤是在血清中加入0.01％叠氮钠防腐，加入时充分摇匀。
4)阳性对照血清的制备在奶牛场中经皮试反应初步筛选后，发现经细菌培养、PCR检验确诊的牛分枝杆菌感染的奶牛10头，并通过病理剖检和组织病理学证实其中8头为典型的牛结核分枝杆菌重病牛，采集其血液制备成血清，该血清作为本试剂盒的阳性血清对照样品。
具体如下制备5)抗原稀释液的制备PBS(磷酸盐缓冲液)0.15mol/L pH7.2甲液 将磷酸氢二纳配制成含量为0.15mol/L的溶液具体方法是取磷酸氢二纳21.3g，加蒸馏水定容至1000ml。
乙液 将磷酸二氢钾配制成含量为0.15mol/L溶液具体方法是取磷酸二氢钾20.42g，加蒸馏水定容至1000ml。
如用含有结晶水的磷酸盐，则称量时要按带水的克分子量乘以0.15称量。上述配制好的甲液和乙液按照常规方法灭菌(121℃，灭菌15分钟)。
将上述甲液、乙液和氯化纳按照以下配比混合甲液87ml乙液13ml氯化纳 0.85g6)试剂盒的组装将间接血凝板、牛结核分支杆菌野毒感染标准阳性血清、健康牛阴性血清、血清稀释液组装成牛型分枝杆菌抗体检测试剂盒。
本发明的有益效果1、本发明的试剂盒生物安全性高。本发明所涉及到的原核表达载体pET-28a是分子生物学中常用的原核表达载体，没有生物危险性，在此基础上构建的原核表达载体pET-28a-mpb70也没有任何生物危险性。重组大肠杆菌BL21/pET-28a-mpb70是将原核表达载体pET-28a-mpb70转化至分子生物学中常用的大肠杆菌BL21感受态细胞后经卡那霉素抗性筛选获得，也不具生物危险性。本发明所用的抗原是用牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70蛋白制备的，制备过程中不涉及牛型分支杆菌活菌，因此没有牛型分支杆菌逃逸、扩散的潜在危险。
2、本发明的试剂盒生产成本低。本发明所提供的牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70抗体诊断方法和诊断试剂盒所需抗原是牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70蛋白。该蛋白可以通过重组大肠杆菌BL21/pET-28a-mpb70在体外得到大量的表达，适合大规模的生产。而目前国内没有专门检测牛型分支杆菌血清抗体的试剂盒。
3、本发明的试剂盒特异性强，灵敏度高，操作简单易行，非常适合牛结核分支杆菌临床大规模检测。
图1是本发明的主要技术路线。
图2是本发明的载体构建物理图。
图3mpb70基因PCR扩增结果。
MDL 2000的分子量标准1，2，3扩增出的基因图4重组质粒pET28a-mpb70酶切鉴定结果M1为DL15000分子量标准；M2为DL2000分子量标准；1为EcoRI酶切处理；2为HindIII酶切处理；3为EcoRI和HindIII双酶切处理。
图5是本发明诱导表达的牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70的SDS-PAGE电泳图，不同诱导浓度和诱导时间条件MPB70表达情况。
图6是本发明临床检测阳性牛病理解剖结果。
图中(A)大网膜(瘤胃部)见弥散性结节存在，部分成簇；(B)肺外壁两个淡黄色核桃大小的钙化灶，剖切有沙感；(C)胸膜肋骨内壁上有大量豆样结节；(D)隔肌覆盖有大量珍珠样结节。
图7是本发明的其中一个实施例在同一块血凝板板上进行的临床血清检测结果具体实施方式
实施例1牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70蛋白cNDA序列的克隆1、PCR引物设计与合成根据Genbank公布的mpb70基因序列(登录号1008916)设计上、下游引物。上游引物引入EcoRI酶切位点(如引物中的下划线所示)，下游引物引入HindIII酶切位点(如引物中的下划线所示)。本发明的引物由北京奥科生物公司合成。
mpb70上游引物5’-AGTTCAGAATTCATGAAGGTAAAGAACACAATTGC-3’mpb70下游引物5’-ACGTCGAAGCTTTTACGCCGGAGGCATTAGC-3’2、MPB70蛋白质编码基因扩增与处理将牛型分枝杆菌标准株((Mycobacterium bovis AF2122/97，该菌株由湖北出入境检验检疫局郭明星研究员惠赠，Genebank，，登录号为NC002945)细菌培养物加少量双蒸水煮沸10min裂解菌体，离心后取上清液作为PCR模板。mpb70的扩增反应按25个循环，94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，最后72℃完全延伸7min程序进行。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测反应结果，使用DNA凝胶快速回收试剂盒(购自上海生物工程公司)纯化mpb70基因片段。
实施例2牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70基因原核表达载体的构建用EcoRI和HindIII双酶切pET28a(+)(购自invitrogen公司)和PCR产物，用DNA凝胶快速回收试剂盒(购自上海生物工程公司)纯化回收后进行粘末端连接，构建重组表达载体pET28a-mpb70。载体构建如附图2所示。
实施例3重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a-mpb70的构建将重组表达载体pET-28a-mpb70转化至大肠杆菌BL21(大肠杆菌菌株购自Stratagene公司)感受态细胞，涂布LB卡那霉素平皿，挑选多个单菌落放入LB液体培养基中37℃培养8小时后分别用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达，然后进行SDS-PAGE和斑点杂交分析(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主编，分子克隆实验指南，金冬雁，黎孟枫等译，第二版，科学出版社，北京，1992版)，从中筛选出能够在大肠杆菌BL21中诱导表达牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a-mpb70。该菌株保藏在中国典型培养吴保藏中心(CCTCC)，保藏号为M205135。
实施例4最佳诱导物浓度及最佳诱导时间的确定挑取单个重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a-mpb70菌落至5mL LB培养基，加卡那青霉素(Kana)至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养8小时后放4℃冰箱过夜。用含50μg/mL卡那青霉素(Kana)的LB培养基将该菌液按1∶100比例稀释后，分装至5支细菌培养瓶中(5mL/瓶)，置37℃摇床培养，加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L，继续培养3h后，等量取样进行SDS-PAGE。根据MPB70蛋白表达情况确定IPTG最佳诱导浓度为0.4mmol/L。
挑取单个重组大肠杆菌BL21/pET-28a-mpb70菌落至5mL LB培养基，加至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养8小时后放4℃冰箱过夜。用含50μg/mL卡那霉素的LB培养基将该菌液按1∶100比例稀释后，分装至5支细菌培养瓶中(5mL/瓶)，置37℃摇床培养至OD600≌0.60-0.80，以最佳诱导物浓度(IPTG浓度为0.4mmol/L)进行诱导，每小时取样1mL，共诱导5小时后进行SDS-PAGE电泳分析(分子克隆实验指南.萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主编(金冬雁，黎孟枫等译).第二版，北京科学出版社，1992版)，根据mpb70表达情况确定最佳诱导时间为3小时。
实施例5牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70的大量诱导表达和蛋白纯化按LB培养基体积的1％接种重组大肠杆菌BL21/pET-28a-mpb70，在37℃下培养12小时，置4℃过夜，次日将2毫升菌液接种于200毫升新鲜的加有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中扩大培养至0D600达到0.60-0.80，加终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导表达3小时。以8000r/min离心10分钟，弃上清，收集菌体。将收集的菌体用1/10培养液体积含1％Trinton-X100的缓冲液A(由50mmol/l Tris-cl pH8.0，0.5mmol/L EDTA pH8.0，50mmol/L NaCL，0.5mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，5％甘油配制)悬浮后，室温静置0.5小时，用大超声头，设定10个循环和50％的间隔时间，在冰浴中超声破碎至溶液清亮为止。破碎后的溶液经10000r/min，离心12min，收集沉淀，弃上清。沉淀用1/10培养液体积含0.2％DOC(脱氧胆酸钠)的缓冲液A悬浮，置室温静置0.5小时，10000r/min，离心12min，收集沉淀，弃上清。沉淀用1/10培养液体积含0.3％十二烷基基胺酸钠的缓冲液A悬浮，置室温静置1.5小时至包涵体完全溶解。然后经10000r/min，离心12min后，弃沉淀(含细胞碎片)，收集上清，加入终浓度为0.2％聚乙二醇4000(PEG4000)，1mmol/L氧化型谷胱甘肽和2mmol/L还原型谷胱甘肽，置4℃过夜，最后用10mmol/L TE(pH8.0)透析2-3天，每天换液3-4次。透析后的溶液分装成小管后置-20℃保存备用，作为红细胞致敏抗原。
实施例6醛化红细胞诊断试剂的制备1、敏醛化绵羊红细胞诊断试剂的制备及检验(1)绵羊红细胞的制备选择链球菌2型抗体阴性的健康公绵羊，无菌操作采血脱纤后，加入等量的阿氏液(配方同前)，放2-8C稳定3-5日，用生理盐水离心洗涤5次。
(2)红细胞醛化(固定)用0.15mol/L pH7.2 PBS配成5％红细胞悬液，放电磁搅拌器上徐徐加入1/5容量的2.5％戊二醛溶液，在1小时左右加完，然后继续搅拌10分钟，离心弃上清，再用PBS洗涤1次，最后用PBS配成10％悬液，加0.01％硫柳汞，放2-8℃保存，该红细胞悬液使用期不超过6个月。
(3)醛化红细胞的鞣化将醛化红细胞先离心后用PBS悬浮洗涤一次，然后用PBS成2.5％悬液，加入等容量的1∶20000浓度的鞣酸(用PBS配制)，放37℃水浴15分钟，期间搅拌数次，离心弃上清，再用PBS悬浮洗涤一次，最后用pH6.4 PBS液配成2.5％悬液用于致敏。
实施例7牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白mpb70抗体诊断试剂盒组装及制备方法1、mpb70-IHA试剂盒包括致敏的绵羊红细胞抗原 1瓶/盒阳性血清和阴性血清各1瓶(0.5m1)/盒血清稀释液1瓶(5m1)/盒V型血凝板 2块(96孔)/盒2mpb70-IHA试剂盒相关溶液配方血清稀释液(即磷酸缓冲液)的制备甲液 将磷酸氢二纳配制成含量为0.15mol/L的溶液。
具体方法取磷酸氢二纳21.3g，加蒸馏水定容至1000ml。
乙液 将磷酸二氢钾配制成含量为0.15mol/L的溶液。
具体方法取磷酸二氢钾20.42g，加蒸馏水定容至1000ml。
如用含有结晶水的磷酸盐，则称量时要按带水的克分子量乘以0.15称量。甲液和乙液均121磅高压灭菌15分钟。
甲液87ml
乙液 13ml氯化钠0.85g3、最佳抗原浓度、抗原致敏时间和结果判定最佳时间的选择取1份5mL/L醛化鞣酸化红细胞与1份超声波粉碎仪破碎最佳浓度的抗原，在37℃水浴中作用30min，其间不断轻轻摇振，最后以3000r/min离心3min，弃上清液，用含健康兔血清1％PBS洗涤后，配成1％致敏红细胞悬液。试验结果表明当抗原稀释度为1∶128时，血凝效价低；随抗原浓度升高，血凝效价也提高。但抗原稀释度超过1∶8时血凝效价不再明显提高，因而确定最适抗原浓度为1∶8-1∶16之间，用此浓度抗原制备的1％致敏红细胞血凝效价较高，且图像清晰，经反复试用效果亦稳定。试验结果表明在确定致敏抗原量的情况下，改变致敏时间，当致敏时间为60分钟时，同阳性血清反应，敏感性最高，血清最高血凝效价可以达到1∶1024，此时，制备的1％致敏红细胞血凝效价最高，且图像清晰，经反复试用效果亦稳定。用“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”表示红细胞的凝集强度，当阳性对照和阴性对照完全成立时，出现“+”的血清最高稀释倍数为该血清的血凝效价，经过反复验证本试验中45分钟时判定结果为最佳时间，此时阳性血清出项明显的凝集现象，而阴性血清不凝集。
实施例8mpb70-IHA检测步骤及判断标准操作步骤(1)从4℃冰箱中取出本发明的试剂盒，平衡各组分至室温。
(2)用微量移液器吸取稀释液25μL，滴于96孔“V”型微量反应板孔中；(3)用微量移液器取被检灭活血清25μL于微量反应板的第1孔，然后依次作倍比稀释至第11孔，。第12孔为空白对照，仅加稀释液；(4)另设下列对照致敏红细胞加阳性血清、致敏红细胞加稀释液及阴性血清；(5)每孔加25μL抗原致敏的红细胞悬液；(6)在微型振荡器上轻振1min，使其充分混合，室温放置45分钟后观察结果。
mpb70-IHA结果判定标准的确定结果成立条件致敏红细胞加阳性血清出现100％凝集，致敏红细胞加稀释液及阴性血清不凝集，表明结果成立；凝集价的判定用“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”表示红细胞的凝集强度，出现“++”的血清最高稀释倍数为该血清的血凝效价。
“++++”100％凝集，红细胞均匀地分布于孔底周围；“+++”75％凝集，红细胞均匀地分布于孔底周围，但孔底中心有红细胞形成的针尖大的小点；“++”表示50％凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，孔底有红细胞沉下的小点；“+”表示25％凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，但大部分红细胞已经沉积于孔底。
“-”表示不凝集，红细胞完全沉积于孔底形成一圆点。
实施例9本发明的应用效果举例本例中所指的mpb70-IHA检测方法参照实施例8所述的操作步骤，其检测结果如表1和表2，1、特异性试验致敏好的醛化红细胞试剂牛结核分枝杆菌分枝杆菌病反应呈强阳性，与副结核病牛血清、布病牛血清、弓形虫病牛血清和口蹄疫牛血清均不反应，达到了较好的特异性。结果见表1。
表1特异性试验(单位log2)
2、试剂盒的敏感性牛结核分枝杆菌MPB70蛋白间接血凝试验抗体诊断试剂盒和琼脂扩散试验敏感性的比较，将10份牛结核分枝杆菌阳性的牛血清倍比稀释后分别用牛结核分枝杆菌MPB70蛋白间接血凝试验抗体诊断试剂盒和琼脂扩散试验(AGIP)检测，血清的AGIP效价为1～4；IHA效价为128-512。IHA的敏感性为AGIP的128-512倍(见表2)。
表2倍比稀释的10份阳性血清IHA和AGIP的检测结果
尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。
权利要求
1.表达牛分枝杆菌MPB70蛋白的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a-MPB70，保藏在CCTCC，保藏编号CCTCC-M205135。
2.包含权利要求1的检测试剂盒。
3.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒是用于检测牛结核病抗体的试剂盒。
4.权利要求2或3所述的适用于检测牛结核病抗体的试剂盒，它包含盒体、设在盒体内的V形底96孔反应板、牛结核分支杆菌野毒感染标准阳性血清、健康牛阴性血清、血清稀释液和1％致敏绵羊红细胞悬液。
5.权利要求4所述的试剂盒，其中的1％致敏绵羊红细胞悬液是用牛分枝杆菌特异性抗原蛋白MPB70致敏的红细胞，它是通过下列方法制备的将红细胞悬液中加入等体积的抗原蛋白MPB70，经水浴，搅拌；离心弃上清，用PBS洗涤2次，再用含1％兔血清的PBS洗涤一次，配成1％致敏绵羊红细胞悬液，加入0.01％硫柳汞，分装后放2-8℃保存，备用。
6.权利要求2-5任一项所述的试剂盒在检测牛结核病抗体中的应用。
全文摘要
本发明属于动物免疫学技术领域。公开了一种适用于牛结核检测试剂盒及其制备方法，所述的试剂盒，包含盒体、设在盒体内的V形底96孔反应板、牛结核分支杆菌野毒感染标准阳性血清、健康牛阴性血清、血清稀释液和1％致敏绵羊红细胞悬液。其中致敏绵羊红细胞悬液是由大肠杆菌表达的牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白MPB70致敏得到的。本发明的试剂盒具有特异性强，灵敏度高，可应用于牛结核病抗体的检测。
文档编号G01N33/569GK1982439SQ20051001999
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月13日 优先权日2005年12月13日
发明者谭亚娣, 胡巧云, 晁彦杰, 钦博, 张桂容, 陈焕春, 张书环 申请人:华中农业大学