一种小核菌胞外多糖的提取分离方法
【专利摘要】一种小核菌胞外多糖的提取分离方法，属于多糖提取分离【技术领域】。其首先是使发酵液透过微滤膜，除去菌丝；再向滤过清液中加入硫酸铵，磁力搅拌静置盐析，然后加蒸馏水使多糖上悬溶解稀释，将溶解液转移至分子量为100～120KDa的透析袋中透析；再收集透析袋中的多糖溶液，用NaOH溶液调节其pH至7～9，加入无水乙醇，静置醇沉得到小核菌胞外多糖；最后用少量乙醚清洗后减压旋转蒸发浓缩，低温冷冻干燥后得较高纯度的小核菌胞外多糖。本发明实现了在较小能耗、较少有机溶剂、较少花费的情况下，分离提取高纯度小核菌多糖。该发明具有很强的应用性，是目前分离提取高纯度小核菌多糖的最优化方法。
【专利说明】—种小核菌胞外多糖的提取分离方法
【技术领域】
[0001]本发明属于多糖提取分离【技术领域】，具体涉及小核菌胞外多糖的提取分离方法。【背景技术】
[0002]真菌多糖是从真菌的子实体、菌丝体和真菌发酵液中分离出来的一类具有广泛生物活性的大分子碳水化合物。研究发现，真菌多糖在许多工业领域如食品、材料等方面都具有广泛的应用价值，显示出比动、植物多糖更为广阔的应用前景。医学研究表明，真菌多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、降血糖、降血脂、延缓衰老等生理功效。
[0003]小核菌多糖(Scleroglucan)是由小核菌属(Sclerotium rolfsii)的一些丝状真菌合成分泌的微生物多糖，其结构为三螺旋结构，主链是由β -D-(I — 3)-吡喃葡萄糖基单元组成，每三个单元有一个(1 — 6)键连接的β-D-吡喃葡萄糖基[1]。一般来说，该多糖的平均分子质量为(1.4~5.4) X IO6Da气
[0004]小核菌多糖最初应用在石油开采中，其作用主要体现在以下3个方面:润滑钻头，增加较稀油浆的粘稠度，增加海水压力，便于石油开采。小核菌多糖溶液可以耐受高温、较广范围的PH及多种电解质，在石油开采上显示出比黄原胶更好的稳定性[3，4，5]。
[0005]近年来，小核菌多糖良好的溶解性、兼容性和流变性使其越来越受食品行业者的青睐。目前小核菌多糖作为食品增稠剂已应用于食品中[6]。研究发现，小核菌多糖比其他有抗肿瘤活性的胞外多糖显示出更好的抗肿瘤活性及抗菌活性[7]。
[0006]目前，小核菌多糖 的提取方法主要是将高温水浴后的发酵液高速离心除菌丝，然后醇沉得粗多糖，再用Sevag法去除蛋白，活性炭脱色，过层析柱得较高纯度的小核菌多糖[8]。以上方法，不仅操作复杂，步骤繁琐，且成本较高，使用的仪器价格昂贵，多糖中易存在有机试剂残留，不适合快速大量生产纯度较高的小核菌多糖。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种工艺简单、可靠、成本低又能得到较高纯度小核菌胞外多糖的提取方法。
[0008]各培养基成分及配制方法:
[0009]PDA斜面培养基(IL):马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水溶解，自然pH。
[0010]种子培养基(IL):葡萄糖30.0g, NaN0s3.0g，酵母浸粉 1.0g, K2HPO4L Og,MgSO4.7Η200.25g, KC10.5g,蒸馏水溶解，I ~3M HCl 溶液调节 pH 至 4.5 ~5.0。
[0011]发酵培养基(IL):玉米黄浆(吉林省黄龙食品工业有限公司提供)50mL,玉米淀粉35g，K2HPO4L 0g, MgSO4.7Η200.25g，KC10.5g，NaN0s3.0g,柠檬酸 0.4g，蒸馏水溶解，I ~3MHCl溶液调节pH至4.5~5.0。
[0012](I)菌种活化:将小核菌(4°C条件下石蜡封存的)接种于121°C灭菌的PDA斜面培养基上，25~30°C条件下恒温培养2~3d。
[0013](2)种子培养液制备:向PDA斜面培养基中注入适量无菌水，边注入边冲洗斜面，得到小核菌菌悬液；将菌悬液按7~10%的接种量接入经121°C灭菌的种子培养基中，摇匀；在温度为25~30°C、搅拌速度为180~230rmp的条件下振荡培养2~3d。
[0014](3)发酵液制备:按6~10%的接种量向经121°C灭菌的发酵培养基中接入种子培养液，在温度为25~30°C、搅拌速率为180~230rmp、通气量为2~5L/min条件下培养3~7d，得小核菌发酵液。
[0015]小核菌胞外多糖的提取方法:
[0016](1)将0.45~1.2μπι孔径的微滤膜平铺在微滤器滤筛上，将发酵液倒入微滤器中，密封微滤器；通过外部连接的空气压缩机对发酵液液面施压(0.2~0.4MPa)，收集滤过清液；
[0017](2)向步骤⑴得到的滤过清液中加入滤过清液质量35~40%的硫酸铵，搅拌使硫酸铵完全溶解，3~8°C条件下静置盐析8~12h，多糖上悬，回收硫酸铵；
[0018](3)取步骤(2)盐析后的多糖，加0.5~2倍体积的蒸馏水使其溶解，将溶解液转移至分子量为100~120KDa的透析袋中，密封透析袋，将透析袋置于蒸馏水中，2~10°C透析2~5d，从而除去多糖中的离子等杂质；
[0019](4)收集透析袋中的多糖溶液，将其pH调节至7~9，加入无水乙醇，使无水乙醇体积浓度为50~70%，2~10°C条件下静置醇沉10~20h，所得沉淀用水溶解后在50~60°C条件下减压蒸发浓缩； [0020](5)将步骤(4)获得的浓缩液在-50~_40°C条件下低温冷冻干燥，从而得白色海绵状或粉末状小核菌胞外多糖。
[0021]本发明所述的小核菌为罗耳阿太菌(Athelia roffsii)或齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc)。
[0022]本发明的优点是:
[0023]本发明实现了在较小能耗、较少有机溶剂、较少花费的情况下，分离提取高纯度小核菌多糖。该发明具有很强的应用性，是目前分离提取高纯度小核菌多糖的最优化方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1:本发明实施例1获得的罗耳阿太菌胞外多糖溶液的紫外吸收图谱；
[0025]罗耳阿太菌胞外多糖紫外吸收图谱显示罗耳阿太菌胞外多糖在197nm处具有单一峰，且在280nm处无明显杂峰出现，表明本发明提取的多糖物质纯度较高，无蛋白等杂质。经蒽酮一硫酸法及荧光法测得提取的多糖样品中罗耳阿太菌胞外多糖纯度高于85%。
[0026]图2:多糖荧光强度标准曲线图。
【具体实施方式】
[0027]实施例1
[0028]其步骤如下:
[0029](I)获取小核菌发酵液:
[0030]各培养基成分及配制方法:
[0031]PDA斜面培养基:马铃薯20g，葡萄糖2g，琼脂2g，蒸馏水lOOmL，自然pH。
[0032]种子培养基:葡萄糖9g，NaNO30.9g，酵母浸粉0.3g，K2HPO40.3g，MgSO4.7H200.075g, KC10.15g，用蒸馏水溶解，配制成300mL种子培养基，用2M HCl溶液调节pH至4.5。
[0033]发酵培养基:玉米黄浆150mL,玉米淀粉 105g, Κ2ΗΡ043.0g, MgSO4.7Η200.75g，KCl 1.5g，NaN039.0g，柠檬酸1.2g，用蒸馏水溶解，配制成3L发酵培养基，2M HCl溶液调节pH 至 4.5。
[0034](I)菌种活化:将4 °C条件下石腊封存的罗耳阿太菌[9] (Athelia roffsiiAY6657741,保存于吉林农业大学食品科学与工程学院发酵实验室)接种于灭菌后的3管PDA斜面培养基上，29°C条件下恒温培养2d。
[0035](2)种子培养液制备:向活化后的PDA斜面培养基中注入若干毫升无菌水，边注入边冲洗斜面，得到菌悬液，放入经121°C灭菌20min的300mL种子培养基中，摇匀，29°C，200rmp振荡培养3d。
[0036](3)发酵液制备:向5L发酵罐中加入3L发酵培养基，121°C灭菌20min，降温至29°C，加入270mL种子培养 液，在29°C、通气量为2L/min，搅拌速率180rmp的条件下培养
3.5d，得到罗耳阿太菌发酵液。
[0037]罗耳阿太菌胞外多糖的提取，其步骤如下:
[0038](I)将0.8 μ m孔径的混合纤维素酯微滤膜平铺在微滤器的滤筛上，固定；将罗耳阿太菌发酵液倒入微滤器中，密封微滤器；通过外部连接的空气压缩机对发酵液液面施加
0.4Mpa的大气压，使发酵液透过微滤膜，除去菌丝，收集滤过清液；
[0039](2)向IL滤过清液中加入350g的硫酸铵，搅拌使硫酸铵完全溶解，4°C条件下静置盐析12h，多糖上悬，部分蛋白沉降，回收硫酸铵；
[0040](3)取盐析后的上悬多糖，加I倍体积的蒸馏水使其溶解，将溶解液转移至分子量为IOOKDa的透析袋中，密封透析袋，将透析袋置于蒸馏水中，40C条件下，透析3d，期间换5次水。
[0041](4)收集透析袋中的罗耳阿太菌多糖溶液，用0.25M的NaOH溶液调节其pH至
7.5，加入无水乙醇，使无水乙醇体积浓度为70%，4°C静置醇沉12h，所得沉淀用水溶解后在50°C条件下减压蒸发浓缩；
[0042](5)将浓缩液置于-50°C条件下低温冷冻干燥，得白色海绵状罗耳阿太菌胞外多糖。
[0043]罗耳阿太菌胞外多糖纯度的测定，其步骤如下:
[0044](I)罗耳阿太菌胞外多糖浓度-荧光强度标准曲线的绘制
[0045]配制浓度为10.601g/L的NaOH溶液，pH值为13.5。用pH值为13.5的NaOH溶液配制lmg/mL的罗耳阿太菌胞外多糖标准品(购自英国Dextra公司)溶液。室温条件下，磁力搅拌0.5h。
[0046]分别取0，0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5，4mLlmg/mL的上述罗耳阿太菌胞外多糖标准品溶液，用10.601g/L的NaOH溶液(pH为13.5)分别补足5mL，配制成浓度为0，0.1，0.2，
0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8mg/mL的罗耳阿太菌胞外多糖标准品溶液。在激发波长365nm，发射波长366nm处测各浓度罗耳阿太菌胞外多糖溶液的荧光强度值。以多糖溶液浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制罗耳阿太菌胞外多糖浓度-荧光强度标准曲线，见图2。得到下列拟合公式:[0047]y = 31.155x(R2 = 0.9990);其中，
[0048]y—焚光强度；
[0049]X一多糖标准品溶液浓度，mg/mL。
[0050](2)发酵获得多糖样品中罗耳阿太菌胞外多糖的纯度测定。
[0051]取本发明上述步骤提取的罗耳阿太菌胞外多糖，用10.601g/L的NaOH溶液(pH为13.5)配制成0.4mg/mL的多糖样品溶液，室温条件下，磁力搅拌0.5h。在激发波长365nm，发射波长366mn处测其荧光强度值。根据拟合公式y = 31.155x(R2 = 0.9990)计算出样品糖液中罗耳阿太菌胞外多糖的浓度，从而获得样品糖液罗耳阿太菌胞外多糖的纯度。
[0052]经荧光法测得该多糖样品中罗耳阿太菌胞外多糖纯度为85.41%。紫外全波长扫描发现该多糖在197mn处有单一峰出现，且无明显杂峰，说明该多糖纯度较高。再经蒽酮一硫酸法测(公知的测试方法)得该多糖样品中罗耳阿太菌胞外多糖纯度为85.23%。
[0053]参考文献[0054][I] G.Brigand:Scleroglucan.1n:1ndustrial Gums, Academic Press, NewYork, USA (1993) pp.461 - 472.[0055][2] J.1.Farina, F.Sineriz，0.E.Molina，N.1.Perotti，Isolation andphysicochemical characterization of soluble scleroglucan from Sclerotiumrolfsi1- Rheological properties,molecular weight and conformationalcharacteristics, Carbohydr.Polym.44(2001)41 - 50.[0056][3] B.McNeil，L.M.Harvey, Viscous fermentation products, Cr it.Rev.Biotechnol.13(1993)275 - 304.[0057][4] S.A.Williams, Enhanced oil recovery.US patent3，373，810 (1968).[0058][5]G.Holzworthj Xanthan and scleroglucan:Structure and use in enhancedoil recovery, Dev.1nd.Microbiol.26 (1985) 271 - 280.[0059][6]S.A.SURVASE et al.Fermentative Production of Scleroglucan[J].FoodTechno 1.Biotechnol, 2007，45 (2): 107 - 118.[0060][7] P.P.Singh, R.L.Wislerj R.Tokuzenj W.Nakahara，Scleroglucan, ananti tumor polysaccharide from Sclerotium glucanicum，Carbohydr.Res.37(1974)245 - 247.[0061][8]Griffith WLj Compere A LDev Int J Biol Micromolj 1987 ；9:153-157.[0062][9]金苹，高晓余.白絹病的研究[J].农业病虫害研究，2011，I (I):14-22.
【权利要求】
1.一种小核菌胞外多糖的提取方法，其步骤如下: (1)将0.45~1.2μπι孔径的微滤膜平铺在微滤器滤筛上，将发酵液倒入微滤器中，密封微滤器；通过外部连接的空气压缩机对发酵液液面施压，收集滤过清液； (2)向步骤(1)得到的滤过清液中加入滤过清液质量35~40%的硫酸铵，搅拌使硫酸铵完全溶解，3~8°C条件下静置盐析8~12h，多糖上悬，回收硫酸铵； (3)取步骤(2)盐析后的多糖，加0.5~2倍体积的蒸馏水使其溶解，将溶解液转移至分子量为100~120KDa的透析袋中，密封透析袋，将透析袋置于蒸馏水中，2~10°C透析2~5d，从而除去多糖中的离子等杂质； (4)收集透析袋中的多糖溶液，将其pH调节至7~9，加入无水乙醇，使无水乙醇体积浓度为50~70%，2~10°C条件下静置醇沉10~20h，所得沉淀用水溶解后在50~60°C条件下减压蒸发浓缩； (5)将步骤(4)获得的浓缩液在-50~-40°C条件下低温冷冻干燥，从而得白色海绵状或粉末状小核菌胞外多糖。
2.如权利要求1所述的一种小核菌胞外多糖的提取方法，其特征在于:小核菌发酵液由如下步骤制备得到， (1)菌种活化:将小核菌接种于121°C灭菌的PDA斜面培养基上，25~30°C条件下恒温培养2~3d。 (2)种子培养液制备:向PDA斜面培养基中注入适量无菌水，边注入边冲洗斜面，得到小核菌菌悬液；将菌悬液按7~10%的接种量接入经121°C灭菌的种子培养基中，摇匀；在温度为25~30°C、搅拌速度为180~230rmp的条件下振荡培养2~3d。 (3)发酵液制备:按6~10%的接种量向经121°C灭菌的发酵培养基中接入种子培养液，在温度为25~30°C、搅拌速率为180~230rmp、通气量为2~5L/min条件下培养3~7d，得小核菌发酵液。
3.如权利要求1~2任一项所述的一种小核菌胞外多糖的提取方法,其特征在于:小核菌为罗耳阿太菌(Athelia roffsii)或齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc)。
【文档编号】C12R1/645GK103951762SQ201410222584
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月23日 优先权日:2014年5月23日
【发明者】李鸿梅, 魏明, 赵慧 申请人:吉林农业大学