一种快速鉴定转基因水稻纯合子的定量pcr法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定转基因水稻纯合子的定量PCR方法，其特征在于，所述定量PCR方法以水稻RBE4基因作为内参基因，以转入水稻基因组的外源基因作为目的基因，分别在相同的反应体系中进行定量PCR反应；并根据比较Ct值2-△△Ct法计算鉴别纯合子或杂合子。
【专利说明】一种快速鉴定转基因水稻纯合子的定量PCR法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种可靠的可快速鉴定转基因水稻纯合子并 用于基因叠加的定量PCR法。
【背景技术】
[0002] 通过遗传转化以产生基因改变的植株在基础应用研究中被广泛应用，这也促进了 具有优良性状的经济作物的发展。快速筛选出纯合子植株可减少转基因作物的育种时间， 尤其是之后还需要进行多个基因的叠加。筛选纯合子和确定转基因水稻的拷贝数在选择和 培育转基因品种中至关重要，是研究中不可或缺的步骤。特别是对于需要大量空间来繁殖 下一代的作物，更需要快速准确地鉴定出转基因水稻纯合子。因此，一个可以在早期准确筛 选出纯合子植株并确定转基因水稻拷贝数的方法在分子标记辅助育种中就显得格外重要。 从传统来说，我们通常使用目的基因常规PCR和southern杂交分析来确定转基因水稻的纯 合子和拷贝数。但是很遗憾，这些方法都费时费力，不仅需要大量新鲜或冷冻的样品来提取 DNA，更有可能有放射性污染。
[0003] 为了解决这些问题，有人使用定量PCR来分析基因的整合。定量PCR在整个定量 PCR过程中收集数据，因此把扩增和检测合为一步。检测通过一系列的荧光分子完成，即定 量PCR产物的浓度与荧光强度相关。定量PCR的终点是阈值循环数，即报告染料的荧光信 号超过我们所定义的阈值时定量PCR的循环数。以Ct值来显示数据是为了确保定量发生 在扩增的延伸阶段。在反应中Ct值与复制子的数量高度相关。在起始样品材料中目的DNA 的数量越多，荧光信号的显著性增长出现得越快，Ct值就越低。
[0004] 在现有技术的基础上，本发明提供了一种鉴定纯合子的定量PCR方法，且在转基 因叠加中进行准确、可靠的鉴定，并将此应用于分子育种。本方法可以成功应用于3个转基 因的叠加，与southern杂交分析和其他现有的转基因水稻研究方法相比具有快速，准确， 省时省力等优点。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种鉴定转基因水稻纯合子的定量PCR方法，其特征在于，所述定 量PCR方法以水稻RBE4基因（基因号EF055878. 1)作为内参基因，以转入水稻基因组的 外源基因作为目的基因，分别在相同的反应体系中进行定量PCR反应，并根据比较Ct值 法计算鉴别纯合子或杂合子。
[0006] 具体地，所述内参基因引物的核苷酸序列为：
[0007] 正向：GTTTTAGTTGGGTGAAAGCGGTT ;
[0008] 反向：CCTGTTAGTTCTTCCAATGCCCTTA。
[0009] 本发明所述定量PCR的反应体系为：
[0010] 10 μ 1的反应体系，包括：
[0011] Ξ： PCR builer mix 5 μ? DNA 税板（30ng) 1 μ! .il i陶引物（5 pmol μΓ1) 1 μ? 反丨引物（5 pmol μΓ1) 1 μ? Π,ο 2μ1
[0012] 定量PCR反应过程包括：95°C lOmin，1个循环；95°C 10s，60°C 20s，40个循环。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1是本发明所使用的质粒结构图。
[0014] 分别为 p0sPMP122、p0sPMP132、p0sPMP515、p0sPMP516。
[0015] 图2是RBE4的扩增曲线，标准曲线和溶解曲线。
[0016] 其中，（a)扩增曲线；(b)标准曲线；(c)溶解曲线；Ct表示阈值循环数，ARn表示 荧光信号强度-荧光基线强度。
[0017] 图3是转基因叠加和常规PCR扩增方案图。
[0018] (a)转基因叠加的缩略图；(b)4个质粒图谱和本方法所鉴定出的纯合子F2代基因 特异性引物常规PCR验证示例。常规PCR产物大小以及Hindlll和EcoRI之间的完整表达 元件如图所示。A代表FUT8基因，B代表GalT基因，C代表AAT基因。大小写字母分别代 表显性位点和隐性位点。
[0019] 图4是转基因水稻品系515-2和515-1的Southern杂交分析。
[0020] 基因组DNA经Hindlll，EcoRI或者Hindlll/EcoRI酶切后，用FUT8基因标记的 探针杂交。经HindIII，EcoRI和Hindlll/EcoRI酶切后的双元载体p0sPMP515用作阳性对 照。]?代表出11(111酶切后的入〇嫩 ；第2-4和8-10孔是分别经把11(1111〇13)4(3〇1?1〇?1)和 HindllΙ/EcoRI (H3/R1)酶切后的质粒 DNA ;第 5-7 孔是分别经 HindllI (H3)，EcoRI (R1)和 Hindlll/EcoRI (H3/R1)酶切后的转基因水稻品系515-2的基因组DNA ;第11-13是分别经 HindIII(H3)，EcoRI(Rl)和 HindIII/EcoRI(H3/Rl)酶切后的转基因水稻品系 515-2 的基 因组DNA。
【具体实施方式】
[0021] 以下实施例中所使用的材料和试剂，除特别说明外，均为普通市售。
[0022] 材料与方法
[0023] 质粒构建和培育转基因水稻植株
[0024] FUT8 基因（α-1，6-fucosyltransferase ;基因号 D89289. 1)和 GalT 基因 (β-1，4-galactosyltransferase ;基因号 M22921. 1)按照水稻密码子偏好，由 GenScript 公司（美国）合成（优化后的基因序列如SEQ ID Ν0· 1和SEQ ID Ν0· 2所示）。本发明用 具有胚乳特异性表达启动子Glb(globulin)的p0sPMP512质粒作为中间载体。合成的基 因经Schl和Xhol分步酶切后，插入由Nael和Xhol酶切后的p0sPMP512载体，由此得到 p0sPMP513(FUT8)和 p0sPMP514(GalT)。p0sPMP513 和 p0sPMP514 经 Hindlll 和 EcoRI 酶 切后插入同样经过Hindlll和EcoRI酶切后的JH2600载体，得到双元载体p0sPMP515和 pOsPMP516(如图1所示）。质粒转化到农杆菌菌株EHA105。含有CP启动子和潮霉素（HPT) 基因的质粒p〇sPMP122作为筛选标记（如图1所示）。含有目的基因的质粒和筛选标记质 粒通过农杆菌介导的转化法共同侵染水稻TP309的愈伤组织。
[0025] 抗潮霉素的转化子通过基因特异性引物HPT-F/HPT-R的常规PCR反应来鉴 定（表1)。本发明用到一个表达人α抗胰蛋白酶（AAT)的转基因水稻品系（132-17) (Zhang L, Shi J, Jiang D, Stupak J, Ou J, Qiu Q, An N, Li J, Yang D, Expression and characterization of recombinant human alpha-antitrypsin in transgenic rice seed. Journal of biotechnology, 2013)。包含 HPT 基因和 FUT8 或 GalT 基因的共转化子 由目的基因引物FUT8-F2/FUT8-R2或GalT-F2/GalT-R2 (表1)的常规PCR反应鉴定。纯合 子转基因水稻品系515首先与纯合子转基因水稻品系516杂交，得到的F1代再与132-17 杂交。（515X516) X132-17杂交后的F2代植株用于接下来通过本方法鉴定纯合子和杂合 子的研究。
[0026] 表1.定量PCR和常规PCR分析的引物
[0027]
【权利要求】
1. 一种鉴定转基因水稻纯合子的定量PCR方法，其特征在于，所述定量PCR方法以水 稻RBE4基因作为内参基因，以水稻基因组外源基因或内源基因作为目的基因，分别在相同 的反应体系中进行定量PCR反应；并根据比较Ct值 AAet法计算鉴别纯合子或杂合子和 基因拷贝数。
2. 如权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于，所述内参基因的引物的核苷酸序列 为： 正向：GTTTTAGTTGGGTGAAAGCGGTT ; 反向：CCTGTTAGTTCTTCCAATGCCCTTA。
3. 如权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于，所述定量PCR的反应体系为10 μ 1 的反应体系，包括： 定 SPCR buffer mk 5 μ? DNA 模板 30 ng 1 μ? 止向引物5pmo丨μΓ1 1 μ? 反向引物5 pmol μΓ1 1 μ? Η20 2 μ? 定量？〇?反应过程包括：951：1〇1^11，1个循环；951：1〇8,6〇1：2〇8,40个循环。
4. 如权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于，当接近于2时判断为纯合 子；当接近于1时判断为杂合子。
5. 如权利要求4所述的定量PCR方法，其特征在于，当鉴定单拷贝转基因水稻的纯合子 时，其纯合子和杂合子的鉴定准确率为100%。
6. 如权利要求4所述的定量PCR方法，其特征在于，当鉴定双拷贝转基因水稻的纯合子 时，其纯合子和杂合子的鉴定准确率为92. 31%。
7. 如权利要求1所述的定量PCR方法，在鉴别多基因叠加的转基因水稻纯合子中的应 用。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，对至少含有三种以上外源基因的转基因水 稻进行基因叠加分析。
9. 如权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于，在鉴定转基因水稻的外源基因拷贝 数的应用。
10. 如权利要求9所述应用，其特征在于，所述拷贝数鉴定的准确率100%。
11. 如权利要求3所述的定量PCR方法，其特征在于，所述定量PCR buffer mix包含荧 光染料 SYBR Green。
【文档编号】C12Q1/68GK104195225SQ201410317881
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月3日
【发明者】杨代常, 汪相宏 申请人:武汉大学