一种去除pcv2病毒中支原体污染的方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，旨在提供一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法。该种去除PCV2病毒中支原体污染的方法包括步骤：0.1μm滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代，PCV2病毒用终浓度2.5μg/ml的Plasmocin处理两代，常规繁殖PCV2两代。本发明采用先过滤再用抗生素的方法，不仅节省了实验成本，更为重要的是抗生素使用次数少，浓度小，去除支原体时间短，整个处理过程仅需8代，约16～20天可完成，且不会使PCV2病毒效价降低，可为疫苗生产提供无支原体且病毒效价高的PCV2病毒，并为单位体积内疫苗半成品病毒含量的提高提供了保障。
【专利说明】一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法。
【背景技术】
[0002]猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属于圆环病毒科，圆环病毒属，无囊膜，由单股、共价的闭合环状DNA组成，病毒粒子直径约17nm，呈二十面体对称，是目前发现的最小的一种脊椎动物病毒。该病毒可分为两种血清型，即PCVl和PCV2。其中PCVl对猪无致病性，广泛存在于猪体内和猪源传代细胞系中，PCV2可在猪群内引发多种传染病，如断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)等。PCV2不仅可造成仔猪生长缓慢，还会侵害猪的免疫系统，导致猪群免疫抑制，直接引起其他传染病免疫的失败，并引发其他病原的继发感染。PCVl基因组全长1759bp，PCV2为1767bp或1768bp，共包括ORFl和0RF2在内的11个开放阅读框。目前已证实，PCV2的ORFl编码与病毒复制有关的蛋白(Itep蛋白)，0RF2编码病毒衣壳蛋白(Cap蛋白)，Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白，是刺激机体产生免疫应答的主要抗原，成为该病在流行病学诊断和疫苗研究中的热点。
[0003]我国自2000年首次报道猪群中存在PCV2感染，之后在全国各地陆续有报道，呈逐渐蔓延趋势。流行病学调查显示，目前我国猪群中PCV2阳性率高达80%，且PCV2的基因组也在不断发生变化，PCV2b基因型已取代PCV2a基因型，成为当前流行的优势基因型毒株，猪群中PCV2的发生率和严重程度也高于以前，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。
[0004]疫苗免疫接种被认为是防控PCV2的有效手段，商品化疫苗的推广应用为有效防控PCV2疫情发挥了重要作用。目前针对该病的国内外商品化疫苗主要为全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗和嵌合病毒疫苗，其中全病毒灭活疫苗使用得较为广泛。
[0005]无论是哪种类型的疫苗，获得纯净的病毒都是疫苗研究与生产的前提。但实际采集病料的场所通常不能保证无菌，或在后续实验中，由于实验器材或者操作者本身及环境带来污染，甚至可能是用已经污染支原体的细胞来培养病毒，会直接或间接造成病毒污染支原体。对于PCV2病毒繁殖来说，支原体的污染不仅干扰了病毒的增殖，降低病毒产量，还会使培养的细胞遭受污染，从而使研究结果的真实性和可靠性大大降低。
[0006]支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3~0.5 μ m之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。支原体约有I %可通过滤菌器，用普通染色法不易着色，因此在普通光学显微镜下不易被发现。
[0007]商品化的支原体抗生素Plasmocin主要用于治疗或预防细胞培养中支原体污染。Plasmocin含有两种杀菌成分，可以强效对抗支原体及相关的无胞壁的细菌。它的显著效果主要是其含有两种独特的抗菌成分，一种成分通过干扰核糖体的翻译功能而使蛋白合成受阻，另一种成分则通过干扰复制叉的形成而阻止DNA的复制，而这两种成分的靶分子只存在于支原体和许多其他细菌中而并不存在于真核细胞中。
[0008]使用推荐浓度5倍的高浓度Plasmocin处理细胞，虽未观察到药物对细胞新陈代谢的副作用，但据此项试验检测，若在繁殖PCV2的过程中，细胞培养液中反复加入Plasmocin,则会使PCV2病毒效价降低。
[0009]PCV2大小17nm，0.1 μ m滤菌器过滤不会影响其毒价，而支原体直径一般在0.3~
0.5 μ m之间，由于其具有多形性，0.1 μ m滤菌器过滤后，不能彻底截留支原体，残留少量的支原体可用Plasmocin清除。所以单使用上述任何一种方法都不能保证彻底清除支原体的同时保证PCV2病毒效价不降低。
【发明内容】
[0010]本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种联合0.1 μ m滤菌器和Plasmocin两种方法去除PCV2中污染的支原体。为解决上述技术问题，本发明的解决方案是:
[0011]提供一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法，具体步骤包括:
[0012](1)0.1 μ m滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代；
[0013](2)PCV2病毒用终浓度2.5 μ g/ml的Plasmocin处理两代；
[0014](3)常规繁殖PCV2两代；
[0015]所述步骤(1)具体包括下述步骤:
[0016]A、用含 5% 胎牛血清(PAA, A10209-1611)的 MEM 培养基(GIBC0, 574131)培养PK-15细胞，细胞密度为2X 15个/ml，将PCV2病毒用0.1 μ m滤菌器过滤后，向MEM培养基中接种PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为MEM培养基体积的I %，然后将装有接种PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中，培养72h ；
[0017]B、将步骤A培养后的细胞瓶，进行冻融操作:将细胞瓶置于温度为_70°C的冰箱中冷冻12h，然后再取出细胞瓶置于常温(15~25°C )中融化；
[0018]C、再将细胞瓶进行步骤B的冻融操作两次，即共反复三次冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；
[0019]D、将步骤A中的PCV2病毒替换成步骤C中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，再依次重复步骤A、步骤B、步骤C的处理3次，即制得PCV2病毒；
[0020]所述步骤(2)具体包括下述步骤:
[0021]E、用含5%胎牛血清的MEM培养基培养PK-15细胞，细胞密度2X 15个/ml，再向MEM培养基中接种步骤(1)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为MEM培养基体积的I %，并向 MEM 培养基中加入 Plasmocin(Invivogen, MPT-34-01B),使 Plasmocin 的终浓度为2.5 μ g/ml，然后将装有接种了 PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37°C、CO2浓度为5%的培养箱中，培养72~96h ;细胞铺满后，将细胞瓶反复进行3次步骤B中的冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；
[0022]F、将步骤E中的PCV2病毒替换成步骤E中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，重复一次步骤E的操作，繁殖一代PCV2病毒；
[0023]所述步骤(3)具体包括下述步骤:
[0024] G、用含5%胎牛血清的MEM培养基培养PK-15细胞，细胞密度2X 15个/ml，再向MEM培养基中接种步骤(2)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为MEM培养基体积的I %，然后将装有接种了 PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中，培养72h ;将培养后的细胞瓶取出后，反复进行3次步骤B中的冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；
[0025]H、将步骤G中的PCV2病毒替换成步骤G中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，重复一次步骤G的操作，继续繁殖一代PCV2病毒，即制得所需的PCV2病毒。
[0026]为检测制得的PCV2病毒中支原体的去除情况，对制备得到的PCV2病毒进行支原体鉴定，具体方法为:参考猪支原体基因序列，Genbank登录号NR-103095.1，采用DNAMAN软件设计两对上下游引物:P1:AAGTCGTAACAACCTATCCCTA, P2:GTGTCTGGTTAGTATTTAGCCTTA ；P3:GCAAGTCGATGAAGGACG, P4:GCTTCGCTCGCCACTACT,采用套式 PCR 法，以步骤 H 中制得的PCV2病毒为样品模板，并设灭菌双蒸水为阴性对照，猪滑液囊支原体为阳性对照，先用Pl和P2引物进行PCR扩增，将其扩增产物作为PCR反应模板，再用P3和P4引物扩增目的基因片段，将第二次PCR扩增的产物，用I %琼脂糖凝胶电泳检测支原体。
[0027]为进一步检测制得的PCV2病毒经处理后，其病毒效价是否受到影响，采用IFA法，即间接免疫荧光法 ，对制备得到的PCV2病毒进行TCID5tl测定，具体方法为:
[0028]先将PK-15细胞用MEM培养基稀释成密度为2 X 15个/ml的细胞悬液，细胞悬液加入到96孔细胞培养板中，100 μ I/孔，再将步骤H中繁殖得到的PCV2病毒10倍系列梯度稀释，选择10_2、10' 10' 10_5、10_6、10_7这6个梯度，100 μ I/孔加到细胞悬液中，每个梯度重复6个孔，同时设MEM培养液作阴性对照、107_3TCID5ciAil的PCV2病毒作阳性对照，阴性、阳性对照各I孔，然后将细胞培养板置于温度为37°C、5%浓度CO2的培养箱中，培养72h ；
[0029]培养结束后，取出细胞培养板并弃掉细胞培养板中的液体，每孔加入100 μ I冷的甲醇-丙酮固定液(甲醇和丙酮体积比1:1配制)，然后在温度为-20°C的冰箱固定30分钟，弃固定液，再用pH为7.4的PBST洗涤I次细胞培养板后甩干；
[0030]将鼠源Cap蛋白单克隆抗体用PBS进行1:2000倍稀释得到鼠源Cap蛋白单克隆抗体稀释液，将鼠源Cap蛋白单克隆抗体稀释液按100μ I/孔加入到甩干的细胞培养板中，然后将细胞培养板在37°C下摇床孵育60分钟，弃细胞培养板中液体，再用pH为7.4的PBST洗涤3次细胞培养板后甩干；
[0031]将FITC-羊抗鼠二抗用PBS进行1:200倍稀释得到FITC-羊抗鼠二抗稀释液，将FITC-羊抗鼠二抗稀释液按100μ I/孔加入到甩干的细胞培养板中，锡箔纸包裹细胞培养板避光，然后将细胞培养板在37°C下摇床孵育60分钟，弃细胞培养板中液体，再用pH为
7.4的PBST洗涤3次细胞培养板后甩干；
[0032]将甩干的细胞培养板于倒置荧光显微镜下观察，按Reed和Muench法计算PCV2病毒的效价。
[0033]本发明的工作原理:联合0.1 μ m的滤菌器和Plasmocin两种方法去除PCV2中污染的支原体，先用0.1 μ m的滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代，每次接种PCV2病毒前均过滤一次，再用终浓度2.5 μ g/ml的Plasmocin处理PCV2病毒两代，为彻底消除Plasmocin对病毒繁殖的影响，再常规繁殖两代PCV2，最终快速、彻底清除了 PCV2中污染的支原体，且PCV2的病毒效价仍可维持在107 3TCID50/ml以上。
[0034]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0035]采用先过滤再用抗生素的方法，不仅节省了实验成本，更为重要的是抗生素使用次数少，浓度小，去除支原体时间短，整个处理过程仅需8代，约16~20天可完成，且不会使PCV2病毒效价降低，可为疫苗生产提供无支原体且病毒效价高的PCV2病毒，并为单位体积内疫苗半成品病毒含量的提高提供了保障。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1为1%琼脂糖凝胶电泳检测样品中支原体结果图。
[0037]图2为试验组样品、阳性对照、阴性对照IFA检测TCID5tl测定结果图。
【具体实施方式】
[0038]下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述:
[0039]本发明提供的一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法，具体步骤包括:
[0040](I) 0.1um滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代；
[0041](2)PCV2病毒用终浓度2.5 μ g/ml的Plasmocin处理两代；
[0042](3)常规繁殖PCV2两代。
[0043]所述步骤(1)具体包括下述步骤:
[0044]A、用含 5% 胎牛血清(PAA, A10209-1611)的 MEM 培养基(GIBC0, 574131)培养PK-15细胞，细胞密度为2X 15个/ml，将PCV2病毒用0.1 μ m滤菌器过滤后，向MEM培养基中接种PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为MEM培养基体积的I %，然后将装有接种PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37°C、CO2浓度为5%的培养箱中，培养72h ；
[0045]B、将步骤A培养后的细胞瓶，进行冻融操作:将细胞瓶置于温度为_70°C的冰箱中冷冻12h，然后再取出细胞瓶置于常温(15~25°C )中融化；
[0046]C、再将细胞瓶进行步骤B的冻融操作两次，即共反复三次冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；
[0047]D、将步骤A中的PCV2病毒替换成步骤C中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，再依次重复步骤A、步骤B、步骤C的处理3次，即制得PCV2病毒。
[0048]所述步骤(2)具体包括下述步骤:
[0049]E、用含5%胎牛血清的MEM培养基培养PK-15细胞，细胞密度2X 15个/ml，再向MEM培养基中接种步骤(1)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为MEM培养基体积的I %，并向 MEM 培养基中加入 Plasmocin(Invivogen, MPT-34-01B),使 Plasmocin 的终浓度为2.5 μ g/ml，然后将装有接种了 PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37°C、CO2浓度为5%的培养箱中，培养72~96h ;细胞铺满后，将细胞瓶反复进行3次步骤B中的冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；
[0050]F、将步骤E中的PCV2病毒替换成步骤E中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，重复一次步骤E的操作，繁殖一代PCV2病毒。
[0051]所述步骤(3)具体包括下述步骤:
[0052]G、用含5%胎牛血清的MEM培养基培养PK-15细胞，细胞密度2X 15个/ml，再向MEM培养基中接种步骤(2)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为MEM培养基体积的I %，然后将装有接种了 PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中，培养72h ;将培养后的细胞瓶取出后，反复进行3次步骤B中的冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；
[0053]H、将步骤G中的PCV2病毒替换成步骤G中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，重复一次步骤G的操作，继续繁殖一代PCV2病毒，即制得所需的PCV2病毒。
[0054]为检测PCV2病毒中支原体的去除情况，对制备得到的PCV2病毒进行支原体鉴定，具体方法为:参考猪支原体基因序列，Genbank登录号NR-103095.1，用DNAMAN软件设计两对上下游引物 Pl:AAGTCGTAACAACCTATCCCTA, P2:GTGTCTGGTTAGTATTTAGCCTTA ；P3:GCAAGTCGATGAAGGACG, P4:GCTTCGCTCGCCACTACT,采用套式 PCR 法，以步骤 H 中制得的 PCV2病毒为模板，灭菌双蒸水为阴性对照，猪滑液囊支原体为阳性对照，先用Pl和P2引物进行PCR扩增，将其扩增产物作为模板，再用P3和P4引物扩增基因片段，将第二次PCR扩增的产物，用I %琼脂糖凝胶电泳检测支原体。
[0055]为进一步检测PCV2病毒经处理后，其病毒效价是否受到影响，采用IFA法，即间接免疫荧光法，对制备得到的PCV2病毒进行TCID5tl测定，具体方法为:
[0056]先将PK-15细胞用MEM培养基稀释成密度为2 X 15个/ml的细胞悬液，细胞悬液加入到96孔细胞培养板中，100 μ I/孔，再将步骤H繁殖得到的PCV2病毒10倍系列梯度稀释，选择10_2、10' 10' 10_5、10_6、10_7这6个梯度，100 μ I/孔加到细胞悬液中，每个梯度重复6个孔，同时分别设MEM培养基作阴性对照，107_ 3TCID5tZml的PCV2病毒作阳性对照，阴性、阳性对照各I孔，然后将细胞培养板置于温度为37°C、5%浓度CO2的培养箱中，培养72h ；
[0057]培养结束后，取出细胞培养板并弃掉细胞培养板中的液体，加入冷的甲醇-丙酮固定液(按甲醇和丙酮体积比1:1配制)，100 μ I/孔，然后在-20°c冰箱固定30分钟，弃固定液，再用pH为7.4的PBST洗涤I次细胞培养板，将细胞培养板甩干；
[0058]将鼠源Cap蛋白单克隆抗体用PBS进行1:2000倍稀释得到鼠源Cap蛋白单克隆抗体稀释液，将鼠源Cap蛋白单克隆抗体稀释液按100 μ I/孔加入到甩干的细胞培养板中，然后将细胞培养板在37°C下摇床孵育60分钟，弃细胞培养板中的液体，再用pH为7.4的PBST洗涤3次细胞培养板后甩干；
[0059]将FITC-羊抗鼠二抗用PBS进行1:200倍稀释得到FITC-羊抗鼠二抗稀释液，将FITC-羊抗鼠二抗稀释液按100μ I/孔加入到甩干的细胞培养板中，锡箔纸包裹细胞培养吧避光，然后将细胞培养板在37°C下摇床孵育60分钟，弃细胞培养板中的液体，再用pH为
7.4的PBST洗涤3次细胞培养板后甩干；
[0060]将甩干的细胞培养板于倒置荧光显微镜下观察，按Reed和Muench法计算PCV2病毒的效价。
[0061]下面的实施例可以使本专业的专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0062](1) 0.1um滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代
[0063]用含5%胎牛血清的MEM培养PK-15细胞，细胞密度2X 15个/ml，将PCV2病毒用0.1 μ m滤菌器过滤后，向MEM培养基中接种PCV2病毒，使PCV2病毒的接种量为MEM培养基体积的1%，将接种PCV2的细胞瓶置于温度为37°C、CO2浓度为5%的培养箱中，培养72h ；
[0064]将培养后的细胞瓶取出，置于温度为-70°C的冰箱中冷冻12h，再将细胞瓶常温(15~25°C )中融化，再将细胞瓶进行两次冻融操作，即共反复三次冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；
[0065]然后，将冻融好的PCV2病毒悬液作为接种种毒，采用步骤(1)中的方法处理3次，制得PCV2病毒；
[0066](2)PCV2病毒用终浓度2.5 μ g/ml的Plasmocin处理两代
[0067]用含5%胎牛血清的MEM培养PK-15细胞，细胞密度2X 15个/ml，向MEM培养基中接种步骤⑴中制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为与MEM培养基体积的I %，并加入终浓度2.5 μ g/ml的Plasmocin，将接种PCV2的细胞瓶置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中培养，72~96h细胞铺满后，将细胞瓶按照步骤(1)的冻融操作，反复3次冻融，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液。
[0068]然后，将冻融好的PCV2病毒悬液作为接种病毒，再重复一次步骤(2)中的操作，制得PCV2病毒。
[0069](3)常规繁殖PCV2两代
[0070]用含5 %胎牛血清的MEM培养基培养PK-15细胞，细胞密度2 X 15个/ml，再向MEM培养基中接种步骤(2)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为MEM培养基体积的I %，然后将接种PCV2病毒的细胞瓶，置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中，培养72h ;将细胞瓶反复进行3次冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；
[0071]将冻融好的PCV2病毒悬液作为接种病毒，重复一次步骤(3)的操作，继续繁殖一代PCV2病毒，即制得所需的PCV2病毒。
[0072](4)支原体鉴定
[0073]为鉴定PCV2经处理后支原体的去除情况，用套式PCR法鉴定PCV2中的支原体，将步骤(3)中冻融好的PCV2病毒悬液为样品，将样品在沸水中煮沸5分钟，然后8000rpm离心10分钟，取上清作为PCR反应模板，并设猪滑液囊支原体作阳性对照，灭菌双蒸水作阴性对照，按下述方法进行PCR扩增。
[0074]第一次循环:
[0075]扩增上游引物Pl:AAGTCGTAACAACCTATCCCTA
[0076]下游引物P2:GTGTCTGGTTAGTATTTAGCCTTA
[0077]扩增体系:在PCR小管内依次加入=1XPCR buffer3 μ I,上游引物I μ 1，下游引物I μ I, dNTP2 μ I, TaqEl μ I,模板I μ I，补足灭菌双蒸水至30 μ I。
[0078]反应程序:
[0079]第一步94°C预变性3分钟，94°C变性I分钟，56°C退火I分钟，68 °C延伸I分钟，共30个循环；68°C延伸10分钟。
[0080]将第一次循环的PCR产物，取I μ I作为模板，进行第二次PCR循环，反应扩增体系中各成分加入量与第一次循环相同。
[0081]第二次循环:
[0082]扩增上游引物Ρ3:GCAAGTCGATGAAGGACG
[0083]下游引物P4: GCTTCGCTCGCCACTACT
[0084]反应程序94 °C预变性3分钟，94 V变性I分钟，58 V退火30秒，68 °C延伸30秒，共30个循环；68°C延伸10分钟。
[0085]核酸电泳检测:用I %的琼脂糖凝胶电泳检测第二次PCR扩增的产物，结果出现预期大小22Ibp的目的条带。
[0086]具体可参考图1的电泳检测样品中支原体结果图，图中由左至右的5条光带，依次是指:1、处理的PCV2 ;2、未处理的PCV2 ;3、阴性对照；4、阳性对照；5、Marker (2000bp)。
[0087](5)PCV2TCID5Q 测定
[0088]先用MEM培养基将PK-15细胞稀释成密度为2 X 105/ml的细胞悬液，将细胞悬液100 μ I/孔加入96孔细胞板中，再将步骤(3)中冻融好的PCV2病毒悬液10倍系列梯度稀释，选择10' 10' 10_4、10_5、10' 10_7这6个梯度，100 μ I/孔加入到细胞悬液中，每个梯度重复6个孔，同时设MEM作阴性对照、107_3TCID5ciAil的PCV2病毒作阳性对照，阴性、阳性对照各I孔。37°C 5%浓度的CO2培养箱中培养72h。弃掉细胞培养板中的液体，每孔加入100 μ I冷的甲醇-丙酮固定液(按甲醇与丙酮体积比1:1配制)，_20°C冰箱固定30分钟，弃固定液，用PH7.4的PBST洗I次，自然晾干。将鼠源Cap蛋白单克隆抗体用PBS进行1:2000倍稀释，稀释后的鼠源Cap蛋白单克隆抗体按100 μ I/孔加入到晾干的培养板中，于37°C下摇床孵育60分钟。弃培养板中液体，PBST洗涤3次后甩干。FITC-羊抗鼠二抗用PBS1:200稀释后，稀释后的FITC-羊抗鼠二抗按100 μ I/孔加入上述甩干的细胞板中，锡箔纸包裹细胞培养板避光，并置37°C下摇床孵育60分钟。弃细胞培养板中液体，PBST洗涤3次后甩干。将甩干的细胞培养板于倒置荧光显微镜下观察，按Reed和Muench法计算PCV2的病毒效价。
[0089]具体可参考图2的PCV2TCID5Q病毒效价测定的IFA图片，其中图A、B、C、D、E、F依次为试验组样品稀释10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7的荧光测定图片；图G、H、1、J、K、L依次为阳性对照稀释10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7的荧光测定图片；M为阴性对照的荧光测定图片(显微镜放大倍率为1X 10)。
[0090](6)将PCV2病毒按MEM培养基I %的体积，接种密度为2 X 15个/ml的PK-15细胞悬液，并将接种PCV2含MEM培养基的细胞瓶置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中培养72h，反复冻融操作3次，并按此方法连续繁殖3代，琼脂糖凝胶电泳未检测到支原体，说明该方法已彻底去除了 PCV2中污染的支原体，重复性好，为PCV2各种类型疫苗的研制与开发提供了无支原体且效价高的病毒。
[0091]最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法，其特征在于，具体步骤包括: (1)0.1ym滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代； (2)PCV2病毒用终浓度2.5 μ g/ml的Plasmocin处理两代； (3)常规繁殖PCV2两代； 所述步骤(1)具体包括下述步骤: A、用含5%胎牛血清(PAA，A10209-1611)的 MEM 培养基(GIBC0，574131)培养 PK-15 细胞，细胞密度为2X 15个/ml，将PCV2病毒用0.1 μ m滤菌器过滤后，向MEM培养基中接种PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为MEM培养基体积的I %，然后将装有接种PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中，培养72h ； B、将步骤A培养后的细胞瓶，进行冻融操作:将细胞瓶置于温度为_70°C的冰箱中冷冻12h，然后再取出细胞瓶置于常温(15~25°C )中融化； C、再将细胞瓶进行步骤B的冻融操作两次，即共反复三次冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液； D、将步骤A中的PCV2病毒替换成步骤C中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，再依次重复步骤A、步骤B、步骤C的处理3次，即制得PCV2病毒； 所述步骤(2)具 体包括下述步骤: E、用含5%胎牛血清的MEM培养基培养PK-15细胞，细胞密度2X15个/ml，再向MEM培养基中接种步骤(1)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为MEM培养基体积的1%，并向MEM 培养基中加入 Plasmocin (Invivogen,MPT-34_01B),使 Plasmocin 的终浓度为 2.5 μ g/ml，然后将装有接种了 PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37°C、CO2浓度为5%的培养箱中，培养72~96h ;细胞铺满后，将细胞瓶反复进行3次步骤B中的冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液； F、将步骤E中的PCV2病毒替换成步骤E中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，重复一次步骤E的操作，繁殖一代PCV2病毒； 所述步骤(3)具体包括下述步骤: G、用含5%胎牛血清的MEM培养基培养PK-15细胞，细胞密度2X15个/ml，再向MEM培养基中接种步骤(2)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为MEM培养基体积的I %，然后将装有接种了 PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中，培养72h ;将培养后的细胞瓶取出后，反复进行3次步骤B中的冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液； H、将步骤G中的PCV2病毒替换成步骤G中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，重复一次步骤G的操作，继续繁殖一代PCV2病毒，即制得所需的PCV2病毒。
【文档编号】C12N7/00GK104073472SQ201410309926
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月1日 优先权日:2014年7月1日
【发明者】李少丽 申请人:杭州荐量兽用生物制品有限公司