一种蝴蝶兰tub基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种蝴蝶兰不同发育时期及不同组织稳定表达的β-tubulin（TUB）基因及其作为内参基因的应用。该基因含有1055个碱基序列，可通过RT-PCR人工合成获得。该基因在蝴蝶兰有关基因的实时定量PCR中作为内参基因使用。发明人进一步通过实验证明，蝴蝶兰TUB基因在不同时期及不同组织中均能稳定表达，说明TUB基因在蝴蝶兰不同发育阶段及不同组织中可以作为内参基因使用。本发明为研究蝴蝶兰其它基因在不同发育阶段及不同组织中的实时定量PCR表达研究奠定了良好的基础。
【专利说明】—种蝴蝶兰TUB基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种蝴蝶兰不同发育时期及不同组织稳定表达的β-tubulin (7Z?)基因及其作为内参基因的应用。
【背景技术】
[0002]蝴蝶兰spp.)又名蝶兰，花型优美，花色鲜艳，花序排列整齐，花期长达3~5个月，因而被誉为“洋兰皇后”，具有很高的观赏价值，也是很多地区年宵花的第一主打产品，近几年在花卉产业中占有越来越重要的地位。随着生物技术在花卉育种中的广泛应用及蝴蝶兰生理代谢分子调控的机理研究，关于蝴蝶兰的各种功能基因的克隆及表达特性逐渐成为人们研究的热点。而在基因表达分析中，定量表达是最为常用的方法，为了控制样品之间和样品内部的差异，通常利用表达稳定的内参基因进行校正和标准化(Suzuki et.al, Control selection for RNA quantitation, Biotechniques, 2000,29(2):332~337),以减少样本之间的误差(Tunbridge et.al, Changed relative to whatHousekeeping genes and normalization strategies in human brain gene expressionstudies, Biological Psychiatry, 2011,69 (2):173~179),因此选择合适的内参基因对数据进行校正是得到可信数据的关键。由于实时定量PCR是基因定量研究的常用方法，是对基因表达的准确定量分析，灵敏度较高，要求内参基因不能因不同的生理状态或不同组织而改变表达水平，以满足试验的严谨性，保证数据的可靠性。
[0003]理想的内参基因应在各种类型的组织、细胞和各种实验因素条件下均能恒定或相对稳定的表达。然而。近年来大量的研究结果表明，任何一种内参基因的所谓恒定表达都是相对的，在一定类型 的细胞或实验因素作用下恒定表达的某个内参基因，在其他类型的细胞中或实验因素作用下可能是变化的。因此，一个内参基因在不同时期、不同组织或不同试验条件下能够持续稳定表达是其可应用的基本前提。而且，同时采用多个内参基因对基因定量表达进行校正和标准化成为科研的趋势和数据统计精确性的基本要求，因此越来越多的内参基因被挖掘，同时需要进行表达稳定性的验证(Vandesompele et.al, Accuratenormalization of realtime quantitative RT-PCR data by geometric averaging ofmultiple internal control genes, Genome Biol.,2002,3:1-11 ； Wan et.al., Selectionof appropriate reference genes for gene expression studies by quantitativereal-time polymerase chain reaction in cucumber, Anal.Biochem, 2010, 399:257~261 ；Jain et.al, Validation of housekeeping genes as internal control for studying geneexpression in rice by quantitative real-time PCR, Biochem Biophy Res.Commun, 2006,345:646~651)。
[0004]微管蛋白(Tubulin)是广泛分布的一类球状蛋白质，是细胞内微管的基本结构单位，参与细胞胞质环流、细胞分裂、分化、物质运输、信号转导、极性建成等重要的生理功能。α -微管蛋白(TUA)和β -微管蛋白(TUB)是微管的两种主要成分，二者以异源二聚体形式存在。近年来，不断有真核生物微管蛋白基因被克隆的报道(闻硕等，小地老虎β_微管蛋白基因cDNA序列的克隆、序列分析和表达检测，昆虫学报，2011，54 (10):1181~1188 ；Snustad et al., The small genome of Arabidopsis contains at least 9 expressedbeta-tubulin genes, Plant Cell, 1992, 4: 549~556),在分子生物学研究中也被用作内参基因(张积森等，斑茅两个看家基因片段的克隆及其在基因芯片中的应用，热带亚热带植物学报，2007,15 (4):277~283)。然而，在实时定量PCR研究方法中，如果不考虑所用内参基因表达的稳定性，盲目地选用内参基因，必定会因其在不同试验条件或不同组织中自身表达的变化，导致实时定量PCR结果的准确性降低，甚至得到相反或错误的结论。例如，拟南芥中有9个7Z?基因，其中，7Z?7只在根中表达，只在叶中表达，只在花粉中表达(Snustad et al., The small genome of Arabidopsis contains at least 9 expressedbeta-tubulin genes, Plant Cell,1992, 4: 549~556 ； Cheng et al., Temporal andspatial expression patterns of TUB9, a beta-tubul in gene of Arabidopsis thaliana,Plant Mol Biol,2001,47:389~398);水稻的7Z/M只在花粉中表达，其它的TM基因在发育中具有不同的表达水平(Yoshikawa et al.， Expression analyses of beta-tubul inisotype genes in rice, Plant Cell Physiol, 2003,44:1202~1207),这些 TM?基因就不适合作为内参基因用于拟南芥和水稻其它基因定量表达的研究。
[0005]蝴蝶兰有关基因表达的研究中，常采用肌动蛋白基因作为内参基因，关于而蝴蝶兰TUB基因的克隆及表达的稳定性检测尚未见到有关报道。
【发明内容】
[0006]本发明目的是提供一种适于蝴蝶兰有关基因实时定量PCR研究中使用的内参基因 β -tubulin (TUB)0
[0007]本发明所采取 的技术方案如下:
一种蝴蝶兰卢(TUB)基因，其碱基序列如序列表所示，共含有1055个碱基序列。
[0008]所述蝴蝶兰β -tubulin {TUB)基因，通过RT-PCR人工合成获得。
[0009]所述蝴蝶兰β -tubulin (TUB)基因在蝴蝶兰有关基因的实时定量PCR中作为内参基因使用。
[0010]现有技术中，关于蝴蝶兰有关基因表达的研究中，常采用肌动蛋白基因UCTJ#)作为内参基因，单一的内参基因的使用存在无法满足各种情况下基因表达研究需要的缺陷。本发明所请求保护的蝴蝶兰基因β-tubulin (7Z?)，丰富了蝴蝶兰有关基因表达研究中关于内参基因使用的范围。为证明蝴蝶兰TM?基因适于作为内参基因使用，发明人进一步通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术在蝴蝶兰在生长发育的幼苗期、成苗期、盛花期和花后期四个阶段的根、叶片、花梗、萼片、花瓣、蕊柱、子房等16种组织中进行检测，显示蝴蝶兰TM?基因在其不同时期及不同组织中均能稳定表达，说明TM?基因在蝴蝶兰不同发育阶段及不同组织中可以作为内参基因使用。因而本发明为研究蝴蝶兰其它基因在不同发育阶段及不同组织中的实时定量PCR表达研究奠定了良好的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1蝴蝶兰TUB基因实时荧光定量PCR的标准曲线；图2蝴蝶兰TUB基因实时荧光定量PCR的溶解曲线；
图3蝴蝶兰TUB在不同发育阶段不同组织中实时荧光定量PCR的荧光阈值；
图4蝴蝶兰TUB在不同发育阶段不同组织中的表达情况；
图5蝴蝶兰TUB作为内参基因在蝴蝶兰基因定量表达研究中的应用。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明，以便于本领域技术人员理解和实施本发明。
[0013]实施例1
蝴蝶兰卢(TUB)基因，其碱基序列如序列表(SEQUENCE LISTING)所示，共含有1055个碱基序列，即:
ATGAGAGAGATCCTTCACATCCAGGGTGGGCAATGTGGCAACCAGATCGGGGCGAAGTTCTGGGAGGTGATC
TGTGACGAGCACGGGATCGATCACACCGGTAAGTACAGTGGAGACTCCGAACTTCAACTCGAGCGGATCAACGTCTA
CTACAATGAGGCGAGCGGGGGAAGGTATGTTCCTAGGGCCGTGCTTATGGATCTGGAACCCGGGACGATGGATTCGG
TTAGATCGGGTCCGTTTGGG CAGATCTTTCGTCCGGATAATTTTGTCTTTGGACAGTCGGGTGCGGGGAATAACTGG
GCGAAGGGACACTATACCGAGGGTGCTGAACTCATTGATTCTGTGCTGGATGTGGTGAGGAAGGAGGCGGAGAACTG
CGATTGCTTGCAAGGATTCCAAGTATGCCATTCTTTGGGTGGAGGAACAGGATCTGGCATGGGCACCCTGCTCATTT
CGAAGATCAGAGAGGAGTACCCCGACCGGATGATGCTGACATTCTCAGTTTTCCCATCGCCTAAGGTCTCGGATACT
GTTGTGGAGCCATACAATGCTACTCTGTCAGTTCACCAGCTTGTTGAGAATGCCGACGAGTGCATGGTTCTCGATAA
TGAGGCTCTTTACGATATTTGTTTCCGCACTCTCAAGCTCGCCACCCCTACATTTGGCGATCTGAATCACCTCATAT
CTGCCACCATGAGCGGCGTCACGTGCTGCCTGCGCTTCCCTGGACAGCTAAATTCCGACCTCCGGAAGCTCGCCGTC
AACCTCATTCCTTTCCCTCGCCTCCATTTCTTCATGGTCGGCTTTGCTCCCCTAACATCCCGTGGATCCCAACAATA
CCGTGCCCTCACCGTCCCGGAGTTGACTCAACAGATGTGGGATTCCAAAAACATGATGTGCGCTGCCGATCCCCGCC
ATGGCCGTTACCTCACCGCCTCGGCCATGTTCCGCGGAAAAATGAGCACTAAAGAGGTAGATGAGCAAATGATCAAC
GTTCAGAACAAGAATTCGTCCTATTTCGTGGAGTGGATACCCAACAACGTGAAGTCCAGo
[0014]所述蝴蝶兰β -tubulin {TUB)基因，通过RT-PCR人工合成获得，即:通过设计简并引物，利用RT-PCR扩增获得目的片段，然后将目的片段连接到T载体上进行测序获得蝴蝶兰的TUB基因序列。为便于本领域技术人员具体实施本发明，对于TUB的RT-PCR人工合成步骤简要说明如下。
[0015]、简并引物设计
利用DNAMAN软件分别进行同源序列的多序列比对，再利用primer5.0软件在多序列的保守区域设计I对简并引物用于蝴蝶兰TM?基因片段序列的扩增及测序，简并引物序列如下所示:
TUB-F:5’ - ATGAGRGAGATCCTBCACATC -3’ ；
TUB-R:5’ - CTGGACTTSACRTTGTTSGG -3’。
[0016]、蝴蝶兰TUB基因片段序列的扩增及测序
以常见蝴蝶兰栽培品种“聚宝红玫瑰”为实验材料，具体步骤如下:
(I)制备CDNA模板
A.取大约I克盛花期的叶片，在液氮中充分研磨，将研磨粉末放入1.5mL离心管中，加Λ I mL Trizol试剂(Invitrogen公司),充分振荡混匀，室温放置5~8分钟,在4°C条件下12000转/分离心10~15分钟，吸取上清液；
B.取步骤A上清液1.5 mL于离心管中，加入0.2~0.3mL氯仿，充分振荡混匀30~60秒，室温放置5~10分钟，在4°C条件下12000转/分离心15分钟，吸取上清液；
C.取步骤B上清液1.5 mL于离心管中，再次加入0.2~0.3 mL氯仿，充分振荡30秒~60秒，室温放置5~10分钟，在4°C条件下12000转/分离心10~15分钟，吸取上清液；
D.取步骤C上清液1.5 mL于离心管中，加入等体积异丙醇轻轻混匀，室温放置10~15分钟，在4°C条件下12000转/分离心15~20分钟，弃上清液；
E.将步骤D所得沉淀加入0.8~I mL 75%的乙醇，在4°C条件下12000转/分离心10-15分钟，弃上清液，如此重复3次；
F.将步骤E所得沉淀置于超净工作台10~15分钟，根据管内RNA沉淀多少加入20~50 μ L RNAaseFree水(TaKaRa公司)，然后50~60°C水浴5~10分钟，使RNA充分溶解；
G.取步骤F中溶解后Iμ L总RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳判断总RNA的质量，以28S: 18S约为2为合格；提取的叶片总RNA放于_80°C冰箱备用；
H.米用ReverseTranscriptase M-MLV试剂(TaKaRa公司)将叶片总RNA反转录成单链cDNA，放于-20°C冰箱备用。
[0017](2) RT-PCR扩增及测序
以步骤(1)制备的cDNA为模板，利用步骤I中的简并引物进行RT-PCR扩增。具体如下。
[0018]PCR 扩增体系为 20 μ L，其中:10 Xbuffer 2 μ L，TaqDNA 聚合酶 IU (TaKaRa 公司)
0.2 μ L，4 种 dNTP (TaKaRa 公司)各 150 ymol/L 共 1.6 μ L，每条引物 0.5ymol/L I μ L，两条引物共2 μ L，cDNA模板1000~2000ng I μ L，其余为ddH20。
[0019]PCR扩增程序为:95°C变性3~5分钟；95°C 40秒，56~60°C 40秒，72°C 40~60秒，35个循环；72°C延伸10分钟。
[0020]对特异扩增片段进行切胶回收纯化。回收片段连接到PMD19-T载体上(TaKaRa公司)，转入大肠杆菌DH5ci菌株(TaKaRa公司)，筛选鉴定并由上海英骏生物技术公司进行阳性克隆测序。获得I个内参基因的序列，长度在1055 bp。将该序列编码的氨基酸序列提交到蛋白数据库中比对，该氨基酸序列属于微管蛋白超家族，包含微管蛋白功能域，具有β_微管蛋白的特异位点，说明该序列为目的基因序列。
[0021]实施例2
为检验本发明所请求保护的蝴蝶兰基因卢(TUB)是否适于作为内参基因使用，发明人以常见蝴蝶兰栽培品种“聚宝红玫瑰”为实验材料，对其在生长发育的幼苗期、成苗期、盛花期和花后期四个阶段的根、叶片、花梗、萼片、花瓣、蕊柱、子房等16种组织中的表达情况进行了检测，证明了蝴蝶兰TM?基因在不同时期及不同组织中均能稳定表达，适于作为内参基因使用，具体检测过程简述如下。
[0022](I)设计引物
根据蝴蝶兰TUB序列，利用DNAMAN和primer5.0软件，设计TUB序列的特异qRT-PCR定量引物如下:
RT-TUB-F: 5’- GCCTAAGGTCTCGGATACTGTT-3’ ；RT-TUB-R: 5’ - GCTCATGGTGGCAGATATGA -3’。
[0023](2)提取制备不同生长时期不同组织的cDNA模板
选取实验材料幼苗期的根和叶片，成苗期的根、叶片和茎，盛花期的根、叶片、花梗、萼片、花瓣、唇瓣、子房、蕊柱，花后期的根、叶片和花梗等16种组织作为实验材料，以实施例1中的方法提取16种组织的总RNA, 16种组织的总RNA采用PrimeScriptRT reagent Kit withgDNAEraser试剂(TaKaRa公司)反转录成单链cDNA，将cDNA稀释3~5倍放于_20°C冰箱备用。
[0024](3)荧光定量PCR检测
采用SYBR Premix Ex TaqTM II kit (TaKaRa公司)，反应体系为25 μ L,以稀释的16种组织的cDNA为模板，采用步骤(1)中设计的引物，进行荧光定量PCR检测。
[0025]反应条件为:95V 30s, 95 V 15 s、58°C 15s、72°C 15s (40 个循环)。
[0026]qRT-PCR 反应在 Eppendorf 实时突光定量 PCR 仪(德国，Mastercycler eprealplex)上进行， 3次重复。
[0027]如图1所示，试验得到标准曲线y=_3.328χ+19.45。根据标准曲线，扩增效率为1.02，R~2为99.8%。如图2所示，溶解曲线为单峰，溶解温度为84°C，表明定量引物具有特异性。如图3所示，其荧光阈值(Ct)平均在22.08~24.77之间，获得的荧光阈值(Ct值)可靠有效，可以作为内参基因应用于蝴蝶兰发育阶段不同组织其它基因研究的实时荧光定量PCR研究。
[0028]为了进一步检测TM序列的可靠性，利用TUA实时荧光定量PCR特异引物，以苗期叶片的cDNA为模板，2(^1^体系，进行？0?。反应条件为:95 V 30 S，95 V 15 s、60°C 15 s、72°C 15 8，30个循环，721: 5 min，凝胶回收扩增片段，连接于pMD19_T克隆载体上(TaKaRa公司)，并热激转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(TaKaRa公司)中测序，测序由上海英骏生物技术公司完成，结果表明目的片段为TUB基因特异片段。
[0029]为了进一步检测TUB表达的稳定性，以16种组织的cDNA为模板，20 μ L体系，进行PCR0 反应条件为:95 0C 30 S，95 °C 15 s、60°C 15 s、72°C 15 s，28 个循环，72°C 5min，并用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。结果如图4所示，TMM乍为内参基因在16种组织中亮度基本一致，表明在16种组织中稳定表达，可用于蝴蝶兰不同发育时期不同组织基因的定量表达分析。
[0030]实施例3
为了证明本发明所提供的TM?基因作为内参基因的使用效果，发明人以实施例1所制备的蝴蝶兰基因作为内参基因对蝴蝶兰基因的实时定量PCR做了应用示范，具体情况简述如下。
[0031]为了研究蝴蝶兰MADS-box基因的表达特性，以蝴蝶兰盛花期的根、叶、花器官组织的萼片、花瓣、唇瓣、子房、蕊柱等为材料。
[0032]根据蝴蝶兰的序列(NCBI登录号JQ065097)设计荧光定量引物为:
F: 5’ - TGTCGCTCTCATCATTTTTTCG -3 ；
R: 5’- GCTTTCAACCTTTGCCTTCA-3’。
[0033]以7Ζ?为内参基因进行实时荧光定量PCR。
[0034]目的基因相对表达量Rel.Exp = 2_Δ ，其中Λ Ct =Ct (目的基因)一 Ct (内参基因)，
Δ Δ Ct =(各植物组织Λ Ct) —(盛花期根Λ Ct)。
[0035]如图5所示，结果表明，基因在花梗中表达量最高，在叶中次之，在根及花器官中有少量表达。
[0036]需要说明的是，上述实施例中未能详细说明的实验方法，按照现有技术常规操作即可，具体可参考《精编分子生物学实验指南》(F.M奥斯伯，R.E金斯顿，J.G塞德曼主编，马学军，舒跃龙译 ，北京:科学出版社，2004)中所述的方法进行。
【权利要求】
1.一种蝴蝶兰基因TM?基因，其特征在于，该基因喊基序列如序列表所不，共含有1055个碱基序列。
2.权利要求1所述蝴蝶兰基因基因，其特在于，该基因通过RT-PCR人工合成获得。
3.权利要求1所述蝴蝶兰基因TUB基因在蝴蝶兰有关基因的实时定量PCR中的应用，其特征在于， 该基因作为内参基因使用。
【文档编号】C12N15/29GK104017811SQ201410303519
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】崔波, 田云芳, 邓祖丽颖, 雷志华, 马杰 申请人:郑州师范学院