一种磁性材料固定细胞转化生产香兰素的方法
【专利摘要】本发明涉及一种磁性材料固定细胞转化生产香兰素的方法，该方法包括以下步骤：⑴制备枯草芽孢杆菌B7-S（BacillussubtilisB7-S）菌细胞；⑵制备磁性壳聚糖微球；⑶固定枯草芽孢杆菌B7-S（BacillussubtilisB7-S）菌细胞：将磁性壳聚糖微球用盐酸溶液充分溶胀，再加入NaOH，得到磁性壳聚糖溶液；然后将枯草芽孢杆菌B7-S（BacillussubtilisB7-S）菌细胞加入到磁性壳聚糖溶液中振荡吸附，加入戊二醛溶液再振荡交联，最后得到固定化的枯草芽孢杆菌B7-S（BacillussubtilisB7-S）菌细胞；⑷制备香兰素：a.制备转化培养基；b.制备香兰素转化液；c.固定化的枯草芽孢杆菌B7-S（BacillussubtilisB7-S）菌细胞的回收；d.分离香兰素；e.制备香兰素粗品。本发明低成本、高转化率，且操作简便，易于实施。
【专利说明】一种磁性材料固定细胞转化生产香兰素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种香兰素的生产方法，尤其涉及一种磁性材料固定细胞转化生产香兰素的方法。
【背景技术】
[0002]香兰素(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)，分子式为C8H8O3，又名香草醛、香草素、香兰醛或香茅醛，是香子兰豆荚中的一种主要成分，通常作为香料添加剂，天然药物和医药中间体，还可作为轮滑油消泡剂、电镀光亮剂、印制线路板生产导电剂、橡胶的除臭剂和除草剂使用。
[0003]微生物法合成香兰素方法具有安全、低污染、生产清洁、副产物无污染等优点受到越来越多的关注。然而，香兰素的生物转化过程中，物料的不断进入和排出，极易使微生物随转化产物的排出而流失，浪费了资源降低了转化效率。因此，采用载体使微生物细胞固定化，可防止其微生物细胞的流失，降低微生物培养成本，极大地提高转化效率。
[0004]磁性壳聚糖微球具有磁性粒子和生物高分子材料的双重特性，是一种性能优良的固定化材料，它不仅可以在外加磁场的作用下快速、简单地分离，而且还具有与生物活性物质反应的特殊功能基团。将微生物菌细胞固定于磁性壳聚糖微球，使得细胞固定于载体材料，可有效提高香兰素转化效率，同时固定化材料可重复回收、利用，进一步节省香兰素生产成本。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种低成本、高转化率的磁性材料固定细胞转
化生产香兰素的方法。
[0006]为解决上述问题，本发明所述的一种磁性材料固定细胞转化生产香兰素的方法，包括以下步骤:
⑴制备枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞:
①制备营养肉汁培养基: 将5~15g蛋白胨、2~IOg牛肉提取物、2~15g NaCl与IL蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得pH值为5.(T9.0的营养肉汁培养基；
②将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S{Bacillus subtilis B7-S)斜面培养物按1-20%的接种量接种至含有5(T200mL所述营养肉汁培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在2(T40°C的条件下以10(T500r/min的速率进行振荡培养12~36h，即得枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌液；
③将所述枯草芽抱杆菌B7-S(.Bacillus subtilis B7-S)菌液以8000~12000r/min的速率离心15飞Omin，分别得到上清液A和沉淀物A，该沉淀物A用5~20mL且pH=6.8的
0.2mol/L磷酸盐缓冲液悬浮后，再以800(Tl2000r/min的速率离心5~15min，分别得到上清液B和沉淀物B，该沉淀物B用pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液悬浮至菌悬浮液OD6tltlnm为0.4~0.8时，即得枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞；
⑵制备磁性壳聚糖微球:
I将纳米Fe3O4微球与质量浓度为f 5%的壳聚糖溶液按2mg: lmL~8mg =ImL的比例混合后，在3(T50°C条件下进行超声分散，r3h后得到Fe3O4的壳聚糖溶液；
II在三角瓶中按5 mL:1 mL~20 mL:1 mL的比例加入液体石蜡和司盘80，在2(T60°C下磁力搅拌混合均匀，然后逐滴加入所述Fe3O4的壳聚糖溶液，并在2(T60°C下磁力搅拌IOlOmin后加入5~20mL体积浓度为2~10%的戊二醛溶液，反应0.5~2h，再加入0.lmol/LNaOH，得到pH值为7.(Til.0的混合液；
III将所述混合液升温至4(T80°C，并继续反应f3h，得到反应液，该反应液经 0.03、.0SMPa减压过滤后，即得磁性壳聚糖微球粗品；
IV所述磁性壳聚糖微球粗品依次用异丙醇、丙酮、乙醇、去离子水清洗后，在4(T80°C下真空干燥至恒重，即得磁性壳聚糖微球，并置于4°C冰箱内保存；
⑶固定枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞:
将所述磁性壳聚糖微球加入到三角瓶中，用0.lmol/L的盐酸溶液充分溶胀5~15h，再加入0.lmol/L NaOH,得到pH值为4.0~10.0的磁性壳聚糖溶液；然后，将所述枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞加入到所述磁性壳聚糖溶液中，在2(T50°C以10(T500r/min的转速振荡吸附0.5~2h后，加入体积浓度为1%~4%的戊二醛溶液，再在20~50°C以100~500r/min的转速振荡交联0.5~2h,最后用磁铁收集磁性固定化细胞,该磁性固定化细胞用pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液充分洗涤后在4°C下保存，即得固定化的枯草芽抱杆菌 B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞；
⑷制备香兰素: a制备转化培养基:
将0.2~Ig阿魏酸、5~15g蛋白胨、2~IOg酵母浸出粉、2~15g NaCl与IL蒸馏水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min，即得pH值为6.0-10.0的转化培养基；b制备香兰素转化液:
将所述固定化的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞按f 20%的接种量接种至含有5(T200mL的所述转化培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在2(T50°C的条件下以10(T500r/min的速率进行振荡培养2(T40h，即得香兰素转化液；c固定化的枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞的回收:
将所述香兰素转化液以100(T5000r/min的转速离心5~30min，得到沉淀物C和上清液C，该沉淀物C即为固定化的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞；d分离香兰素:
将所述上清液C以800(Tl2000r/min的转速离心l(T60min,即得香兰素粗沉淀物；
e制备香兰素粗品:
将所述香兰素粗沉淀物在温度为4(T80°C、压力为0.05、.1OMPa的条件下真空干燥4(T100h，得到干燥的沉淀物，该干燥的沉淀物经研磨、过100-400目筛后，即得香兰素粗
品O
[0007]所述步骤②中的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7_S)其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2011162 ;其菌株16S rRNA在美国Genbank的访问号为JQ086379 ;菌株全基因组测序草图在DDBJ/EMBL/GenBank访问号为ΑΖΝΙ00000000。
[0008]所述步骤⑴或所述步骤⑶中pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液是指首先将27.2gKH2PO4 溶于 1000mL 水，得到 0.2mol/L KH2PO4 ;然后将 8.0g NaOH 溶于 1000mL 水，得到
0.2mol/L NaOH ;最后，将 250mL 0.2mol/L KH2PO4 和 118mL 0.2mol/L NaOH 混合均匀后稀释至1000mL所得的缓冲液。
[0009]本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明以磁性壳聚糖微球为载体，通过吸附-交联法将枯草芽孢杆菌B7-S{Bacillus subtilis B7-S)固定于磁性壳聚糖微球上,然后进行生物转化生产香兰素。其中磁性壳聚糖微球可回收重复使用，极大地减少微生物反复培养次数，有效地提高微生物利用率。同时固定化方法对细胞无损害，细胞的生物活性降低少。
[0010]2、本发明磁性壳聚糖微球固定化枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)细胞用于转化阿魏酸生成香兰素，不但可以提高阿魏酸的转化率，而且容易回收重复使用，避免枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)细胞随转化液流出体系，在降低生产成本的同时提高了生产效率。
[0011]3、本 发明操作简便，易于实施。
【具体实施方式】
[0012]实施例1 一种磁性材料固定细胞转化生产香兰素的方法，包括以下步骤: ⑴制备枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞:
①制备营养肉汁培养基:
将5g蛋白胨、2g牛肉提取物、2g NaCl与IL蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得pH值为5.0的营养肉汁培养基。
[0013]②将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7_S)斜面培养物按1%的接种量接种至含有50mL营养肉汁培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上,在20°C的条件下以100r/min的速率进行振荡培养36h,即得枯草芽孢杆菌B7_S(ifeci77w5.subtilisB7-S)菌液。
[0014]③将枯草芽抱杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌液以8000r/min的速率离心60min，分别得到上清液A和沉淀物A，该沉淀物A用5mL且pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液悬浮后，再以8000r/min的速率离心15min，分别得到上清液B和沉淀物B，该沉淀物B用pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液悬浮至菌悬浮液OD6tltol为0.4时，即得枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞。
[0015]⑵制备磁性壳聚糖微球:
I将纳米Fe3O4微球与质量浓度为1%的壳聚糖溶液按2mg =ImL的比例混合后，在30°C条件下进行超声分散，3h后得到Fe3O4的壳聚糖溶液。
[0016]II在三角瓶中按5 mL:1 mL的比例加入液体石蜡和司盘80，在20°C下磁力搅拌混合均匀，然后逐滴加入Fe3O4的壳聚糖溶液，并在20°C下磁力搅拌40min后加入5mL体积浓度为2%的戊二醛溶液，反应0.5h，再加入0.lmol/L NaOH,得到pH值为7.0的混合液。
[0017]III将混合液升温至40°C，并继续反应3h，得到反应液，该反应液经0.03MPa减压过滤后，即得磁性壳聚糖微球粗品。
[0018]IV磁性壳聚糖微球粗品依次用异丙醇、丙酮、乙醇、去离子水清洗后，在40°C下真空干燥至恒重，即得磁性壳聚糖微球，并置于4°C冰箱内保存。
[0019]⑶固定枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞:
将磁性壳聚糖微球加入到三角瓶中，用0.lmol/L的盐酸溶液充分溶胀5h，再加入
0.lmol/L NaOH，得到pH值为4.0的磁性壳聚糖溶液；然后，将枯草芽孢杆菌subtilis B7-S)菌细胞加入到磁性壳聚糖溶液中，在20°C以100r/min的转速振荡吸附2h后，加入体积浓度为1%的戊二醛溶液，再在20°C以100r/min的转速振荡交联2h，最后用磁铁收集磁性固定化细胞，该磁性固定化细胞用pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液充分洗涤后在4°C下保存，即得固定化的枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞。
[0020]⑷制备香兰素: a制备转化培养基: 将0.2g阿魏酸、5g蛋白胨、2g酵母浸出粉、2g NaCl与IL蒸懼水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min，即得pH值为
6.0的转化培养基。
[0021]b制备香兰素转化液:
将固定化的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞按1%的接种量接种至含有50mL的转化培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在20°C的条件下以lOOr/min的速率进行振荡培养40h，即得香兰素转化液。
[0022]c固定化的枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7_S)菌细胞的回收:
将香兰素转化液以1000r/min的转速离心30min，得到沉淀物C和上清液C，该沉淀物
C即为固定化的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞。
[0023]d分离香兰素:
将上清液C以8000r/min的转速离心60min,即得香兰素粗沉淀物。
[0024]e制备香兰素粗品:
将香兰素粗沉淀物在温度为40°C、压力为0.05MPa的条件下真空干燥100h，得到干燥的沉淀物，该干燥的沉淀物经研磨、过100目筛后，即得香兰素粗品。
[0025]实施例2 —种磁性材料固定细胞转化生产香兰素的方法，包括以下步骤: ⑴制备枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞:
①制备营养肉汁培养基:
将15g蛋白胨、IOg牛肉提取物、15g NaCl与IL蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得pH值为9.0的营养肉汁培养基。
[0026]②将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)斜面培养物按20%的接种量接种至含有200mL营养肉汁培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在40°C的条件下以500r/min的速率进行振荡培养12h，即得枯草芽孢杆菌B7_S {Bacillussubtilis B7-S)菌液。
[0027]③将枯草芽抱杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌液以 12000r/min 的速率离心15min，分别得到上清液A和沉淀物A，该沉淀物A用20mL且pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液悬浮后，再以12000r/min的速率离心5min，分别得到上清液B和沉淀物B，该沉淀物B用pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液悬浮至菌悬浮液OD6tltlnm为0.8时，即得枯草芽孢杆菌 B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞。
[0028]⑵制备磁性壳聚糖微球:
I将纳米Fe3O4微球与质量浓度为5%的壳聚糖溶液按8mg =ImL的比例混合后，在50°C条件下进行超声分散，Ih后得到Fe3O4的壳聚糖溶液。
[0029]II在三角瓶中按20 mL:1 mL的比例加入液体石蜡和司盘80，在60°C下磁力搅拌混合均匀，然后逐滴加入Fe3O4的壳聚糖溶液，并在60°C下磁力搅拌IOmin后加入20mL体积浓度为10%的戊二醛溶液，反应0.5h，再加入0.lmol/L NaOH,得到pH值为11.0的混合液。
[0030]III将混合液升温至80°C，并继续反应lh，得到反应液，该反应液经0.08MPa减压过滤后，即得磁性壳聚糖微球粗品。
[0031]IV磁性壳聚糖微球粗品依次用异丙醇、丙酮、乙醇、去离子水清洗后，在80°C下真空干燥至恒重，即得磁性壳聚糖微球，并置于4°C冰箱内保存。
[0032]⑶固定枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞:
将磁性壳聚糖微球加入到三角瓶中，用0.lmol/L的盐酸溶液充分溶胀15h，再加Λ 0.lmol/L NaOH，得到pH值为10.0的磁性壳聚糖溶液；然后，将枯草芽孢杆菌B7_S(.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞加入到磁性壳聚糖溶液中，在50°C以500r/min的转速振荡吸附0.5h后，加入 体积浓度为4%的戊二醛溶液，再在50°C以500r/min的转速振荡交联0.5h,最后用磁铁收集磁性固定化细胞,该磁性固定化细胞用pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液充分洗涤后在4°C下保存，即得固定化的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilisB7-S)菌细胞。
[0033]⑷制备香兰素: a制备转化培养基:
将Ig阿魏酸、15g蛋白胨、IOg酵母浸出粉、15g NaCl与IL蒸懼水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min，即得pH值为10.0的转化培养基。
[0034]b制备香兰素转化液:
将固定化的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞按20%的接种量接种至含有200mL的转化培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在50°C的条件下以500r/min的速率进行振荡培养20h，即得香兰素转化液。
[0035]c固定化的枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞的回收:
将香兰素转化液以5000r/min的转速离心5min，得到沉淀物C和上清液C，该沉淀物C
即为固定化的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞。
[0036]d分离香兰素:
将上清液C以12000r/min的转速离心10min,即得香兰素粗沉淀物。
[0037]e制备香兰素粗品:
将香兰素粗沉淀物在温度为80°C、压力为0.1OMPa的条件下真空干燥40h，得到干燥的沉淀物，该干燥的沉淀物经研磨、过400目筛后，即得香兰素粗品。
[0038]实施例3 —种磁性材料固定细胞转化生产香兰素的方法，包括以下步骤:⑴制备枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞:
①制备营养肉汁培养基:
将IOg蛋白胨、6g牛肉提取物、9g NaCl与IL蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得pH值为7.0的营养肉汁培养基。
[0039]②将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)斜面培养物按10%的接种量接种至含有125mL营养肉汁培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上,在30°C的条件下以300r/min的速率进行振荡培养24h，即得枯草芽孢杆菌B7_S {Bacillussubtilis B7-S)菌液。
[0040]③将枯草芽抱杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌液以 10000r/min 的速率离心35min，分别得到上清液A和沉淀物A，该沉淀物A用12mL且pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液悬浮后，再以10000r/min的速率离心10min，分别得到上清液B和沉淀物B，该沉淀物B用pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液悬浮至菌悬浮液OD6tltlnm为0.6时，即得枯草芽抱杆菌 B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞。[0041]⑵制备磁性壳聚糖微球:
I将纳米Fe3O4微球与质量浓度为3%的壳聚糖溶液按5mg =ImL的比例混合后，在40°C条件下进行超声分散，2h后得到Fe3O4的壳聚糖溶液。
[0042]II在三角瓶中按12 mL:1 mL的比例加入液体石蜡和司盘80，在40°C下磁力搅拌混合均匀，然后逐滴加入Fe3O4的壳聚糖溶液，并在40°C下磁力搅拌25min后加入12mL体积浓度为6%的戊二醛溶液，反应1.5h，再加入0.lmol/L NaOH,得到pH值为9.0的混合液。
[0043]III将混合液升温至60°C，并继续反应2h，得到反应液，该反应液经0.05MPa减压过滤后，即得磁性壳聚糖微球粗品。
[0044]IV磁性壳聚糖微球粗品依次用异丙醇、丙酮、乙醇、去离子水清洗后，在60°C下真空干燥至恒重，即得磁性壳聚糖微球，并置于4°C冰箱内保存。
[0045]⑶固定枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞:
将磁性壳聚糖微球加入到三角瓶中，用0.lmol/L的盐酸溶液充分溶胀10h，再加入
0.lmol/L NaOH，得到pH值为7.0的磁性壳聚糖溶液；然后，将枯草芽孢杆菌
subtilis B7-S)菌细胞加入到磁性壳聚糖溶液中，在35°C以300r/min的转速振荡吸附
1.5h后，加入体积浓度为2.5%的戊二醛溶液，再在35°C以300r/min的转速振荡交联1.5h，最后用磁铁收集磁性固定化细胞，该磁性固定化细胞用pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液充分洗涤后在4°C下保存，即得固定化的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞。
[0046]⑷制备香兰素:
a制备转化培养基:
将0.6g阿魏酸、IOg蛋白胨、6g酵母浸出粉、8g NaCl与IL蒸懼水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min，即得pH值为
8.0的转化培养基。
[0047]b制备香兰素转化液:
将固定化的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞按10%的接种量接种至含有125mL的转化培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在35°C的条件下以300r/min的速率进行振荡培养30h，即得香兰素转化液。
[0048]c固定化的枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞的回收:
将香兰素转化液以3000r/min的转速离心18min，得到沉淀物C和上清液C，该沉淀物
C即为固定化的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞。
[0049]d分离香兰素:
将上清液C以10000r/min的转速离心35min,即得香兰素粗沉淀物。
[0050]e制备香兰素粗品:
将香兰素粗沉淀物在温度为60°C、压力为0.0SMPa的条件下真空干燥70h，得到干燥的沉淀物，该干燥的沉淀物经研磨、过250目筛后，即得香兰素粗品。
[0051]上述实施例广3中，枯草芽孢杆菌subtilis B7-S)其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2011162 ;其菌株16S rRNA在美国Genbank的访问号为JQ086379 ;菌株全基因组测序草图在DDBJ/EMBL/GenBank访问号为ΑΖΝΙ00000000。
[0052]pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液是指首先将27.2g KH2PO4溶于1000mL水，得到
0.2mol/L KH2PO4 ;然后将 8.0g NaOH 溶于 1000mL 水，得到 0.2mol/L NaOH ;最后，将 250mL
0.2mol/L KH2PO4和118mL 0.2mol/L NaOH混合均匀后稀释至1000mL所得的缓冲液。
[0053]医药用纳米Fe3O4微球(99.6%, ( 20nm球形,市售),壳聚糖(Sigma公司生产)，蛋白胨(OXIDE公司生产)，牛肉提取物(BBI公司生产)，其他试剂均为分析纯。
【权利要求】
1.一种磁性材料固定细胞转化生产香兰素的方法，包括以下步骤: ⑴制备枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtil is B7-S)菌细胞: ①制备营养肉汁培养基: 将5~15g蛋白胨、2~10g牛肉提取物、2~15g NaCl与IL蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得pH值为5.0-9.0的营养肉汁培养基； ②将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S{Bacillus subtil is B7-S)斜面培养物按1-20%的接种量接种至含有50-200mL所述营养肉汁培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在20-40°C的条件下以100-500r/min的速率进行振荡培养12~36h，即得枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtil is B7-S)菌液； ③将所述枯草芽抱杆菌B7-S(.Bacillus subtil is B7-S)菌液以8000~12000r/min的速率离心15飞Omin，分别得到上清液A和沉淀物A，该沉淀物A用5~20mL且pH=6.8的.0.2mol/L磷酸盐缓冲液悬浮后，再以8000-l2000r/min的速率离心5~15min，分别得到上清液B和沉淀物B，该沉淀物B用pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液悬浮至菌悬浮液OD6tltlnm为.0.4~0.8时，即得枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtil is B7-S)菌细胞； ⑵制备磁性壳聚糖微球: I将纳米Fe3O4微球与质量浓度为f 5%的壳聚糖溶液按2mg: lmL~8mg =ImL的比例混合后，在30-50°C条件下进行超声分散，r3h后得到Fe3O4的壳聚糖溶液； II在三角瓶中按5 mL:1 mL~20 mL:1 mL的比例加入液体石蜡和司盘80，在20-60°C下磁力搅拌混合均匀，然后逐滴加入所述Fe3O4的壳聚糖溶液，并在20-60°C下磁力搅拌10-10min后加入5~20mL体积浓度为2~10%的戊二醛溶液，反应0.5~2h，再加入0.lmol/LNaOH，得到pH值为7.0-l.0的混合液； III将所述混合液升温至40-80°C，并继续反应f3h，得到反应液，该反应液经.0.03、.0SMPa减压过滤后，即得磁性壳聚糖微球粗品； IV所述磁性壳聚糖微球粗品依次用异丙醇、丙酮、乙醇、去离子水清洗后，在40-80°C下真空干燥至恒重，即得磁性壳聚糖微球，并置于4°C冰箱内保存； ⑶固定枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtil is B7-S)菌细胞: 将所述磁性壳聚糖微球加入到三角瓶中，用0.lmol/L的盐酸溶液充分溶胀5~15h，再加入0.lmol/L NaOH,得到pH值为4.0~10.0的磁性壳聚糖溶液；然后，将所述枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtil is B7-S)菌细胞加入到所述磁性壳聚糖溶液中，在20-50°C以100-500r/min的转速振荡吸附0.5~2h后，加入体积浓度为1%~4%的戊二醛溶液，再在20~50°C以100~500r/min的转速振荡交联0.5~2h,最后用磁铁收集磁性固定化细胞,该磁性固定化细胞用pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液充分洗涤后在4°C下保存，即得固定化的枯草芽抱杆菌 B7-S (.Bacillus subtil is B7-S)菌细胞； ⑷制备香兰素: a制备转化培养基: 将0.2~Ig阿魏酸、5~15g蛋白胨、2~IOg酵母浸出粉、2~15g NaCl与IL蒸馏水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min，即得pH值为6.0-10.0的转化培养基；b制备香兰素转化液:将所述固定化的枯草芽孢杆菌B7-S (Mcillus subtilis B7-S)菌细胞按f 20%的接种量接种至含有5(T200mL的所述转化培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在2(T50°C的条件下以10(T500r/min的速率进行振荡培养2(T40h，即得香兰素转化液；c固定化的枯草芽孢杆菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌细胞的回收: 将所述香兰素转化液以100(T5000r/min的转速离心5~30min，得到沉淀物C和上清液C，该沉淀物C即为固定化的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌细胞；d分离香兰素: 将所述上清液C以800(Tl2000r/min的转速离心l(T60min,即得香兰素粗沉淀物； e制备香兰素粗品: 将所述香兰素粗沉淀物在温度为4(T80°C、压力为0.05、.1OMPa的条件下真空干燥4(T100h，得到干燥的沉淀物，该干燥的沉淀物经研磨、过100-400目筛后，即得香兰素粗品O
2.如权利要求1所述的一种磁性材料固定细胞转化生产香兰素的方法，其特征在于:所述步骤②中的枯草芽孢杆菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2011162 ;其菌株16S rRNA在美国Genbank的访问号为JQ086379 ;菌株全基因组测序草图在DDBJ/EMBL/GenBank访问号为ΑΖΝΙ00000000。
3.如权利要求1所述的一种磁性材料固定细胞转化生产香兰素的方法，其特征在于:所述步骤⑴或所述步骤⑶中pH=6.8的0.2mol/L磷酸盐缓冲液是指首先将27.2g KH2PO4溶于 1000mL 水，得到 0.2mol/L KH2PO4 ;然后将 8.0g NaOH 溶于 1000mL 水，得到 0.2mol/LNaOH ;最后，将 250mL 0.2mol/L KH2PO4 和1181^ 0.2mol/L NaOH 混合均匀后稀释至 1000mL所得的缓冲液。
【文档编号】C12R1/125GK103981226SQ201410233573
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】陈朋, 李素岳, 王宁波, 严晓娟 申请人:甘肃省商业科技研究所