水稻缺铁诱导启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种水稻缺铁诱导启动子及其应用，具有：i)SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列；或ii)SEQID?NO.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。本发明还提供含有上述启动子的载体、转基因细胞系以及工程菌。还提供上述启动子在启动目的基因表达中的应用。还提供上述启动子在转基因植物中的应用；方法为将重组载体导入所述目的植物，从而在所述目的植物中用所述DNA片段启动GUS基因的表达。本发明有益的效果是：本发明启动子的发现及其功能的阐释，将对水稻耐受缺铁逆境生理机制的研究，有效地开展水稻抗缺铁环境胁迫及富铁育种均具有重要理论和实践意义。
【专利说明】水稻缺铁诱导启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学、基因工程【技术领域】，主要是一种水稻缺铁诱导启动子及 其应用。
【背景技术】
[0002] 铁是植物生长必需的营养元素之一。铁元素作为许多重要酶和蛋白质的组成成分 参与了生命活动中最基本的生化反应，如光合作用和呼吸作用。缺铁是各种人类微量元素 缺乏症中最普遍的一种，据2002年世界卫生组织统计，全世界有近半数的人口受铁营养缺 乏的困扰（如缺铁性贫血病，婴幼儿的智力和体能发育障碍等）。因而提高和改良粮食作物 中铁元素含量变得尤为重要。
[0003] 土壤中总铁含量很高，但可被植物吸收利用的有效铁含量却很低。其中的绝大部 分都以可溶性极低的三价铁形式存在，因而使得植物常常表现出缺铁失绿症状。在农业生 产中，铁素缺乏一直是限制作物生长发育以及作物产量和品质提高的主要因子之一。植物 主要以两种方式吸收铁：策略I和策略II。策略II是禾本科植物吸收土壤铁素的主要途 径，禾本科植物的根系向环境中分泌一种麦根酸类（MAs)天然鏊合剂，与环境中的Fe(III) 鏊合形成Fe (III) -MAs复合物，然后通过植物特殊的转运载体YS1被植物所吸收。在缺铁 条件下，禾本科植物能增加 MA合成和分泌。禾本科以外的植物都通过氧化还原的策略I方 式来吸收铁。
[0004] 水稻是重要的粮食作物之一，为世界一半以上的人口提供了食物来源。研究发现， 水稻的根不但通过策略II途径吸收Fe (III)，水稻的根也具有吸收Fe (II)的能力。由于水 稻中并未发现有功能的Fe(III)还原酶活性，水稻有可能对Fe(II)是直接转运吸收的，这 可能与水稻长期适应淹水的特殊生长环境有关。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种水稻缺铁诱导启动子及其应用，该 启动子含有IDE1和IDE2等缺铁响应元件，对于水稻耐缺铁分子机制的研究，以及水稻耐缺 铁分子育种具有重要的理论与实践意义。
[0006] 为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：本发明的水稻缺铁诱导启 动子，该启动子DNA片段具有：i)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或ii)SEQ ID NO. 1所示 核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序 列。
[0007] 本发明还提供含有上述启动子的载体、含有上述启动子的转基因细胞系以及含有 上述启动子的工程菌。
[0008] 本发明还提供上述启动子在启动目的基因表达中的应用，所述目的基因的表达为 缺铁诱导表达。
[0009] 本发明还提供上述启动子在转基因植物中的应用，如培育耐缺铁的转基因水稻， 所述目的植物为水稻；所述目的基因为GUS基因；所述缺铁条件为不供铁的水稻培养液；方 法为将重组载体导入所述目的植物，从而在所述目的植物中用所述DNA片段启动GUS基因 的表达。
[0010] 本发明有益的效果是：本发明启动子的发现及其功能的阐释，将对水稻耐受缺铁 逆境生理机制的研究，有效地开展水稻抗缺铁环境胁迫及富铁育种均具有重要理论和实践 意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1为real-time PCR方法检测在正常供铁和缺铁胁迫条件下基因的表达。
[0012] 图2为本发明实施例中构建的启动子载体图谱。
[0013] 图3为本发明实施例中转基因水稻的叶片、根尖和侧根的GUS组织染色结果；其 中，A为正常供铁培养条件，B缺铁胁迫条件。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
[0015] 以下实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行或按照制造生产厂 商的使用说明。
[0016] 水稻缺铁诱导基因启动子的发现
[0017] 1. 1水稻缺铁诱导基因的发现
[0018] 本发明的发明人先前对正常供铁和缺铁胁迫培养的水稻为材料进行芯片（芯 片Affimetrix公司的水稻全基因组芯片GencChip? Rice Genome Array)杂交，在芯片 数据分析的基础上，筛选缺铁诱导相关基因 （Cheng LJ等Mutation in nicotianamine aminotransferase stimulated the Fe(II)acquisition system and led to iron accumulation in rice. Plant Physiology2007, 145:1647-1657 ；Zheng LQ 等 Physiological and transcriptome analysis of iron and phosphorus interaction in rice seedlings. Plant Physiology2009, 151: 262-274·)。根据基因的序列设计定量 PCR 分析的特异性引物，从图1中可以看出，在缺铁处理条件下，基因在水稻叶片和根中的表达 量明显增加。
[0019] 1. 2水稻缺铁诱导启动子的发现
[0020] 按照水稻数据库网站（http://rice. plantbiology. msu. edu/index. shtml)公布 的水稻基因组序列，设计其上游启动子序列的PCR扩增引物，并在两条引物的5'端分别添 加酶切位点序列和保护碱基。引物序列分别为：pr⑶S-F :5' -gcgtcgacTCTTCTGACTCCTTTT ACTCTAC-3' ；pr⑶S-R :5' -cgggtaccCACGCTGCCCCAGTACGTACC-3'。以日本晴水稻的基因组 DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为热启动95°C 5分钟；然后95°C 20秒，60°C 30秒， 72°C 2分钟，30个循环后72°C延伸10分钟。获得的PCR产物进行测序，结果表明PCR产物 具有SEQ ID NO. 1所示的2Kb核苷酸片段。
[0021] 对启动子序列进行分析，发现在其区域内含有与缺铁胁迫相关的顺式作用元件 IDE1 和 IDE2。
[0022] 实施例：缺铁诱导启动子转基因水稻的获得
[0023] 2· 1生物材料
[0024] 2· 1· 1植物材料
[0025] 水稻转基因受体材料为粳稻日本晴
[0026] 2. 1. 2菌株和载体
[0027] 使用的农杆菌菌株为ΕΗΑ105,载体为pCAMBIA1300。
[0028] 2. 2 方法
[0029] 2. 2. 1缺铁诱导启动子植物表达载体的构建
[0030] 用Sal I和Κρη I (ΝΕΒ公司）酶切实施例1回收的PCR产物。
[0031] 通过Sal I和Κρη I双酶切植物表达载体pCAMBIA1300,回收载体骨架。
[0032] 用T4DNA连接酶连接上述酶切的PCR产物与载体骨架。对重组质粒进行测序，所 构建的pCAMBIA1300-Pr〇-GUS载体图谱如图2所示。
[0033] 2. 2. 2转基因水稻的获得
[0034] 选取成熟饱满的日本晴种子脱壳后，经消毒滤干后接种到愈伤诱导培养基上进行 诱导培养。选择外观颜色嫩黄、生长良好的颗粒状愈伤组织用于遗传转化。采用农杆菌介 导法将pCAMBIA1300-Pr〇-GUS转入水稻愈伤组织中，用含有乙酰丁香酮和0D600为0. 5的 农杆菌的AAM转化液进行浸泡，将浸泡过的愈伤组织转至共培养基上暗培养3天。然后转 移至选择培养基上培养，每10天继代一次。30天后将筛选出的抗性愈伤转至分化培养基 上分化培养40天。将分化出的绿色小苗移至生根培养基上生根并进行炼苗。当幼苗长至 10cm高时，取出幼苗并用无菌水洗净根部附着的固体培养基。
[0035] 培养基配制如下：
[0036] 诱导培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2. 0mg/L2, 4-D+O. 5g/L L-谷 氨酰胺+2. 8g/L L-脯氨酸+0. 3g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，pH调至5. 8后加入植物凝胶 4g/L。
[0037] 共培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2. 0mg/L2, 4-D+O. 5g/L L-谷 氨酰胺+2. 8g/L L-脯氨酸+0. 6g/L水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L蔗糖，pH调至5. 2后 加入植物凝胶4g/L。灭菌后，加入乙酰丁香酮200 μ mol/L。
[0038] 选择培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2. 0mg/L2, 4-D+O. 5g/L L-谷 氨酰胺+2. 8g/L L-脯氨酸+0. 6g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，pH调至5. 8后加入植物凝胶 4g/L。灭菌后加入30mg/L潮霉素和400mg/L头孢。
[0039] 分化培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+0. 5g/L L-谷氨酰胺+0. 5g/ L L-脯氨酸 +lg/L 水解酪蛋白 +3. 0mg/L6-BA+0. 5mg/L NAA+30g/L 鹿糖 +20g/L 山梨醇，pH 调至5. 8后加入植物凝胶4g/L。
[0040] 2. 2. 3转基因水稻缺铁诱导⑶S目的基因的表达
[0041] 取生长7天的转基因水稻分别进行正常供铁和缺铁胁迫培养7天，随后分别取叶 片和根部材料，同时进行GUS组织染色。结果如图3所示，转基因植株在正常培养时没有 GUS表达活性，而缺铁处理后植株叶片和根中的GUS表达活性很强，表明该启动子能调控目 的基因在植株受到缺铁胁迫时表达。
[0042] GUS 染色液配方为：100mmol/L 磷酸缓冲液（ρΗ7· 0)，5mmol/L EDTA，0· 5mmol/L 铁 氰化钾，〇· 5mmol/L 亚铁氰化钾，0· 5% Triton Χ-100,0· 2mg/L X-gluc，以水配制。
[0001] 说明书核苷酸及氨基酸序列表 序列表 <1〗〇>浙江6'农业利学院 <120)水稻缺铁诱导启动子及其应用 <130'> 无 <140> <141> <160> 1 <210> 1 <211> 2000 <212> DNA <213> 7_)C稻(Oryza. sativa ssp. japonica) <400> 1 tctlct^act ccttttautc tactctcltc ctattctagt atacaatata i；tacaaiaga 60 gcctcttata atttatctca a^cttggaag Tgtatgttga agtgagtgag atgat^tcct 120 tatatagggg taggtatgac ggttggcgaa gggaaaatgt ccgaagtgcc ctccaaccgt 180 catcagggat gtatctggga cgtccacgcc aaaccccaca tccaacggtg gaggtggtgg 240 ttcggccgna cc1ggctagg cctat ctd^c ctggcciltd gcccttgi tc tcccctggtc 300 ctcctctatt cattcttcgg tattttggRt tgattcact^ atgttttcat gaaattcaca 360 acccatcctt gtatggatac ataattctcc tcactttagt ctagatttcc tccaacatca 420 gggcttatct tctgcataca aatatacacc aacacttgtg gaatatgtgs gatigagcac 480 ctatcactat ^tta^atutt ttattatccu aactttatgc agat^ttg^c ngtac^aaat 540 cgcaatttaa caactgtcaa cartcgacgc ttraatrctt cttgagatgg tatgatatgg 600 tctttaggta atctaatttg tttttctt.gc aaaagataat. caaagatctt atcacacttg 660 gccacatcaa aactatactt aacctcactt tgcggatttt tacgaggagt ctgcattaaa 720 ttagagcaag cagaaggctt atttttgtta gtccatgacc acicagcaac atacatatca 780 IgaLcacccL caccUcaci aicactagcc Lcagaglatit ctitULgaa丨 L aacaL laggc 84Q trcttctcat atagtcaggt ttcgartttt ctggttxttt gagttttttt ctggcacttc 900 cgttgtttgc cgcgtggctt gttttttatg ttntaattta tittttctag tgtgaccggc 960 tggttcccag cttaattttt gtatccggta tatgactttg atagcc^aag ttttcagc^t 1020 ggs t Lagiac gta tacgtgc ctgtca tagt actt tttclc tctccgtttg aUctggcag 1080 acggttcgtt ct-tatcctgt tttctagctg ttcacattag ctatttgtgc atgctttgtg 1140 cttgcaagcg tactgcgcat gctgccatgc ggccacaaac tgtagtccac gcgctagctg 1200 ctggctttgc ttgtgcctac atgtgctgtg cacgtgctgc ccccatgcca tttatattat 1260 a11g1111ca cllgalatiLL accalalala caallaalll galgctacal gcclacalac 1320
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【权利要求】
1. 一种水稻缺铁诱导启动子，其特征在于：启动子DNA片段的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示。
2. -种表达载体，其特征在于：含有权利要求1的DNA核苷酸序列。
3. -种转基因细胞系，其特征在于：含有权利要求1的DNA核苷酸序列。
4. 一种工程菌，其特征在于：含有权利要求1的DNA核苷酸序列。
5. 根据权利要求1所述的水稻缺铁诱导启动子在启动目的基因表达中的应用。
6. 根据权利要求5所述的水稻缺铁诱导启动子在启动目的基因表达中的应用，其特征 在于：在目的植物中用所述DNA片段启动目的基因的表达，得到目的基因表达受到缺铁诱 导的转基因植物。
7. 根据权利要求6所述的水稻缺铁诱导启动子在启动目的基因表达中的应用，其特征 在于：所述目的植物为水稻；所述目的基因为GUS基因；所述缺铁条件为不供铁的水稻培养 液；方法为将重组载体导入所述目的植物，从而在所述目的植物中用所述DNA片段启动GUS 基因的表达。
【文档编号】C12N1/15GK104059912SQ201410249644
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】王芳, 邓敏娟, 徐磊, 赵红玉, 魏溪娟, 易可可 申请人:浙江省农业科学院