杀灭革兰氏阳性菌的酶抗生素及其制备、用途
【专利摘要】本发明公开了一种杀灭革兰氏阳性菌的酶抗生素及其制备、用途；所述酶抗生素为由如SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白。本发明从猪链球菌基因组中筛选具有特定裂菌作用的基因，通过构建原核表达载体，获得具有裂菌活性的重组表达产物——酶抗生素，确定其抗菌活性、裂菌谱、裂菌效率，以及影响表达产物活性的最优裂解条件。酶抗生素特异性强，且不易使细菌产生抗性，也不会对宿主产生不良影响，是解决现在日趋严重的细菌耐药性的一种可行性方法。
【专利说明】杀灭革兰氏阳性菌的酶抗生素及其制备、用途
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物化学领域，涉及一种杀灭革兰氏阳性菌的酶抗生素及其制备、用途。
【背景技术】
[0002]猪链球菌是一种人兽共患病原菌，可引起人脑膜炎、仔猪脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎等疾病，严重的可致人死亡。现已发现该菌荚膜抗原血清型有35种以上，大多数致病性血清型在1-9型，其中猪链球菌2型为最常见和毒力最强的血清型，流行最广，对猪的致病力也最强，给养猪业造成巨大的经济损失，在公共卫生方面，对相关从业人员的生命安全构成严重威胁。目前，对于猪链球菌病的治疗主要是抗生素治疗。近几年由于养殖过程中抗生素的滥用，导致细菌的耐药性也逐渐加剧，因此抗生素治疗已面临巨大的挑战。
[0003]同样，金黄色葡萄球菌也是一种人兽共患病原菌，可致人和动物的多种疾病。多重耐药性金黄色葡萄球菌呈全球性扩散、传播，严重威胁着人类健康。由于金黄色葡萄球菌不断进化，对抗生素的耐药性越来越强，它的高扩散性和高致病性，已经导致世界各国出现越来越多的临床病例难以治愈，因而对人类健康的威胁也越来越大。因此，在抗生素对耐药性金黄色葡萄球菌无能为力的情况下，亟需一种全新的抗菌制剂来防控其感染与传播。
[0004]通过细菌基因组的分析，发现在细菌的全基因中还有很多基因的功能未知，有的大概预测了某个基因的功能，但并没有被开发利用。这些基因有的是细菌本身具有的，有的是细菌在漫长的进化过程中通过一些特定的基因重组事件获得的外源基因或构件。其中细菌中原噬菌体基因组构件的存在就是一个典型的基因重组案例，原噬菌体不但能够介导宿主菌生物学特性的改变，还能够影响宿主菌的繁殖周期，决定宿主菌的溶原和裂解状态。在裂解过程中噬菌体在感染细菌后期表达一类细胞壁水解酶，该酶可通过特异性水解氨基糖之间的糖苷键，即细胞壁肽聚糖上的酰胺键或肽内氨基酸残基间的连接键，达到裂解细菌的目的，因此也称为酶抗生素。与抗生素相比，这类水解酶特异性强，且不易使细菌产生抗性，也不会对宿主产生不良影响，是解决现在日趋严重的细菌耐药性的一种可行性方法。然而目前所挖掘的具有实用性的水解酶还寥寥无几，且大多数这类酶活性低或难以大批量生产，特别是同时能特异性裂解多重耐药的链球菌和金黄色葡萄球菌的酶抗生素还未见报道，本发明的突出优势就是解决了以上这几个问题。
[0005]本发明通过基因筛选、克隆和表达获得了一种重组蛋白质，通过生物活性的检测，确定其对链球菌和金黄色葡萄球菌的裂解活性、裂菌谱以及裂菌效率，并优化了保持该重组蛋白最佳活性的缓冲液、PH值、保存温度等，确定该重组蛋白为特异、高效裂解多种血清型的猪链球菌、马链球菌兽疫亚种及金黄色葡萄球菌的新型生物制剂。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于针对现有技术中的缺陷，提供一种杀灭革兰氏阳性菌的酶抗生素及其制备、用途；具体是一种能够高效杀灭多种血清型猪链球菌、马链球菌兽疫亚种及多重耐药的金黄色葡萄球菌的革兰阳性菌的酶抗生素的筛选、制备、生物特性、裂菌方法、裂菌条件优化及用途。本发明从猪链球菌基因组中筛选具有特定裂菌作用的基因，通过构建原核表达载体，获得具有裂菌活性的重组表达产物，确定其抗菌活性、裂菌谱、裂菌效率，以及影响表达产物活性的最优裂解条件，提供一种能够高效裂解多种血清型的多重耐药的猪链球菌、马链球菌兽疫亚种及金黄色葡萄球菌的新型裂菌制剂、用途。
[0007]本发明的目的是通过以下的技术方案实现的:
[0008]第一方面，本发明涉及一种氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的蛋白质。该蛋白质，能够高效裂解多种血清型多重耐药的猪链球菌、马链球菌兽疫亚种及金黄色葡萄球菌，因此也称酶抗生素。
[0009]第二方面，本发明涉及一种编码如上述蛋白质的核苷酸。
[0010]优选地，所述核苷酸的序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]第三方面，本发明涉及一种上述蛋白质的制备方法，包括如下步骤:
[0012]步骤一:根据最新文献，在GenBank检索相应的基因序列，分析可疑编码裂解酶的基因，设计引物，以猪链球菌菌株基因组DNA为模板，采用PCR技术扩增相应的基因片段，片段大小为738bp ；
[0013]步骤二:米用原核表达系统pET_28a(+),将步骤一扩增所得DNA序列构建重组质粒 pET-28a (+)-LySS7 ；
[0014]步骤三:将步骤二的重组质粒转化到表达载体(大肠杆菌BL21(DE3))中，筛选阳性克隆进行蛋白的诱导表达和鉴定，获得重组蛋白LySS7，重组蛋白分子量为29.8kDa ；
[0015]步骤四:采用平板裂解实验，以一株猪链球菌2型为裂解菌，确定步骤三获得的重组蛋白LySS7的裂菌特性；
[0016]步骤五:高效诱导表达并纯化具有裂菌活性的重组蛋白，得到具有生物活性的酶抗生素，测得该酶抗生素的浓度为3.27mg/ml，产量为32.7mg/L。
[0017]上述新型酶抗生素的制备方法还包括对该酶抗生素进行性能验证的步骤，具体包括如下步骤:
[0018]步骤六:以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌采用浊度递减实验测定该酶抗生素的裂解效率、活性单位。酶活性单位为2nunit/ml,626unit/mg,每单位所含的LySS7重组蛋白的量为1.60yg;
[0019]步骤七:确定该酶抗生素的裂菌谱，所用裂解菌为不同血清型的多重耐药的猪链球菌菌株、马链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌菌株、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。该酶抗生素对沙门氏菌，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌不具有裂解活性，对多种血清型的多重耐药的猪链球菌、马链球菌兽疫亚种及金黄色葡萄球菌均具有裂解活性；
[0020]步骤八:确定该酶抗生素发挥作用的最佳条件:最适裂解温度和最适裂解pH。最适裂解温度为37°C，最适裂解pH为5.5 ;
[0021]步骤九:确定该酶抗生素的稳定性，稳定性包括4°C下放置一个月的稳定性和-80°C与室温反复冻融10次后的稳定性。4°C放置一个月裂菌制剂的活性单位由2nunit/ml降为28unit/ml，-80°C与室温反复冻融10次后裂菌制剂的活性单位由2nunit/ml降为29unit/ml，说明该酶在4°C放置一个月和_80°C与室温反复冻融10次后仍具有很高的裂菌活性。
[0022]优选地，步骤一中，所述引物具体为:上游引物的序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物的序列如SEQ ID N0.4所示。
[0023]优选地，步骤四中，所述平板裂解实验:以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌与获得的重组蛋白粗提液进行平板裂解实验，具体操作为将50ml OD600 = 1.0的HA9801菌液，PBS洗涤三次后用ImlPBS重悬获得细菌重悬液，将细菌重悬液与已融化的40°C左右的
0.7 %的THB上层琼脂混匀，制备双层琼脂平板，室温放置约20min至完全凝固，用打孔器在琼脂平板表面打孔，直径为10mm，共打6个孔，设置两个组，实验组和对照组，每组设置三个重复，加样时，实验组每孔加入40 μ L的重组蛋白粗提液，对照组每孔加入等量的空载体粗提液。37°C温箱放置4h左右，观察有无裂菌圈。实验结果显示实验组能够形成明显的裂菌圈，对照组不能够形成裂菌圈。该重组蛋白能够裂解猪链球菌，具有裂菌活性。
[0024]优选地，所述步骤六中测定该酶抗生素酶解活性具体为:倍比稀释该酶抗生素，分别取100 μ L不同稀释梯度的酶抗生素加入96孔板中，OD600 = 1.0的ΗΑ9801菌液，PBS洗涤三次后重悬至OD65tl = 0.6，取10yL处理好的菌液与不同稀释梯度的酶抗生素混匀，测定混合物在650nm处的吸光值即OD65tl作为初始值。将96孔板放置在37°C温箱中，孵育30min后，测定混合物在650nm处的吸光值作为终止值。根据两次读数计算细菌浊度下降的百分数，从而确定该酶抗生素的活性单位。该酶抗生素的活性单位为2nUnit/ml，626Unit/mg，每单位所含的LySS7重组蛋白的量为1.60 μ g0
[0025]优选地，所述步骤七中确定酶抗生素的裂菌谱具体为:采用浊度递减实验，将等量的该酶抗生素与不同的裂解菌在37°C条件下孵育30min，计算细菌浊度下降的百分数，从而确定该酶抗生素对部分菌种的裂解活性。结果表明该酶抗生素不能够裂解大肠杆菌和李斯特菌，对多重耐药的猪链球菌2型、7型、9型、马链球菌兽疫亚种和金黄色葡萄球菌都具有裂解作用，对猪链球菌2型中的大部分菌株裂菌活性较高。
[0026]优选地，所述步骤八中确定该酶抗生素发挥作用的最适裂解温度具体为:采用浊度递减实验，以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，分别测定在22°C、27°C、32°C、37°C和42°C条件下孵育30min后细菌浊度下降百分数，其中细菌浊度下降百分数最大的对应的孵育温度即为该酶抗生素的最佳作用温度。实验结果表明，37°C孵育时能够使细菌浊度下降百分数达到最大，该酶抗生素的最佳裂解温度为37°C。
[0027]优选地，所述步骤八中确定该酶抗生素发挥作用的最适裂解pH具体为:用pH4.5、ρΗ5.5、ρΗ6.0、ρΗ6.5、ρΗ7.0、ρΗ7.5、ρΗ8.0和ρΗ8.5的不同缓冲液处理该酶抗生素，采用浊度递减实验，以猪链球菌2型菌株ΗΑ9801为裂解菌，37°C条件下反应30min，计算细菌浊度下降百分数，能够使细菌浊度下降百分数达到最大的为该重组蛋白发挥作用的最适裂解pH。该重组蛋白对pH不敏感，在pH4.5的酸性条件和pH8.5的碱性条件下都具有较强的裂菌活性，pH5.5时细菌浊度下降百分数稍高于其它pH下的浊度下降百分数，所以该酶抗生素的最适裂解pH为5.5。
[0028]优选地，所述步骤九中确定该酶抗生素4°C稳定性具体为:将该酶抗生素在4°C冰箱中放置一个月，期间分别间隔5天、15天、20天、25天和30天的时候，取出部分酶抗生素，以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，采用浊度递减实验，测定该酶抗生素的活性单位，该酶抗生素在4°C冰箱放置一个月活性单位由2nunit/ml降为28unit/ml，表明该酶仍具有很高的裂菌活性。
[0029]优选地，所述步骤九中确定该酶抗生素-80°C与室温条件下反复冻融的稳定性具体为，将该酶抗生素放置在-80°C冰箱中30min至完全凝固，取出该酶抗生素，放置在室温条件下至完全融化，采用浊度递减实验以HA9801为裂解菌测定酶抗生素的活性单位，如此操作反复冻融10次，确定酶抗生素的稳定性，该酶抗生素经过-80°C和室温反复10次冻融后活性单位由原来的2nunit/ml降为29unit/ml，表明该酶仍具有很高的裂菌活性。
[0030]第四方面，本发明涉及一种上述的蛋白在制备革兰氏阳性菌裂解药物中的用途。
[0031]优选地，所述革兰氏阳性菌为多重耐药的猪链球菌、马链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌中的一种或几种。更优选为猪链球菌、马链球菌兽疫亚种和金黄色葡萄球菌。
[0032]优选地，所述猪链球菌菌株有2型菌株:SS2-l、05-465、19-2 (A)、5-2、ZY05719、HA9801、HA9802、HA05729-1、29、SS2-H、11-1、SS2-4、006731 ；7 型菌株 SS7 和 9 型菌株 SS9 ；马链球菌兽疫亚种菌株ATCC35246 ;金黄色葡萄球菌菌株有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株:PNB49、DL44-2、SD2-17-1、DL57-3、DZ92、PNB5、PNB25、PNB31、DL56-1 和普通金黄色葡萄球菌菌株:05P361、05Q132、ATCC25913、05L189、K185、B52。
[0033]第五方面，本发明涉及一种使用上述的蛋白进行裂菌的方法，包括如下步骤:采用常规方法进行裂解；
[0034]其中，裂解使用的缓冲液包含PBS缓冲液、CH3COOH-CH3COONa缓冲液、NaH2PO4-Na2HPO4 缓冲液、HCl-Tris 缓冲液；
[0035]缓冲液浓度为10~20mM ；
[0036]裂解酸度为ρΗ4.5~8.5 ;
[0037]裂解温度为22~42°C。
[0038]本发明的原理在于:根据该酶抗生素的基因序列设计引物，采用PCR技术扩增目的片断，将目的片断与pET-28a(+)载体连接，得到重组高效表达质粒，导入表达载体大肠杆菌BL21(DE3)中，阳性克隆检验获得阳性克隆，诱导，表达获得重组蛋白，通过Ni柱纯化获得纯化的酶抗生素，分子量为29.8kDa，命名为LySS7，在体外可高效裂解多种血清型多重耐药的猪链球菌、马链球菌兽疫亚种和金黄色葡萄球菌。
[0039]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:本发明通过原核表达系统高效表达了具有高效裂解多种病原细菌的酶抗生素，可大量获得纯化的有活性的酶抗生素，测定了最优的裂菌条件，该酶抗生素在体外高效、特异性裂解多种血清型多重耐药的猪链球菌、马链球菌兽疫亚种及金黄色葡萄球菌。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0041]图1为采用SDS-PAGE鉴定纯化的重组表达蛋白LySS7的示意图；
[0042]图2为以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，通过平板裂解实验检验LySS7重组蛋白粗提液活性的示意图；
[0043]图3为以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，测定该重组蛋白活性单位的示意图；
[0044]图4为通过浊度递减实验测定该重组蛋白的裂菌谱的示意图；
[0045]图5为以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，测定该重组蛋白的最适反应温度的示意图；
[0046]图6为以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，测定该重组蛋白最适反应pH的示意图；
[0047]图7为以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，测定该重组蛋白4°C条件下的稳定性示意图；
[0048]图8为以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，测定该重组蛋白_80°C和室温反复冻融10次后的稳定性的示意图。
【具体实施方式】
[0049]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0050]实施例1、设计引物，PCR扩增目的基因片段
[0051]参考GenBank中猪链球菌菌株的基因序列，设计引物，以猪链球菌基因组DNA为模板，采用PCR技术扩增目的基因，目的基因大小为738bp，具体操作如下:
[0052]设计引物，引物序列见表1，扩增目的基因，在上下游引物的5’端分别插入EcoR I和Hind III酶切位点。以猪链球菌菌株基因组DNA为模板，按照常规方法进行目的基因片段的扩增。PCR反应结束后，取10μ L产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检验目的条带大小。利用胶回收试剂盒回收PCR产物。
[0053]表1PCR引物序列
[0054]
【权利要求】
1.一种氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的蛋白质。
2.一种编码如权利要求1所述蛋白质的核苷酸。
3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQID N0.2所示。
4.一种制备如权利要求1所述蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一，设计引物，以猪链球菌菌株基因组DNA为模板，采用PCR技术扩增相应的基因片段，片段大小为738bp; 步骤二，采用原核表 达系统，将步骤一所得基因片段构建重组质粒pET-28a(+)-LySS7 ； 步骤三:将步骤二的重组质粒转化到表达载体中，筛选阳性克隆进行蛋白的诱导表达和鉴定，获得重组蛋白LySS7 ； 步骤四:采用平板裂解实验，确定步骤三获得的重组蛋白的裂菌特性； 步骤五:高效诱导表达并纯化具有裂菌活性的重组蛋白，得到具有生物活性的蛋白LySS70
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤一中，所述引物具体为:上游引物的序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物的序列如SEQ ID N0.4所示。
6.一种如权利要求1所述的蛋白在制备革兰氏阳性菌裂解药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述革兰氏阳性菌为多重耐药菌株猪链球菌、马链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌中的一种或几种。
8.一种使用权利要求1所述的蛋白进行裂菌的方法，其特征在于，包括如下步骤:采用常规方法进行裂解； 其中，裂解使用的缓冲液包含PBS缓冲液、CHfOOH-CH3COONa缓冲液、NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、HCl-Tris缓冲液； 缓冲液浓度为10~20mM ； 裂解酸度为PH4.5~8.5 ; 裂解温度为22~42°C。
【文档编号】C12N9/88GK104073478SQ201410265205
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】严亚贤, 黄庆庆, 孙建和, 吉文汇 申请人:上海交通大学