一株有效抑制烟草青枯病菌及玉米纹枯病菌的多粘类芽孢杆菌的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株能有效抑制烟草青枯病菌(Ralstonia?solanacearum)和玉米纹枯病菌(Rrizoctonia?solani)的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus?polymyxa)的分离及应用，属于微生物【技术领域】。多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)C2c分离自泰安小麦根际，能有效抑制烟草青枯病菌和玉米纹枯病菌的生长，尤其是对烟草青枯病菌的室内抑菌效果超过化学药剂80％福美双水分散粒剂。C2c对玉米大斑病菌(Exserohilum?turcicum)、小麦赤霉病菌(Fusarium?graminearum)和烟草炭疽病菌(Colletotrichum?nicotianae)等也有很好的抑制作用。
【专利说明】一株有效抑制烟草青枯病菌及玉米纹枯病菌的多粘类芽孢 杆菌
【技术领域】
[0001] 本发明属微生物学领域，涉及一株多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)的 分离及应用，特别是涉及一株能有效抑制烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum)和玉米 纹枯病菌（Rrizoctonia solani)生长的多粘类芽孢杆菌。
【背景技术】
[0002] 由青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是烟草上最具毁灭性 的细菌性病害，发生面积广，是对烟叶产量及品质造成重大损失的系统性侵染病害。该病广 泛分布于世界热带、亚热带及温暖湿润的地区。1940年前后，该病在美国和印度尼西亚的危 害最为严重，此后，在日本、澳大利亚、韩国等许多产烟国家逐渐演变为烟草上的重要病害 (朱贤朝等，2002)。烟草青枯病在我国南方每年都有发生，近些年已经发展到北方烟区，成 为我国烟叶生产上的重要制约因素。
[0003] 玉米是我国重要的粮食、饲料作物及工业原料，在我国国民经济和农业生产上占 有重要地位，玉米生产直接关系着我国粮食战略安全。近年来玉米纹枯病（Rhizoctonia solani)的发生呈上升趋势，危害日益加重，制约了玉米生产的发展。
[0004] 因为化学农药的长期不合理大量使用会引发抗药性、残留和病虫再猖獗等3R问 题，生物防治在植物病害防治中的作用越来越受重视。土壤中的一些微生物，对植物病原菌 有良好的抑制作用，在植物病害防治中有重要的应用价值。类芽孢杆菌属（Paenibacillus) 中的许多菌株，特别是多粘类芽孢杆菌（P. polymyxa)分布广、数量多，营养需求简单、繁殖 快、竞争定殖力强，可产生多种抗生素和活性物质。多粘类芽孢杆菌（P. polymyxa)在多种 作物上有促生及抑菌抗病作用，我国农业部已将多粘类芽孢杆菌属（Paenibacillus)列为 免做安全鉴定的一级菌种（杨少波等，2008)。Egamberdiyeva(2007)证实多粘类芽孢杆菌 (P. polymyxa)可以促进玉米对氮、磷、钾等营养物质的吸收从而起到促生作用。
[0005] 本发明从小麦根际分离到1株多粘类芽孢杆菌C2c，能有效抑制烟草青枯病菌 (R. solanacearum)和玉米纹枯病菌（R. solani)的生长，尤其是其对烟草青枯病菌的抑制 效果超过80%福美双水分散粒剂，对玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum)、小麦赤霉病 菌（Fusarium graminearum)等多种病原真菌也有很好的抑制效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供1株抑制烟草青枯病菌（R. solanacearum)和玉米纹枯病菌 (R. solani)生长的多粘类芽孢杆菌（P. polymyxa)。
[0007] 本发明是采用如下技术方案实现的：生防菌株分离自山东小麦根际。采用纸碟片 法，筛选出对烟草青枯病菌具有良好抑制作用的拮抗菌株，命名为C2c。通过对C2c菌株16S rDNA序列测定及系统进化分析将其鉴定为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus. polymyxa)。 测定了生防菌株C2c的抑菌谱，证明其对玉米纹枯病菌等多种病原真菌也有非常好的抑制 效果。
[0008] 保藏信息
[0009] 保藏时间：2014年6月19日
[0010] 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC
[0011] 保藏编号：CGMCC N0. 9361
[0012] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0013] 分类命名：多粘类芽孢杆菌
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为多粘类芽孢杆菌C2c对烟草青枯病菌的抑制作用
[0015] 图2为根据C2c 16S rDNA序列构建的系统发育树
[0016] 图3为多粘类芽孢杆菌C2c与80%福美双水分散粒剂（稀释100倍、200倍）对 烟草青枯病菌的抑制作用
[0017] 图4为多粘类芽孢杆菌C2c对不同病原真菌的拮抗作用：
[0018] a图为玉米纹枯病菌；b图为玉米大斑病菌；c图为玉米青枯病菌；d图为小麦赤霉 病菌。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件进行。
[0020] 实施例1 :生防菌的分离和保存
[0021] 根据方中达（1979)的方法筛选生防菌株。采集小麦根际土壤10g，加入到盛有 90mL无菌水的三角瓶中，将三角瓶置摇床上，180r/min振荡20min，制成土壤悬液。将制备 好的土壤悬液静置lOmin，采用10倍系列稀释法，依次稀释到10'10'ΚΓ 4和ΚΓ5,每个浓 度吸取100 μ L于NA平板上，涂布均匀，每个浓度重复三次。将平板于28°C恒温培养箱中培 养24h。挑取细菌菌落进行划线，纯化三次后测定抑菌效果，筛选有抑菌活性的菌株。
[0022] 实施例2 :生防菌对烟草青枯病的抑菌效果
[0023] 将烟草青枯菌于TTC培养基上活化，生防菌于LB培养基上活化，挑取单菌落于LB 液体培养基中，放置28°C震荡培养箱，180rpm，培养6-8h，8000rpm离心5min，收集菌体，用 无菌水重悬，调节浓度为1. 0 X 109cfu/mL。
[0024] 采用纸碟片法，在预先准备的LB平板中央放置直径为7mm的纸碟片，在纸碟片上 加生防菌菌悬液10 μ L，待培养基将生防菌充分吸收后，倒置于28°C培养箱培养24h。将平 板转移到通风橱内喷施烟草青枯病菌菌悬液。喷雾要均匀一致，溶液雾化程度高，使雾化菌 悬液自然散落于培养基上，避免形成明显液滴，冲散原有菌落。待平板表面液滴充分吸收后 将平板转移到28°C恒温培养箱，24h后十字交叉法测量抑菌圈直径。
[0025] 结果表明生防菌C2c对烟草青枯病菌有很好的抑菌效果，接种烟草青枯病菌24h 后，C2c抑菌圈直径达77. 05mm(图1)。
[0026] 实施例3 :菌株C2c的鉴定
[0027] 利用引物 16S-8-F(5' -CAC GGA TCC AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3')和 leS-lSlO-Rb' -CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3')扩增菌株 C2c 的 16S rDNA。扩增 体系为：10XPCR Buffer2. 5μ L，dNTP(2. 5mmol/L) 1· Ομ L，16S-8-F(10moL/L) 1· Ομ L， 16S-1510-R(10moL/L)1.0yL，模板DNA 1.0yL，Taq DNA聚合酶（5U/L)0.125yL，加 ddH20至终体积25. Ο μ L ;以ddH20替代模板的体系作为阴性对照扩增体系。扩增程序为 94°C 3min ;94°C 30s，57°C 30s，72°C lmin50s，30 个循环；72°C lOmin ;4°C保存。反应结束 后，将PCR产物置于1. Ο %琼脂糖凝胶进行电泳分析。参照美国AXYGEN公司PCR纯化回 收试剂盒回收PCR产物，将回收的目的片段在4°C中与PMD18-T过夜连接。连接反应体系 为：10\了40嫩1^8&86 1311打61'14 1^，？]\?18-1'(50叩/^1^)0.3 4 1^，目的0嫩7.7 4 1^，了40嫩 Ligase(350U/y L) 1 μ L〇
[0028] 热激法将连接产物转化感受态细胞：将100 μ L大肠杆菌感受态细胞置于冰上融 化，加入10 μ L连接产物，轻轻搅动以混匀，将混合物于冰上放置25min，然后42°C水浴热激 90S，迅速冰上放置5min，加800 μ L LB液体培养基（不含抗生素），混匀，37°C，180r/min振 荡45min。8000rpm离心2min，取出800 μ L上清，重悬菌体，将菌体均匀涂在含有氨苄青霉 素的抗生素平板上，然后将平板正向放置30min，37°C倒置培养14-16h。挑去单菌落于含有 液体LB培养基（含氨苄抗生素0. lmg/mL)的试管中，37°C，180r/min，震荡培养4-6h，保存 于2. OmLl离心管中。
[0029] 碱裂解法提取质粒DNA(韩志勇等，2000)。将提取的质粒置于1. 0%琼脂糖凝胶进 行电泳，以空PUC18质粒作为对照。将含有重组质粒的菌株，以菌液形式送测序公司测序。 每个菌液样品送2个克隆。将测序结果在NCBI上BLAST，利用Mega软件构建系统发育树。
[0030] 电泳检测表明，从C2c基因组中扩增到了大约1.5kb的片段。经测定，C2c 16S rDNA序列长为1517nt，具体序列如SEQ. NO. 1所示。
[0031] 在根据16S rDNA序列构建的系统树中，C2c与多粘类芽孢杆菌（P. polymyxa)聚 类到一支（图2)。
[0032] 实施例4 :C2c与80%福美双水分散粒剂对烟草青枯病病菌抑制效果比较
[0033] 采用纸碟片法，测定100倍和200倍稀释浓度的80%福美双水分散粒剂以及生防 菌C2c对烟草青枯病病菌抑菌圈直径。
[0034] 结果表明，C2c的抑菌圈直径为29. 70mm，100倍稀释浓度和200倍稀释浓度的 80%福美双水分散粒剂对烟草青枯病菌的抑菌圈直径分别为18. 20mm和14. 30mm，说明多 粘类芽孢杆菌C2c对烟草青枯病的抑制效果明显超过参试药剂80%福美双水分散粒剂（图 3)。
[0035] 实施例5 :生防菌抑菌谱的测定
[0036] 采用对峙培养法（Si jam等，2005)。在预先准备的直径为90mm的PDA平板上均匀 对称放置2片直径为7mm的纸碟片，在纸碟片上分别滴加生防菌C2c菌悬液10 μ L，待培养 基将生防菌菌液充分吸收后，倒置于28°C恒温培养箱培养24h。将直径为6mm的病原真菌 菌饼放置在两纸碟片中央，封口，最后放入28°C恒温培养箱中培养。7天后测量病原真菌自 然生长半径及生防菌处生长半径，计算抑制率 ：
[0037] 抑制率=(1-生防菌处病菌半径/对照处病菌半径）/2X 100%
[0038] 结果表明，C2c对玉米纹枯病菌的抑制率为48. 37%，对玉米大斑病菌的抑制率为 36. 36%，对小麦赤霉病菌的抑制率为36. 67%，对玉米青枯病菌的抑制率分别为34. 44% (图 4)。
[0039] 以上所述，仅是本发明的个别实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依 据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发 明技术方案的范围内。
[0001] <110〉山东农业大学 <120>-株有效抑制烟草青枯病菌及玉米纹枯病菌的多粘类芽孢杆菌 <160>27 <210>1 <211>1517 <212>DNA <Π3>多粘类芽孢杆菌C2c <400>1 1 agagtttgat tatggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 61 ggggttattt agaagcttgc ttctaaataa cctagcggcg gacgggtgag taacacgtag 121 gcaaoctgcc cacaagacag ggataactac cggaaacggt agctaataoc cgatacatcc 181 ttttcctgca tgggagaagg aggaaagacg gagtaatctg tcacttgtgg atgggcctgc 241 ggcgcattag ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 301 agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 361 tagggaatct tccgcaatgg gcgaaagcct gacggagcaa cgccgogtga gtgatgaagg 421 ttttcggatc gtaaagctct gttgccaggg aagaacgtct tgtagagtaa ctgctacaag 481 agtgacggta cctgagaaga aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 541 tagggggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gctctttaag 601 tctggtgttt aatcccgagg ctcaacttcg ggtcgcactg gaaactgggg agcttgagtg 661 cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca 721 ccagtggcga aggcgactct ctgggctgta actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag 781 caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttaggg 841 gtttcgatac ccttggtgcc gaagttaaca cattaagcat tccgcctggg gagtacggtc 901 gcaagactga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcagtggag tatgtggttt 961 aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat ccctctgacc ggtctagaga 1021 taggcctttc cttcgggaca gaggagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1081 tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tgcttagttg ccagcaggtc 1141 aagctgggca ctctaagcag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1201 aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtacta caatggccgg tacaacggga 1261 agcgaagccg cgaggtggag ccaatcctag aaaagccggt ctcagttcgg attgtaggct 1321 gcaactcgcc tacatgaagt cggaattgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa 1381 tacgttcccg ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttaca acacccgaag 1441 tcggtgaggt aaccgcaagg ggccagccgc cgaaggtggg gtagatgatt ggggtgaagt 1501 cgtaacaagg taaccct
【权利要求】
1. 一株多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)C2c，其特征在于能有效抑制青枯 病菌和立枯丝核菌的生长，现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏单位简称：CGMCC ;保藏号：CGMCC NO. 9361 ;其16S rDNA核苷酸序列如SEQ. NO. 1所示。
2. 如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)C2c在防治作 物病害中的应用，所述病原菌为青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum)和立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani)〇
【文档编号】C12N1/20GK104087540SQ201410331911
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】李向东, 毕涛, 王晓强, 陈秀斋, 田延平 申请人:山东农业大学