专利名称：牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别地，涉及牛分枝杆菌ΜΡΒ83、ΜΡΒ70，结核分枝杆菌 ESAT6和CFPlO四种重组蛋白克隆、表达和纯化，四种蛋白作为诊断抗原多重组合最佳浓度的确定，牛IFN-γ重组蛋白表达，其单克隆抗体制备及应用。
背景技术：
结核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skin test, TST) 一直被用于牛结核病的检测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN-Y作为Thl型细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。国内有关牛γ -干扰素单克隆抗体制备及牛结核病夹心ELISA检测方法的建立有研究报道，四川农业大学的徐贤坤博士采用rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白来孵育刺激全血IFN-γ释放，建立了水牛结核病夹心ELISA检测方法。华中农业大学对抗牛IFN-Y单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立进行研究；扬州大学建立了牛γ干扰素抗原捕获 ELISA检测方法，并且利用抗牛γ干扰素特异性的抗体，建立了竞争抑制ELISA方法和胶体金试纸条检测牛Y干扰素。其申请的试剂盒专利是通过全血培养、牛分枝杆菌抗原PPD 作为刺激物，利用牛Y干扰素特异性抗体检测全血培养中释放出的Y干扰素，从而对牛结核病进行诊断。从这些报道或专利可以看出，基本的原理是一样的，都采用牛Y干扰素特异性抗体检测全血培养中释放出的Y干扰素，对牛结核病进行诊断。但四川农业大学采用 rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白这种方法，结核分枝杆菌可以分泌CFP10/ESAT6，牛分枝杆菌缺失这些蛋白的基因，临床无法检测牛分枝杆菌感染，灵敏性有待提高。扬州大学建立的牛 Y干扰素抗原捕获ELISA检测方法，采用牛分枝杆菌抗原PPD作为刺激物，临床诊断中难以与禽分支杆菌等环境分支杆菌感染区分开，特异性差。
发明内容
针对上述不足，本发明旨在提供一种牛结核病抗原特异性Y -干扰素ELISA试剂盒及其检测方法，其检测的特异性和敏感性好，而且操作方便。本发明第一个目的在于牛结核病抗原特异性Y-干扰素ELISA试剂盒，其包括(1)包被牛Y干扰素单克隆抗体的酶标板；(2)酶标记牛Y干扰素单克隆抗体；(3)含有牛分枝杆菌ΜΡΒ83、ΜΡΒ70，结核分枝杆菌ESAT6和CFPlO四种重组蛋白的蛋白液；其中，包被在酶标板的牛Y干扰素单克隆抗体与酶标记牛Y干扰素单克隆抗体分别针对牛Y干扰素不同的抗原表位。本发明从牛淋巴细胞中克隆出了牛Y干扰素的CDNA，构建到原核表达载体中，体外表达并纯化出牛 干扰素重组蛋白。以牛 干扰素重组蛋白为免疫抗原制备牛 干扰素单克隆抗体，筛选出9株单克隆抗体能识别牛IFN-Y重组蛋白的2个不同表位，进一步筛选出分别识别2个不同表位的单克隆抗体代表株，所述的2个不同表位的单克隆抗体代表株上清效价较高。在本发明实施例中，所述含有牛分枝杆菌MPB83、MPB70，结核分枝杆菌ESAT6和 CFPlO的蛋白液的浓度优选为3 μ g/ml，其中，MPB83、MPB70、ESAT6和CFPlO的质量比优选为 1 1 1 1。根据本发明，所述的酶标记牛Y干扰素单克隆抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。本发明提供的试剂盒还可进一步包括以下试剂中的一种或多种洗涤液、二抗稀释液、底物显色液、终止液。本发明另一个目的在于提供应用所述的试剂盒进行牛Y干扰素ELISA检测的方法，其包括如下步骤1)用所述的MPB83、MPB70、ESAT6和CFPlO蛋白液刺激所采集的待测牛的血液， 37°C培养16 Mh，收集上清；2)包被将单克隆抗体用包被液稀释为1.(^8/!1^，10(^17孔，41放置过夜，取出后用PBST洗涤3次，3min/次；3)封闭用5%小牛血清封闭，100 μ L/孔，于37°C放置Ih;封闭后，用PBST洗涤 3 次，3min/次；4)加样将步骤1)制备的检测样品与阴阳性对照分别按1 2稀释，100 μ L/孔， 37°C反应60min ；反应完毕后，用PBST洗涤3次，3min/次；5)加酶标记单抗将识别的抗原表位与步骤2、中包被的单克隆抗体所识别的抗原表位不同的酶标单克隆抗体用稀释液稀释成2. 5 μ g/mL, 100 μ L/孔，37。C反应45min ；反应完毕后，用PBST洗涤3次，3min/次；6)显色加入新鲜配制的TMB底物，100 μ L/孔，37°C反应15min ；7)终止底物反应完后，加入终止液，每孔加入50 μ L 2M的硫酸终止；8)测值于酶标仪上读数，测定各孔0D450nm值，并判定结果。本发明的优点主要体现在以下几个方面1)使用牛分枝杆菌MPB83、MPB70,结核分枝杆菌ESAT6和CFPlO作为牛血液淋巴细胞的刺激原，确定了刺激的最佳浓度，提高Y-干扰素ELISA检测牛结核病方法的特异性和敏感性。MPB83，MPB70是牛分枝杆菌培养早期分泌物中的重要蛋白，在体内引发细胞免疫，具有较强免疫原性和免疫保护性。ESAT6和CFPlO的编码基因都位于1号缺失区域 (RDl)，是结核分枝杆菌特异性抗原，因此，与PPD相比，以RDl抗原结合牛分支杆菌特异性抗原作为检测抗原，IFN-Y试验具有更高的特异性。而且以多种抗原组合作为检测抗原， 可以克服使用单一抗原以提高检测特异性的同时，会牺牲一部分检测的灵敏度这个缺陷， 达到更高的精确度，从而成为一种强有力的结核病的诊断工具。2)建立了用ELISA方法检测牛血液淋巴细胞释放Y-干扰素含量的方法。确定了牛结核病抗原特异性Y -干扰素ELISA方法中最佳包被抗体的包被量、包被时间和包被方法，最佳酶标抗体的作用时间。3)由试验中所用的牛分枝杆菌MPB83、MPB70,结核分枝杆菌ESAT6和CFPlO建立的牛结核病抗原特异性Y -干扰素ELISA检测方法比较稳定，其特异性为96 %，敏感性为88. 6%。
图 1 为 CFP-10、ESAT-6、MPB70 和 MPB83 基因的 PCR 扩增，其中 A CFP-10 基因的 PCR扩增，B为ESAT-6基因的PCR扩增，C为MPB70基因的PCR扩增，D为MPB83基因的PCR 扩增，其中1为各自的PCR产物，M为DNA Marker DL2000。图2为重组质粒pET30a-CFP-10的酶切鉴定，其中1 2为重组质粒 pET30a-CFP-10 的双酶切鉴定；M 为 DNAMarker DL2000。图3为重组质粒pET30a_MPB83的酶切鉴定，其中1 2为重组质粒pET30a_MPB83 的双酶切鉴定；M为DNAMarker DL2000。图4为重组表达质粒pET30a-MPB70的双酶切鉴定，其中1 2为重组质粒 pET30a-MPB70 的双酶切鉴定；M 为 DNA MarkerDL2000。图5为重组质粒pET30a-ESAT6的酶切鉴定，其中1 2为重组质粒pET30a_ESAT6 的双酶切鉴定；M为DNAMarker DL2000。图 6 为重组蛋白 CFPlO 的 SDS-PAGE 分析,其中，1-4. pET30a_CFP10/BL21 (DE3)诱导后4小时菌体蛋白；5-6. pET30a-CFP10/BL21 (DE3)诱导前0小时菌体蛋白；7. pET_30a/ BL21的菌体蛋白；M 低分子量蛋白Marker。图7为重组蛋白MPB83的SDS-PAGE分析，其中，1 :pET_30a/BL21的菌体蛋白；2 pET-30a/BL21 (DE3)诱导后 4 小时；M 低分子量蛋白 Marker ；3 :pET30a_MPB83/BL21 (DE3) 诱导前0小时菌体蛋白；4 :pET30a-MPB83/BL21 (DE3)诱导后4小时菌体蛋白。图 8 为重组蛋白 MPB70 的 SDS-PAGE 分析，其中，1、2、3 :PET30a_MPB70/BL21 (DE3) 诱导后4h菌体蛋白；4 :PET30a-MPB70/BL21(DE;3)诱导前Oh菌体蛋白；M 低分子量蛋白 Marker0图9为重组蛋白ESAT6的SDS-PAGE分析，其中，M 低分子量蛋白Marker ； 1禾口 2 为 pET30a-ESAT6/BL21 (DE3)诱导 4 小时菌体蛋白；3 :pET30a_ESAT6/BL21 (DE3)诱导 2 小时菌体蛋白；4 :pET30a-ESAT6/BL21 (DE3)诱导0小时菌体蛋白；5 :pET30a/BL21 (DE3)诱导 2小时菌体蛋白。图10为重组蛋白CFPlO纯化后SDS-PAGE分析，其中，M为低分子质量蛋白预染 Marker ；1为纯化的重组蛋白。图11为重组蛋白MPB70纯化后SDS-PAGE分析，其中M为低分子质量蛋白预染 Marker ；1为包含体裂解后上清；2纯化的重组蛋白。图12为重组蛋白MPB83纯化后SDS-PAGE分析，其中，M为低分子质量蛋白Marker ； 1 3为纯化的重组蛋白。图13为重组蛋白ESAT6纯化后SDS-PAGE分析，其中，M为低分子质量蛋白Marker ； 1 2为纯化的重组蛋白。图 14 为牛 IFN-Y 基因的 PCR 扩增，其中，M :DNA MarkerDL2000 ；1、2. PCR 产物。图 15 为牛 pET 30-IFN-γPCR鉴定结果，其中，M:DNA MarkerDL2000 ；1、2、3、4、5 PCR产物。图16为牛IFN-Y重组蛋白表达结果，其中，1 空白对照；M 低分子蛋白Marker ；2 :37°C诱导表达；3 :18°C诱导表达。图17为牛IFN-Y重组蛋白纯化结果，其中，1 纯化结果；M 低分子蛋白Marker ； 2:空白组；3:纯化前诱导表达。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1基因工程菌的构建根据已发表的牛分枝杆菌MPB83、MPB70 ；结核分枝杆菌ESAT6、CFPlO基因序列设计特异性引物。引物序列如SEQ ID No. 1 8所示表1扩增MPB83、MPB70、ESAT6、CFPlO基因的引物序列
权利要求
1.牛结核病抗原特异性Y-干扰素ELISA试剂盒，其包括1)包被牛Y干扰素单克隆抗体的酶标板；2)酶标记牛Y干扰素单克隆抗体；3)含有牛分枝杆菌MPB83、MPB70,结核分枝杆菌ESAT6和CFPlO的蛋白液；其中，包被在酶标板的牛Y干扰素单克隆抗体与酶标记牛Y干扰素单克隆抗体分别针对牛Y干扰素不同的抗原表位。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其还包括以下试剂中的一种或多种洗涤液、二抗稀释液、底物显色液、终止液。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的含有牛分枝杆菌MPB83、 MPB70，结核分枝杆菌ESAT6和CFPlO的蛋白液的浓度为3 μ g/ml。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的牛分枝杆菌MPB83、MPB70, 结核分枝杆菌ESAT6和CFPlO的蛋白液中MPB83、MPB70、ESAT6和CFPlO的质量比为 1:1:1:1。
5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标记牛γ干扰素单克隆抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。
6.权利要求1 5任一项所述的试剂盒在牛γ干扰素检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤1)用所述的MPB83、MPB70、ESAT6和CFPlO蛋白液刺激所采集的待测牛的血液，37°C培养16 Mh，收集上清；2)包被将单克隆抗体用包被液稀释为1.0yg/mL，100yL/孔，4°C放置过夜，取出后用PBST洗涤3次，3min/次；3)封闭用5%小牛血清封闭，100μ L/孔，于37°C放置Ih ；封闭后，用PBST洗涤3次， 3min/ 次；4)加样将步骤1)制备的检测样品与阴阳性对照分别按1 2稀释，100yL/^L，37°C 反应60min ；反应完毕后，用PBST洗涤3次，3min/次；5)加酶标记单抗将识别的抗原表位与步骤2)中包被的单克隆抗体所识别的抗原表位不同的酶标单克隆抗体用稀释液稀释成2.5 μ g/mL，100 μ L/孔，37°C反应45min ；反应完毕后，用PBST洗涤3次，3min/次；6)显色加入新鲜配制的TMB底物，100μ L/孔，37°C反应15min ；7)终止底物反应完后，加入终止液，每孔加入50μL 2M的硫酸终止；8)测值于酶标仪上读数，测定各孔0D450nm值，并判定结果。
全文摘要
本发明提供一种牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA试剂盒，其包括包被牛γ干扰素单克隆抗体的酶标板；酶标记牛γ干扰素单克隆抗体；含有牛分枝杆菌MPB83、MPB70，结核分枝杆菌ESAT6和CFP10的蛋白液。捕获抗体和检测抗体分别针对γ-干扰素不同的抗原表面。本发明用牛分枝杆菌重组蛋白MPB83，MPB70和结核分枝杆菌重组蛋白ESAT6和CFP10，建立的牛结核病抗原特异性γ-干扰素ELISA检测方法比较稳定，其特异性为96％，敏感性为88.6％，大大提高γ-干扰素ELISA检测牛结核病方法的特异性和敏感性。
文档编号G01N33/535GK102183649SQ20111003419
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月31日 优先权日2011年1月31日
发明者周向梅, 尹晓敏, 张奥, 李丽好, 李泽盛, 杨利峰, 杨杨, 王志刚, 王洋, 赵德明, 邵安文, 鲁龙翔 申请人:中国农业大学