一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌，属蜡样芽胞杆菌，革兰氏阳性，于2014年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号为CCTCCM2014179。该菌株形态特征为：短杆状，长1~1.5μm。该细菌是采用梯度增温分离方法和尼罗蓝染色蓝筛选出来的，由于这种细菌可以耐受60℃的高温，因而可以很方便地通过控制温度进而控制氧浓度，降低生产工艺和设备要求；可以在很简单的发酵设备中，利用高有机质含量的蔗糖、木薯工业废水作为碳源生长和合成PHB，降低设备投入及发酵底物成本；还可以通过提高温度杀死其他非耐高温细菌，从而保证目标菌体单一性，并提高其生物量和所提取的PHB纯度。
【专利说明】一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术，具体是一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌（PHB)。
【背景技术】
[0002] 聚羟基脂肪酸酯（p〇lyhydr〇Xybutyrate，PHB)是一种细胞内聚酯，具有生物降解 性，为生物可降解塑料的新型高分子材料。
[0003] 目前PHB的生产方法有微生物合成和转基因植物合成；转基因植物合成PHB降低 生产成本尚未成功；利用微生物合成PHB的生产成本相对较高，主要是由于高的发酵底物 价格及提取纯化费用。
[0004] 工业上主要采用两步法培养微生物(有氧/富氮和贫氧/贫氮）来获得PHB，控制 氧含量的方法为单纯的氧浓度控制(主要是灌注纯氮）在成本、设备、工艺上要求很高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是要提供一种耐高温、产聚羟基丁酸酯（PHB)多的细菌。
[0006] 本发明一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌，属蜡样芽胞杆菌，革兰氏阳性，于2014 年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国?武汉?武汉大学)， 保藏号为CCTCC NO :M 2014179。该菌株形态特征为：短杆状，长1?1. 5 μ m。
[0007] 本发明耐高温产聚羟基丁酸酯细菌是采用梯度增温分离方法筛选得到的，其筛选 方法包括如下步骤： (1) 采集土壤样品：采集地表以下5cm处的土壤为样品； (2) 样品预处理：取上述土壤样品装入已灭菌并盛装有无菌水的容器中，密封后剧烈震 摇lOmin，静置悬浮液，取上清液离心2min后，取上层菌液为菌悬液，备用； (3) 扩大培养：分别取菌悬液10 μ L接种于250mL LB培养液中，置于37°C恒温箱中培 养震荡72h，得扩大菌种培养液； (4) 逐级梯升温阶筛选：取10 μ L扩大菌种培养液接种于250mL LB培养液中，按温度 逐级递升进行培养，即后一温阶所用接种菌液取自前一温阶培养的菌液； (5) 选定耐高温菌群：在培养温度下，观察接种菌液后的LB培养液，如出现浑浊，则判 定该菌可在此温度下生长，反之则排除； (6) 选定耐高温菌株：取耐50°C以上的菌液，以生理盐水稀释（ΚΓ6)，并均匀涂布于富 氮培养基内，37°C培养48h ;挑取有不同形态特征的单菌落，于37°C富氮培养基上分别扩繁 后，以完全营养液体培养基加20%甘油混匀，于-80°C条件下保存； (7) 采用尼罗蓝染色法，分别取耐50°C以上具不同形态特征的单菌落，接种于LB培养 基培养12h ;步骤（6)的耐高温菌株经适当扩繁后稀释（ΚΓ6)涂布筛选培养基，于30°C条件 下培养36h后，在365nm紫外灯照射下呈橘粉色菌落，即产PHB高的菌株，目标菌株再以富 氮培养基37°C扩繁后，以完全营养液体培养基加20%甘油混匀，于-80°C条件下保存，得耐 高温、产PHB高的菌群。
[0008] 步骤（3)所述的培养震荡的震荡频率为100r/min。
[0009] 所述富氮培养基由酵母浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，葡萄糖20g/L， 硫酸铵5g/L加蒸馈水定容至1L制成。
[0010] 经检测，该耐高温产PHB细菌可以耐受60°C的高温，且产PHB的产率高，，且最适生 长温度为55°C，其合成PHB的最高产率为2. 276g/L，最适生长pH值为7-7. 5。
[0011] 本发明的优点是：由于该耐高温产PHB细菌可以耐受60°C的高温，因而可以很方 便地通过控制温度进而控制氧浓度，降低生产工艺和设备要求；可以在很简单的发酵设备 (如无防杂菌污染装置）中，利用高有机质含量的蔗糖、木薯工业废水作为碳源生长和合成 PHB，降低设备投入及发酵底物成本；还可以通过提高温度杀死其他非耐高温细菌，从而保 证目标菌体单一性，并提高其生物量和所提取的PHB纯度。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为GXNUHT-PHB-1菌落自然光下形态图； 图2为GXNUHT-PHB-1菌落尼罗蓝染色自然光下形态图； 图3为GXNUHT-PHB-1菌落尼罗蓝染色紫外光下形态图； 图4为GXNUHT-PHB-1革兰氏染色显微镜观察图； 图5为基于16S rRNA基因序列以Neighbor-Joining法构建的系统发育树； 图6为GXNUHT-PHB-1胞内PHB的红外光谱图； 图 7 为 GXNUHT-PHB-1 产物的 1H-NMR 图； 图 8 为 GXNUHT-PHB-1 产物的 1C-NMR 图。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但不是对本
【发明内容】
的限定。
[0014] 本发明耐高温产聚羟基丁酸酯细菌是采用梯度增温分离方法筛选得到的，属蜡样 芽胞杆菌，革兰氏阳性，于2014年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)， 保藏号为CCTCC Μ 2014179。该菌株形态特征为：短杆状，长1~1. 5 μ m。
[0015] 实施例： 本发明耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的筛选方法，包括如下步骤： (1) 采集土壤样品： 采样区域：①北方(天津、山东)、②南方(广西、广东）。
[0016] 土壤类型：果园、花园、菜园、田地、山丘、河边、居民区和工业区。
[0017] 样地设置和采样：在各种土壤类型区域划定面积为100 m2的正方形为样地，以对 角线交叉点为圆心的一半对角线长度为半径画圆圈，圆圈与对角线交叉点为采样点。采集 各点地表以下5 cm处土壤为样品，每份样品1千克，每个样地4份样品，共32份； (2) 样品预处理： 分别取10 g样品装入已灭菌并盛有90 mL无菌水的玻璃瓶中，将其编号并密封后，剧 烈震摇10 min。静置悬浮液，待分层后取上层液体离心（4500 r/min，2 min)，取出离心后 的上层菌液备用； (3) 扩大培养：分别取菌悬液10 μ L接种于250 mL LB培养液中，置于37°C恒温箱培 养震荡（100 r/min)培养72 h，获得扩大菌种培养液； (4) 逐级梯升温阶筛选：取10 yL扩大菌种培养液接种于250 mL LB培养液中，按温 度逐级递升（37°C - 4(TC - 45°C - 5(TC - 55°C - 6(TC - 65°C - 7(TC - 75? - 80。〇 进 行培养；其中，后一温阶所用接种菌液取自前一温阶培养的菌液，接种量为10 μ L ; (5) 选定耐高温菌群：若在某培养温度下，接种菌液后的LB培养液出现浑浊，则可判定 该菌可在此温度生长，反之则可排除此编号土壤样品； (6) 选定耐高温菌株：取耐50°C以上菌液以生理盐水稀释（ΚΓ6)并均匀涂布于富氮培 养基内，37°C培养48 h ;挑取有不同外形特征的单菌落，于37°C富氮培养基上分别扩繁后， 以完全营养液体培养基加20%甘油与-80°C保存； (7) 采用尼罗蓝染色法，分别接种耐50°C以上具不同形态特征的单菌落于LB培养基温 度培养12 h;耐高温菌株经适当扩繁后稀释（ΚΓ6)涂布筛选培养基，30°C条件下培养36 h 后，在365 nm紫外灯照射下呈橘粉色菌落为产PHB菌株。目标菌株以富氮培养基37°C扩繁 后，以完全营养液体培养基加20%甘油-80°C保存。
[0018] 本耐热产PHB菌可以在30?60°C条件下，利用富氮培养基：酵母浸粉10g/L，蛋白 胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，加蒸馈水至1000 mL，进行扩繁。
[0019] 经检测：与传统产PHB且最高耐受45°C的细菌相比，本耐热产PHB菌可耐受60°C 高温，具体是： 耐热产PHB菌（1号）16S rRNA基因部分序列（515 bp) GTCGATCTACTGCCTAGGTACAGTACAGGTGCCAGCTTCATCTGCAGATCATAGCACTTGTTCTTCCCTAAC AACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGAT TCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTA CGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAA GCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTC TTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAATCCATTCGCTC GACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTGAGCCATATCCAAAACTCTA Bacillus cereus strain 2012BaDB20 16S ribosomal RNA gene (JX041915. 1) 碱基数1507 基因序列 TAGAGTTTGGATCATGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTA AGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTC CGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTT ATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGA GGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGG ACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACA AGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGTAGGTGGCAAGCAAGATCCGGAATATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAA AGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTG TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGCG CGAAAGCCCAAAAAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGG TTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAG GAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTG ACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCT CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACT CTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTA CACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTT CGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACG TTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTTGG AGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCTAAAAGG 由上可见，16S rRNA 基因序列与 cerews strain 2012BaDB20 16S ribosomal RNA gene (JX041915.1)基因序列同源性为 98%。
[0020] Bacillus sp. ff-21 16S ribosomal RNA gene (AF390088. 1) 碱基数1440 基因序列 AGAGGCGGGGGNGGCGNCCCNTAGAGTTTTGATCATGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACAT GCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTG CCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAA AGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAA CGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA GTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAA CTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTA ACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGT GGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAA GAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCT GGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC GATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTAC GGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTAATTTCGAAGCAAC GCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAG GTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGGAGGGGTAAGTCCCGCAAAGAGCGCAACCNCTTGATCTTA GTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGATGTCAATTAA TCATGCCCCCTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCT AATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCG GATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAC 由上可见，16S rRNA 基因序列与 5/7. W-21 16S ribosomal RNA gene (AF390088. 1)基因序列同源性为98%。
[0021] 本发明GXNUHT-PHB-1产物的傅立叶红外光谱（FT-IR)分析结果表明： 从GXNUHT-PHB-1体内提取的产物纯化后以波数400(T500 cnT1进行扫描（图6)，1723 cnT1处的吸收锋为聚酯的羰基（C=0)特征性吸收峰；29561925(31^1处出现的谱带是饱和 C-H伸缩振动吸收，1057~1277 cnT1处的吸收峰与C-0-C的对称和不对称振动有关。因此， 初步确定该菌合成的产物是一种典型的聚酯类物质。
[0022] 通过对GXNUHT-PHB-1合成产物的1H-NMR和13C-NMR的测定，结果如下图7、8所 示。从1H-NMR谱图看出，分别在1. 2 ppm、2. 5 ppm和5. 2 ppm附近有3HB的CH3、CH和CH 的吸收峰，可以说明该菌合成的产物为PHB。
[0023] 从1C-NMR图看出，在77 ppm附近的吸收峰的化学位移δ是⑶C13产生的， 19. 8484 ppm处有-〇13基团碳原子的吸收峰，40. 8801 ppm处有012基团碳原子的吸收峰， 67. 6977 ppm处有-CH-基团碳原子的吸收峰，169. 2222 ppm处有-C00-基团碳原子的吸收 峰。因此判断该菌合成PHB。 GTCGATCTACTGCCTAGGTACAGTACAGGTGCCAGCTTCATCTGCAGATCATAGCACTTGTTCTTCCCTAAC AACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGAT TCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTA CGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAA GCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTC TTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAATCCATTCGCTC GACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTGAGCCATATCCAAAACTCTA TAGAGTTTGGATCATGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTA AGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTC CGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTT ATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGA GGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGG ACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACA AGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGTAGGTGGCAAGCAAGATCCGGAATATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAA AGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTG TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGCG CGAAAGCCCAAAAAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGG TTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAG GAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTG ACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCT CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACT CTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTA CACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTT CGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACG TTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTTGG AGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCTAAAAGG AGAGGCGGGGGNGGCGNCCCNTAGAGTTTTGATCATGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACAT GCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTG CCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAA AGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAA CGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA GTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAA CTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTA ACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGT GGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAA GAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCT GGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC GATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTAC GGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTAATTTCGAAGCAAC GCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAG GTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGGAGGGGTAAGTCCCGCAAAGAGCGCAACCNCTTGATCTTA GTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGATGTCAATTAA TCATGCCCCCTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCT AATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCG GATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAC
【权利要求】
1. 一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌，CCTCC Μ 2014179。
2. 权利要求1所述耐高温产聚羟基丁酸酯细菌，其特征是：筛选方法包括如下步骤： (1) 采集土壤样品：采集地表以下5cm处的土壤为样品； (2) 样品预处理：取上述土壤样品装入已灭菌并盛装有无菌水的容器中，密封后剧烈震 摇lOmin，静置悬浮液，取上清液离心2min后，取上层菌液为菌悬液，备用； (3) 扩大培养：分别取菌悬液10μ L接种于250mL LB培养液中，置于37°C恒温箱中培 养震荡72h，得扩大菌种培养液； (4) 逐级梯升温阶筛选：取10 μ L扩大菌种培养液接种于250mL LB培养液中，按温度 逐级递升进行培养，即后一温阶所用接种菌液取自前一温阶培养的菌液； (5) 选定耐高温菌群：在培养温度下，观察接种菌液后的LB培养液，如出现浑浊，则判 定该菌可在此温度下生长，反之则排除； (6) 选定耐高温菌株：取耐50°C以上的菌液，以生理盐水稀释（ΚΓ6)，并均匀涂布于富 氮培养基内，37°C培养48h ;挑取有不同形态特征的单菌落，于37°C富氮培养基上分别扩繁 后，以完全营养液体培养基加20%甘油混匀，于-80°C条件下保存； (7) 采用尼罗蓝染色法，分别取耐50°C以上具不同形态特征的单菌落，接种于LB培养 基培养12h ;步骤（6)的耐高温菌株经适当扩繁后稀释（ΚΓ6)涂布筛选培养基，于30°C条件 下培养36h后，在365nm紫外灯照射下呈橘粉色菌落，即产PHB高的菌株，目标菌株再以富 氮培养基37°C扩繁后，以完全营养液体培养基加20%甘油混匀，于-80°C条件下保存，得耐 高温、产PHB高的菌群。
3. 根据权利要求2所述的细菌，其特征是：步骤（3)所述的培养震荡的震荡频率为 100r/min〇
4. 根据权利要求2所述的细菌，其特征是：所述富氮培养基由酵母浸粉10g/L，蛋白胨 10g/L，牛肉浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L加蒸馈水定容至1L制成。
【文档编号】C12N1/20GK104120098SQ201410287511
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年6月25日 优先权日:2014年6月25日
【发明者】陆祖军, 黄爱民, 夏樱花, 李云飞, 江绍锋, 梁士楚 申请人:广西师范大学, 桂林民华科技发展有限公司