一株产原儿茶醛的五味子内生真菌的制作方法
【专利摘要】一株产原儿茶醛的五味子内生真菌，它涉及一株内生真菌。本发明一株产原儿茶醛的五味子内生真菌为原儿茶醛原料的生产提供了新方法。产原儿茶醛的五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillus?fumigatus)HWT5，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC?No:M?2014131，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2014年4月16日。本发明中的烟曲霉HWT5，其次生代谢产物中含有原儿茶醛，可采用发酵法生产原儿茶醛，为原儿茶醛原料的生产提供新方法。
【专利说明】一株产原儿茶醛的五味子内生真菌
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株内生真菌。
【背景技术】
[0002]内生真菌的研究日益成为天然产物化学研究者关注的热点之一，内生真菌次级代谢产物的种类繁多，包括生物碱类、留体类、職类、苯并吡喃和苯并呋喃类、香豆素和异香豆素类、醌类、黄酮类、酚和酚酸类、内酯类、脂肪族化合物、氨基酸、肽类等，其药理活性广泛，主要表现为抗肿瘤、抗菌、抗病毒、杀虫、抗结核、抗氧化等作用。
[0003]五味子(Schisandra Chinensis (Turcz.) Baill.),木兰科多年生落叶木藤本植物，主产于东北，为北方濒危道地药材，果实入药。
[0004]烟曲霉是引起人类肺部感染非常重要的一种曲霉菌，有从泥土、海洋、植物中分离得到，其次生代谢产物多具有很强的生物活性，进行深入研究，对开展其在医药领域中的应用具有较好前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供了一株产原儿茶醛的五味子内生真菌，为原儿茶醛原料的生产提供了新方法。
[0006]本发明一株产原儿茶醒的五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No:M2014131，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2014年4月16日。
[0007]本发明一株产原儿茶醒的五味子内生真菌,它在PDA固体培养基上培养,菌落初为白色，渐变为墨绿色，易生绿色粉末孢子粉，基质黄绿色，菌株顶部形成球状顶囊，其上全面覆盖一层一层小梗，分生孢子头球状。
[0008]本发明一株产原儿茶醒的五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillusfumigatus) HWT5,属于丝抱菌科(Hyphomycetaceae)曲霉属(Aspergillus)。
[0009]本发明一株产原儿茶醒的五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillusfumigatus) HWT5，依据《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》，可见HWT5菌株的菌落特征和孢子形态与曲霉菌特征极为相近。
[0010]本发明一株产原儿茶醒的五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillusfumigatus) HWT5，其序列提交至NCBI网页，通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过MEGA6.0软件构建系统进化树，HWT5菌株的序列与曲霉属菌，菌株的同源性都达到了 99%以上，结合形态学观察结果,鉴定HWT5菌株为烟曲霉(Aspergillus fumigatusHWT5)。
[0011]本发明一株产原儿茶醒的五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No:M2014131，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2014年4月16日。[0012]本发明从野生北五味子的藤茎中分离得到五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5，采用HPLC法对五味子内生真菌HWT5的发酵代谢产物进行测定，结果显示，五味子内生真菌HWT5次生代谢产物中含有原儿茶醛，该成分不仅具有广谱抗菌作用，而且还具有降低冠脉阻力，增加冠脉血流量，抑制二磷酸腺苷所致的血小板凝集，抗氧化等作用，是一种重要的医药原料、医药中间体。
[0013]本发明中的烟曲霉HWT5，其次生代谢产物中含有原儿茶醛，因此可采用本发明的烟曲霉HWT5发酵法生产原儿茶醛，为原儿茶醛原料的生产提供新方法。
[0014]本发明中的烟曲 霉HWT5，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、单增李斯特菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、化脓链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和白色念珠菌具有抑制作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为【具体实施方式】一中烟曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5的菌落形态图；
[0016]图2为【具体实施方式】一中烟曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5的菌落形态图；
[0017]图3为【具体实施方式】一中烟曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5的18SrDNA的PCR产物的电泳图；
[0018]图4为【具体实施方式】一中烟曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5的系统进化树图；
[0019]图5为【具体实施方式】一中原儿茶醛对照品的HPLC色谱图，其中I表示原儿茶醛；
[0020]图6为【具体实施方式】一中HWT5发酵液HPLC色谱图，其中I表示原儿茶醛；
[0021]图7为【具体实施方式】一中加原儿茶醛对照品后的HWT5发酵液的HPLC色谱图，其中I表不原儿茶醒。
【具体实施方式】
[0022]【具体实施方式】一:本实施方式一株产原儿茶醒的五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo:M2014131，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2014年4月16日。
[0023]本实施方式中烟曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5,它在PDA固体培养基上培养，菌落初为白色，渐变为墨绿色，易生绿色粉末孢子粉，基质黄绿色，菌株顶部形成球状顶囊，其上全面覆盖一层一层小梗，分生孢子头球状(如图1和2所示)。
[0024]本实施方式中烟曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5,其生长温度为28°C,生长pH值自然。
[0025]本实施方式中烟曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5,该菌株分离自健康的野生北五味子的藤茎，实验材料分别于2011年及2012年5月、7月、8月、9月采自黑龙江省帽儿山地区，并经黑龙江省中医研究院付克治研究员鉴定为木兰科植物五味子属SchisandraChinensis (Turcz.)Baill.的植株,样本现存于黑龙江大学生命科学学院生物制药实验室；它按以下过程进行分离培养:
[0026]取健康的野生北五味子的藤茎，用水冲洗干净，取韧皮部，用75 %的酒精浸泡3-5min, 10%双氧水漂洗15min，无菌水冲洗4次，用无菌刀把藤茎韧皮部切成0.5cm的小块，然后将其置于马铃薯固体分离培养基，于28°C恒温培养3-7天，待其切口边缘长出菌落后，挑取菌丝转入马铃薯固体分离培养基多次划线分离纯化，将纯化后的菌株于斜面固体培养基上培养，4°C保存备用；另外把最后一次冲洗北五味子藤茎韧皮部的无菌水用无菌的涂布棒涂布在马铃薯固体分离培养基表面上，于28°C恒温培养，以此作为对照组。
[0027]马铃薯液体培养基:
[0028]马铃薯培养基(PDA):每L由200g的马铃薯、20g的蔗糖和余量的水组成，pH自然，121°C高压灭菌30min ;其中马铃薯去皮，切成小块煮沸30min，用6层纱布过滤。
[0029]马铃薯固体分离培养基:
[0030]马铃薯培养基(PDA):每L由200g的马铃薯、20g的蔗糖，16g的琼脂粉和余量的水组成，pH自然，121°C高压灭菌30min ;其中马铃薯去皮，切成小块煮沸30min，用6层纱布过滤。
[0031]斜面固体培养基:取5mL马铃薯固体培养基装于试管中，121°C高压灭菌30min后，铺成斜面冷却，以备保存菌种。
[0032]试验用主要仪器设备和试剂见表1 ;
[0033]表1
[0034]
【权利要求】
1.一株产原儿茶醒的五味子内生真菌，其特征在于它为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No:M2014131，保藏地址为武汉市 武汉大学，保藏日期为2014年4月16日。
【文档编号】C12R1/68GK103966109SQ201410222209
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月23日 优先权日:2014年5月23日
【发明者】郑春英, 矫佳陈琦, 陆欣媛, 张萍 申请人:黑龙江大学