专利名称：拮抗玉米茎腐病和纹枯病的木霉菌菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物防治领域，涉及一株木霉菌菌株及其用途，尤其涉及一株拮抗玉米茎腐病和纹枯病的木霉菌菌株及其用途。
背景技术：
近年来，随着耕作和栽培制度的改变、品种轮换及高油高淀粉品种大面积种植，玉米的土传病害有逐年加重的趋势，一般年份发病率大约在10-30%，严重年份甚至可以达到60%以上，从而导致玉米产量显著降低。因此，土传病害已成为玉米稳产、高产的主要制约因素之一。而我国玉米的主要土传病害有4种，即茎基腐病、丝黑穗病、纹枯病和全蚀病，其中莖基腐病和纹枯病的危害尤为严重。玉米茎腐病(Corn Stalk Rot)，又称玉米青枯病，其分布广、危害重，世界玉米各 产区均普遍发生，给玉米生产造成很大损失，一般年份发病率为10-20%，严重时可达50%以上，导致玉米减产20-30%。绝大多数研究证明，引起玉米茎腐病的病原菌是一个致病菌的群体，而且不同地区的病原菌不完全相同，或完全不同。目前，从病残体中分离到的致病菌有腐霉菌、镰刀菌、干腐菌、炭疽菌和细菌等。国内近年来有关茎腐病病原菌的种类存在3种不同的观点腐霉菌是主要的致病菌；镰刀菌是主要致病菌；腐霉菌和镰刀菌复合侵染所致。玉米纹枯病(Rhizoctonia solani)是世界上玉米产区广泛发生、危害严重的世界性病害之一，在我国始见于1966年的吉林省，后在四川、贵州、江苏、浙江、河南、河北、安徽、辽宁、黑龙江、吉林、山西、陕西、山东等省及两湖、两广地区的春、夏、秋玉米均有发生。20世纪70年代后，随着玉米种植面积的扩大，杂交种的推广应用，施肥量及种植密度的提高，玉米纹枯病的发生、发展和蔓延日趋严重；特别在我国西南玉米种植地区，由于玉米生长期气温高、湿度大，纹枯病已经成为玉米第一大病害研究发现，目前其纹主要病原菌是立枯丝核菌。为了有效防治以上玉米病害、保证我国玉米产量稳定增长，必然需要进行玉米病害的综合防治，即从玉米田间生态系统的整体观念出发，以农业防治为基础，协调运用生物防治和化学防治等各项措施，将病害的发生为害控制在经济允许损失水平以下，实现经济、生态和社会的三大效益。其中，生物防治广受政府、农庄及农户关注，生防微生物资源研究中高效拮抗菌株成为重中之重。而木霉菌，作为国际公认的生防菌，寻找具高效生防能力的木霉菌株迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是通过对峙培养测定、拮抗相关酶活测定、盆栽接种试验及抗生性次生代谢物提取分析的方法，提供一种高拮抗性、强专化性的拮抗玉米茎腐病和纹枯病的木霉菌菌株，该菌株能够用于生产高效且快速防治玉米茎腐病和纹枯病的生物农药。本发明是通过以下的技术方案实现的，
第一方面，本发明涉及一种拮抗玉米茎腐病和纹枯病的木霉菌菌株，所述木霉菌菌株为深绿木霉(Trichoderma atroviride) SG3403CGMCC No. 6479。优选地，所述木霉菌菌株的ITS序列如SEQ ID NO. I所示。第二方面，本发明还涉及前述木霉菌菌株在制备防治玉米茎腐病和纹枯病农药中的用途。本发明提供的木霉菌菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101 ;本发明菌株的信息为深绿木霉(Trichoderma atroviride) SG3403 ;保藏号为CGMCC No. 6479 ;保藏日期为 2012. 8. 28。菌株培养特征包括在PDA和SNA上的最适合生长温度为25_30°C，25°C PDA培养3d,菌落半径为 42. 8-60. 5mm ；25°C SNA 培养 3d，菌落半径为 22. 2-35. 5mm。在 PDA 上 30°C 培养96h，菌落边界清晰，中央有一菌丝相对致密的圆盘状结构，是分生孢子的主要产生区域；一般没有分生孢子堆，有椰子气味(甜味)。菌株形态特征包括分生孢子梗的可育延伸物没有或者很少产生，没有不育的菌毛；虽然成对着生的分枝比较常见，但分生孢子梗的典型分枝方式为单侧分枝，分枝角度为近似90°。瓶梗长度为4. 2 15. Oym,长宽比值为I. I 6. 3，直或者弯曲，有时候为钩状；2 4个呈漩涡状排列，常为单生；漩涡状排列中的最顶端瓶梗及单生瓶梗一般为圆柱形，只在尖端下部缢缩，形成细颈样形状；尖端下面着生的瓶梗为烧瓶形，中部膨大，至顶缢缩，基部稍微缢缩；瓶梗的支持细胞宽度与瓶梗基部相似。没有间生瓶梗。分生孢子绿色，亚球形至卵圆形，没有明显的脱落痕迹，光滑，3. O 5. 0μ mX2. 3 4. Ομπι,长宽比值为
0.8 I. 6，干燥。本发明采集华东地区农田土壤，并于4°C保藏，再分离纯化菌株，然后依次进行离体对峙病原菌抑制试验(串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌)、检测拮抗相关酶酶活(几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、胞外蛋白酶)和活体接菌防效试验，经过以上步骤反复筛选，最终选出高拮抗性、强专化性的杀玉米茎腐病和纹枯病病害的木霉菌菌株，编号为SG3403。为了该菌株更好地开发利用，进行了抗生性次生代谢物质分析，明确了在拮抗中起作用的物质的比例。通过菌落、分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等形态特征鉴定以及内转录基因间区核酸序列测定和分析，其ITS序列如序列表中的序列I所示，从而确定了该菌株的分类地位木霉属(Trichoderma Pers. ex Fr.),深绿木霉(Trichoderma atroviride)。本发明提供的木霉菌菌株生长速度快、产孢量大、离体对峙病原菌(串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌)抑制率分别达71. 91%,74. 77%,73. 11%，几丁质酶酶活为4. 1452U，β -I, 3-葡聚糖酶酶活为0. 5969U，胞外蛋白酶酶活为2. 4845U。该菌株能够用于生产高效且快速防治玉米茎腐病和纹枯病的生物农药。
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显图I为本发明SG3403菌株中不同类型的抗生性次生代谢物分配比例结果图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。本发明通过采集山东省寿光市芹菜蔬菜地土壤，并于4°C保藏土壤，再分离纯化野生菌株1026株木霉菌，然后依次进行离体对峙病原菌抑制试验(串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌)、检测拮抗相关酶酶活(几丁质酶、β -I, 3-葡聚糖酶、胞外蛋白酶)、活体接菌防效试验和抗生性次生代谢物提取分析，经过以上步骤反复筛选，最终选出高拮抗性、强专化性的杀玉米茎腐病和纹枯病病害的木霉菌菌株，编号为木霉菌SG3403。并通过菌株的菌落、分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等形态特征鉴定以及内转录基因间区核酸序列测定和分析确定该菌株的分类地位。实施例I为离体对峙抑菌试验，实施例2 4为拮抗相关酶的酶活检测试验，实施 例5为活体接菌防效试验，实施例6 7为抗生性次生代谢物提取分析试验。实施例I、离体对峙抑菌试齡制备PDA平板，用打孔器自培养3d的供试木霉菌和3株病原菌(串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌)菌落边缘分别打取直径5mm的菌块，分别移植在平板相对的两侧中央，相距约5cm，28°C恒温倒置培养，重复3次，以仅接种病原菌的平板作为对照。接种144h后分别测量三株病原菌的直线生长距离和S。,，按如下公式计算抑制率抑制率(%)= (Sck-St)/SekX 100%，其中Sek表示对照组接种病原菌株144h后的直线生长距离；St表示对峙培养组接种病原菌株144h后的直线生长距离。表I菌株离体抑菌率的测定结果
病菌抑制率(%)
菌株 --—--
采谷濂刀荫中珠籠力菌立枯丝核菌
SG340371.91~ 7-1.7773. 11[由表I可以看出，SG3403对三株病原菌(串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌)的抑制作用较好，分别为71. 91%,74. 77%,73. 11%。实施例2、几丁质酶酶活力检测将木霉菌株接种到PDA培养基平板(直径90mm)上，在光照恒温恒湿培养箱25°C、60%湿度培养5d。把长满木霉的平板用灭菌水浸泡3-5min，用棉签轻轻刮洗下孢子及菌丝体，脱脂棉或4层纱布过滤除去菌丝体，滤液即为孢子悬浮液。根据血球记数板法进行计数，稀释后孢子悬浮液浓度为IO6个· mL—1孢子量。配制N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)(色谱纯，Sigma Chemical Co. P. O. , Germany)的Img · ml/1的标准溶液，取6支25 X 250mm试管，按表2加入试剂，将各管混匀，在沸水中准确煮5min，取出后立即冷却至室温，再向各试管加入21. 5mL蒸馏水，摇均。稀释后各管NAG的浓度依次为0、8、12、16、20、24、28 ( μ g/mL)。先对7管样品通过紫外分光光度计在200-700nm范围进行全波扫描，得到其最大吸收值的波长。再对上述7支管在最大光吸收(OD)值的波长下按NAG浓度从低到高测定吸光值，以NAG浓度(μ g/mL)为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出标准曲线。表2建立NAG标准曲线的试剂
权利要求
1.一种措抗玉米3；腐病和纹枯病的木霉囷囷株，其特征在于，所述木霉囷囷株为深绿木霉(Trichoderma atroviride) SG3403CGMCC No. 6479。
2.根据权利要求I所述的木霉菌菌株，其特征在于，所述木霉菌菌株的ITS序列如SEQID NO. I 所示。
3.—种如权利要求I所述的木霉菌菌株在制备防治玉米茎腐病和纹枯病农药中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种生物防治领域的拮抗玉米茎腐病和纹枯病的木霉菌菌株及其用途。所述木霉菌菌株为深绿木霉(Trichoderma atroviride)SG3403CGMCC No.6479；同时，本发明还涉及前述木霉菌菌株在制备防治玉米茎腐病和纹枯病农药中的用途。本发明提供的木霉菌菌株生长速度快、产孢量大、离体对峙病原菌抑制率分别达71.91%、74.77%、73.11%，几丁质酶酶活为4.1452U，β-1,3-葡聚糖酶酶活为0.5969U，胞外蛋白酶酶活为2.4845U；本发明的菌株能够用于生产高效且快速防治玉米茎腐病和纹枯病的生物农药。
文档编号C12N1/14GK102888349SQ20121037846
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者孙瑞艳, 陈捷, 曹磊, 刘志诚, 李雅乾, 姚丽美, 林振亚 申请人:上海交通大学