以抑制Smurf1泛素化降解RhoB为靶点的抗肿瘤药物筛选方法

以抑制Smurf1泛素化降解RhoB为靶点的抗肿瘤药物筛选方法
【专利摘要】以抑制Smurf1泛素化降解RhoB为靶点的抗肿瘤药物筛选方法，涉及抗癌症药物筛选。将候选化合物与物质实体接触；观察候选化合物对所述一种抑制E3泛素连接酶Smurf1泛素化降解其底物RhoB的检测结果的影响，所述候选化合物若能够使细胞内的检测结果发生负向改变，即表征Smurf1泛素化降解RhoB的能力减弱，则表明该候选化合物是抗肿瘤的潜在药物。所述表明该候选化合物是抗肿瘤的潜在药物后，可进一步选择能提高癌细胞中RhoB蛋白含量的化合物，其具体方法：将候选化合物与不同类型的肿瘤细胞接触；观察候选化合物对不同类型的肿瘤细胞中RhoB蛋白含量的影响。实验周期短、检测过程快、灵敏度高、应用范围广。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗癌症药物筛选，尤其是涉及以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB为靶点 的抗肿瘤药物筛选方法。 以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB为靶点的抗肿瘤药物筛选 方法

【背景技术】
[0002] 2010年，癌症已超过心脑血管疾病成为第一大危害人类健康的疾病。2013年世界 卫生组织公布，全世界每年患癌症人数大幅度增长，至今每年检验出的新增癌症患者数已 经超过1400万名。这与2008年的统计结果1270万人相比，人数明显增加。同期，癌症患 者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。癌细胞区别正常细胞的一 个重要标志就是逃逸细胞程序性死亡，即细胞凋亡（apoptosis)。细胞凋亡是由于内外环境 变化或死亡信号触发，在相关基因调控下引起的细胞主动死亡过程，在生理状态下能消除 机体内老化细胞及潜在性异常生长细胞，对于保持机体稳态发挥重要作用。凋亡调控失调 可引起人体多种疾病，也是肿瘤发生的重要原因之一。近年研究也发现，放化疗等多种抗肿 瘤治疗的部分机制与诱导凋亡有关。因此，探明凋亡的相关机制以及利用凋亡机制对肿瘤 进行治疗具有重要意义。肿瘤细胞通常具有一定的凋亡抵抗机制，利用细胞凋亡机制针对 肿瘤的治疗也就是在凋亡调节的各个水平上使促凋亡和抗凋亡的平衡发生改变，诱导肿 瘤细胞凋亡。
[0003] 随着对肿瘤细胞凋亡机制的深入研究，药物诱导肿瘤细胞凋亡已成为目前肿瘤治 疗的重要途径之一。在目前的抗癌药物中，无论是细胞周期特异性药物，还是细胞周期非特 异性药物，对癌细胞的杀伤作用都服从一级动力学原理，即只能按比例而不能全部杀伤肿 瘤细胞。目前，临床上用于治疗肿瘤的药物大都无法避免对机体产生副作用，因此寻求高效 诱导细胞凋亡的药物，在杀伤残存的癌细胞的同时，又能避免对正常细胞的杀伤，具有非常 重要的意义。
[0004] Smurf 1 (SMAD Ubiquitination Regulatory Factorl)是一种 E3 泛素连接酶，在 1999年由Zhu等人以Smadl为诱饵利用酵母双杂交技术，在非洲爪蟾中发现并鉴定出来。 它能选择性地结合受体调节蛋白Smad家族的成员，并使其泛素化降解，进而调节TGFi3信 号通路。近几年的研究发现，Smurfl在肠癌、胰腺癌和前列腺癌中高表达，提示其可能作为 一个原癌基因促进肿瘤的发生。有文献报道，Smurfl可以泛素化降解RhoA促进肿瘤细胞 的上皮 _基质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT)过程，还可以通过单泛素 化TRAF4分子促进乳腺癌细胞的迁移。而且，Smurfl还可以通过稳定细胞内MDM2的蛋白 水平抑制P53蛋白的稳定性，从而抑制细胞凋亡。
[0005] RhoB和其同家族的RhoA和RhoC在氨基酸序列有86 %的同源性，生 物学功能也有重合：以前的观点认为，RhoA，RhoB，RhoC协同调控细胞骨架运动 (Etienne-Manneville, S.，and Hall, A. 2002. Nature420, 629-635)。但更多的证据显不， RhoB具有许多独特于RhoA和RhoC的性质。最有意思的是，与RhoA和RhoC促进细胞增长 的作用不同，RhoB作为一个抑癌基因，抑制细胞增长。虽然RhoB敲除的小鼠没有明显的 生理缺陷，但是RhoB-/-的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF)在纤维蛋白原（fibronectin)上的 运动能力明显减弱。过表达RhoB基因的细胞生长缓慢，并易于发生凋亡。小鼠腹腔注射 RhoB-/-细胞的成瘤效率明显高于Rh〇B+/+细胞。而且，用DMBA，一种导致皮肤癌变的化学 诱变剂处理野生型和RhoB敲除型小鼠的皮肤，敲除小鼠的皮肤瘤发生率显著增高（Liu，A. X.，2001. Mol Cell Biol21，6906-6912)。临床样本也显示，随着肺癌、头颈癌和脑癌肿瘤 恶性程度的增加，RhoB蛋白水平呈逐渐下降的趋势，提示其可能作为一个抑癌基因发挥抗 肿瘤的功能（Adnane, J.，2002. Clin Cancer Res8, 2225-2232 ;Karlsson, R.，2009. Biochim Biophys Actal796, 91-98 ；Mazieres, J. , 2004. Clin Cancer ReslO, 2742-2750)〇
[0006] RhoB这种抑制细胞增殖的功能可能和其在外界环境压力下协助细胞走向凋亡途 径相关。经E1A和突变的H-Ras转化过的Rh 〇B-/-MEF细胞在γ射线，拓扑异构酶抑制 剂阿霉素（Doxorubcin，D0X)等DNA损伤试剂处理后，其凋亡程度明显低于野生型对照组 (Liu, A.X，2001. Proc Natl Acad Sci U S A98, 6192-6197)。而呼吸链阻断剂叠氮化纳 (NaN3)引起的细胞凋亡似乎和RhoB无关，说明RhoB独特应答由DNA损伤（DNA damage)引 起的凋亡信号。同样，干涉内源的RhoB后，人胃癌细胞NUGC-3对抗癌药物表现出不敏感性， 凋亡比例明显下降（Kim, Β· K.，2011. Carcinogenesis32, 254-261)。因此，RhoB 被认为是一 个良好的药物靶点。


【发明内容】

[0007] 本发明的第一目的在于提供一种抑制E3泛素连接酶Smurfl泛素化降解其底物 RhoB的检测方法。
[0008] 本发明的第二目的在于提供一种抑制E3泛素连接酶Smurfl泛素化降解其底物 RhoB的用途。
[0009] 本发明的第三目的在于提供一种以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB为靶点的抗肿瘤 药物筛选的方法。
[0010] 所述一种抑制E3泛素连接酶Smurf 1泛素化降解其底物RhoB的检测方法，选自但 不限于细胞分子生物学检测方法或化学生物学检测方法，所述细胞分子生物学检测方法包 括但不限于免疫共沉淀方法、免疫印迹、体内和体外泛素化及流式细胞技术检测细胞凋亡 等；所述化学生物学检测方法包括但不限于荧光滴定法、BIAcore方法等。
[0011] 所述一种抑制E3泛素连接酶Smurfl泛素化降解其底物RhoB可用于抑制Smurfl 泛素化降解RhoB为靶点的抗肿瘤药物的筛选。
[0012] 所述一种以抑制Smurfl泛素化降解RhoB为靶点的抗肿瘤药物筛选的方法，包括 以下步骤：
[0013] (a)将候选化合物与物质实体接触；
[0014] 在步骤（a)中，所述物质实体可选自细胞或体外表达纯化的蛋白质等。
[0015] (b)观察候选化合物对所述一种抑制E3泛素连接酶Smurfl泛素化降解其底物 RhoB的检测结果的影响，所述候选化合物若能够使细胞内的检测结果发生负向改变，即表 征Smurfl泛素化降解RhoB的能力减弱，则表明该候选化合物是抗肿瘤的潜在药物。
[0016] 在步骤（b)中，所述表明该候选化合物是抗肿瘤的潜在药物后，可进一步选择能 提高癌细胞中RhoB蛋白含量的化合物；所述进一步选择能提高癌细胞中RhoB蛋白含量的 化合物的具体方法可为：
[0017] (1)将候选化合物与不同类型的肿瘤细胞接触；
[0018] (2)观察候选化合物对不同类型的肿瘤细胞中RhoB蛋白含量的影响。
[0019] 在步骤（2)中，所述观察候选化合物对不同类型的肿瘤细胞中RhoB蛋白含量的影 响后，可对筛选出的且能够提高不同肿瘤细胞中RhoB含量的潜在化合物进行进一步的细 胞凋亡实验和裸鼠成瘤模型实验，以选出有效抗肿瘤的药物（化合物）。
[0020] 本发明的主要优点在于：
[0021] 1、首次提供了一种以抑制Smurfl泛素化降解RhoB的抗肿瘤药物靶点，提供了一 种以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB为靶点的抗肿瘤药物筛选方法，所述方法包含蛋白-蛋 白相互作用的检测，RhoB泛素化化水平的检测，细胞凋亡检测以及裸鼠成瘤实验模型。
[0022] 2、本发明的方法包含了三个层层递进的筛选方法，靶点功能明确，作用效果直观， 系统稳定，结果可靠，具有实验周期短、检测过程快、灵敏度高、应用范围广等特点，为高通 量的抗肿瘤药物的筛选提供了新的方法，可应用于药物开发前沿，及建立化合物规模筛选 的技术平台。

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图1为过表达E3泛素连接酶Smurfl影响HeLa细胞内源RhoB蛋白水平。实验结 果表明，Smurfl野生型（Smurf 1WT)可以有效降低RhoB的蛋白水平，而其E3连接酶失活体 (SmurflCA)却对RhoB的蛋白稳定性无影响。Flag-SmurflWT和Flag-SmurflCA质粒转染 HeLa细胞，24h后常规收集细胞，然后进行免疫印迹实验（Western blotting)检测细胞裂 解液中RhoB的蛋白水平。
[0024] 图2为干涉细胞内源E3泛素连接酶Smurfl后对RhoB蛋白水平的影响。实验结 果表明，用两种特异干涉细胞内Smurfl的干涉RNA(sh-Smurfl_l，sh-Smurfl-2)可以提高 RhoB蛋白的稳定性。分别用Smurfl的干涉RNA(sh-Smurfl_l，sh-Smurfl-2)转染HeLa细 胞，48h后用免疫印迹实验（Western blotting)检测RhoB的蛋白水平。
[0025] 图3为Smurf 1和RhoB的体外GST-Pulldown实验。实验结果表明，大肠杆菌表达 的GST-Smurfl和RhoB可以直接结合。利用大肠杆菌BL21表达的GST-Smurfl和RhoB蛋 白可以相互结合。
[0026] 图4为细胞内Smurfl对RhoB泛素化水平的影响。实验结果表明，Smurfl可以增 强 RhoB 的泛素化水平。Myc-SmurflWT，Myc-SmurflCA，Flag-RhoB 及 HA_Ub 按图所不共同 转染293T细胞20h后用蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞（5yM，18h)。然后常规收集细 胞，并用Flag抗体进行免疫沉淀实验（Co-immunoprecipitation assay),然后用免疫印迹 实验（Western blotting)检测免疫沉淀复合物中Flag-RhoB泛素化水平。
[0027] 图5为细胞内Smurfl的蛋白水平对RhoB泛素化水平的影响。实验结果表明，抑制 细胞内Smurf 1的蛋白表达可以降低RhoB的泛素化水平。Smurfl的干涉RNA(sh-Smurfl_l， sh-Smurfl-2)，Flag-RhoB及HA-Ub按图所示共同转染293T细胞48h后用蛋白酶体抑制 剂MG-132处理细胞（5 μ M，18h)。然后常规收集细胞，并用Flag抗体进行免疫沉淀实验 (Co-immunoprecipitation assay),然后用免疫印迹实验（Western blotting)检测免疫沉 淀复合物中Flag-RhoB泛素化水平。
[0028] 图6为Smurfl和RhoB的体外泛素化实验。实验结果表明，大肠杆菌表达的 GST-Smurfl可以泛素化RhoB。利用大肠杆菌BL21表达的GST-Smurfl可以利用泛素（Ub) 对RhoB蛋白进行泛素化。
[0029] 图7为化合物XM01对HeLa细胞中RhoB蛋白稳定性的影响。实验结果表明，XM01 可以有效提高HeLa细胞内RhoB蛋白的稳定性。XM01按不同浓度处理细胞24h后，用免疫 印迹实验（Western blotting)检测细胞裂解液中RhoB的蛋白含量。
[0030] 图8为免疫印迹方法检测化合物XM01对Smurf 1泛素化降解RhoB能力的影响。实 验结果表明，XM01可以有效抑制Smurfl泛素化降解RhoB。Flag-SmurflWT、Flag_SmurflCA 和Flag-RhoB质粒共转染293T细胞，24h后用不同浓度的化合物XM01处理细胞，然后常规 收集细胞进行免疫印迹实验（Western blotting)检测细胞裂解液中RhoB的蛋白水平。
[0031] 图9为体外泛素化方法检测化合物XM01对Smurfl泛素化降解RhoB能力的影响。 实验结果表明，XM01可以在体外系统中有效抑制Smurfl泛素化降解RhoB。
[0032] 图10为流式细胞技术检测细胞凋亡。实验结果表明，随着化合物XM01浓度的升 高，HeLa细胞的凋亡程度也随之升高，说明XM01可以通过引起细胞凋亡抑制肿瘤生长。
[0033] 图11为裸鼠成瘤能力的检测。将HeLa细胞以5X106的密度接种于裸鼠后腿腿 根的侧皮下，四周后用化合物XM01处理右侧皮下肿瘤，对照溶剂DMS0处理左侧皮下肿瘤， 一周后再观察肿瘤大小。实验结果表明，化合物XM01显著抑制了肿瘤细胞在裸鼠体内的生 长。

【具体实施方式】
[0034] 本发明的结果表明，E3泛素连接酶Smurf 1通过泛素化降解RhoB，从而调控细胞在 DNA损伤条件下发生的凋亡。在正常条件下，Smurfl泛素化降解RhoB将其蛋白保持在较低 的水平。而在DNA损伤的条件下，Smurfl自身泛素化降解增强，从而导致RhoB的蛋白稳定 性增强，促进细胞发生凋亡。
[0035] 基于以上结果，建立了抑制Smurf 1泛素化降解RhoB的检测系统，并能够从候选化 合物中筛选出能够抑制Smurfl泛素化降解RhoB的化合物，从而为抗肿瘤新药开发提供一 个有利的技术平台。重要的是，针对这一靶点的药物，将可能解决现有的抗肿瘤药物靶点特 异性不强、副作用强及药物毒性等问题，从而为治疗癌症提供更好的治疗手段。
[0036] 抑制E3泛素连接酶活性的靶点
[0037] 本发明提供了一种E3泛素连接酶降解其底物的靶点，S卩Smurfl降解RhoB靶点。 实验表明，通过常规手段（但不限于）可检测该底物的泛素化强度，并可观察候选化合物对 该泛素化强度的影响，用于筛选抗肿瘤的化合物。
[0038] 所述的检测Smurfl降解RhoB的手段包括但不限于：免疫共沉淀、免疫印迹、体内 及体外泛素化实验。只要适用于检测泛素化强度的其它方法也被包含在本发明中。作为本 发明的优选方式，所述的检测方法是体内-体外泛素化及流式细胞技术。该方法的优点是 快速准确，结果更可靠。
[0039] 筛选方法
[0040] 所述的筛选方法是抑制Smurf 1泛素化降解RhoB的检测方法，可以是细胞水平上 的检测方法，也可以是对体外表达纯化的蛋白质进行检测的方法。通过在细胞培养物中加 入候选化合物，或者使体外纯化表达的蛋白质与候选化合物接触产生作用，观察候选化合 物对所述Smurfl泛素化降解RhoB的影响，从而筛选潜在的抗肿瘤化合物。
[0041] 因此，本发明还提供一种以抑制Smurfl泛素化降解RhoB为靶点的筛选抗肿瘤的 潜在药物（化和物）的方法，所述方法包括步骤：
[0042] (a)将候选化合物与所述的相互作用检测方法中的物质实体（如细胞，体外表达 纯化的蛋白质）接触；和
[0043] (b)观察候选化合物对所述的相互作用检测方法中的检测结果的影响；
[0044] 其中，如果候选化合物能够使细胞内的检测结果发生负向改变，即表征Smurf 1泛 素化降解RhoB能力减弱，则表明该化合物是抗肿瘤的潜在药物（化合物）。
[0045] 作为本发明的优选方式，将分别携带所述的两种蛋白的编码序列的重组载体瞬时 共同转染哺乳动物细胞，通过免疫印迹方法检测所述两种蛋白间的相互作用，筛选潜在的 抗肿瘤药物。为了实现上述目的，采用以下技术：Smurfl表达载体及RhoB表达载体的构建； Smurfl表达载体、RhoB表达载体瞬时共同转染系统的构建；免疫印迹方法检测Smurfl对 RhoB泛素化能力。
[0046] 通过上述方法初步筛选出的化合物可构成一个筛选库，以便于最终可以从中选择 到对肿瘤生长有抑制作用的药物。
[0047] 在另一优选例中，所述的方法还包括选择能提高肿瘤细胞内RhoB蛋白水平的化 合物。所述方法包括步骤：
[0048] (a)将候选化合物与肿瘤细胞接触；和
[0049] (b)观察候选化合物对肿瘤细胞内RhoB蛋白水平水平的影响。
[0050] 通过上述方法，可以对初步筛选到的化合物进行进一步的筛选或验证。
[0051] 在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：对如上获得的潜在化合物进行进一步 的流式细胞凋亡检测及裸鼠成瘤实验，以选出有效抗肿瘤的药物（化合物）。
[0052] 通过上述方法，可从上两次筛选出的潜在化合物中选择到抗肿瘤药物（化合物）。
[0053] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。所述的优选实施方法与材料仅做示范之用。
[0054] 实施例1
[0055] 采用免疫印迹分析（Western blotting)方法检测Smurfl对RhoB蛋白稳定性的 影响。
[0056] 试验方法如下：
[0057] 1)细胞转染：
[0058] 将细胞接种于直径12孔培养板，24h后转染，转染前细胞换新鲜的培养液。转染步 骤为：取1. 5mL离心管，依次加入水180 μ L，相应质粒，2· 5M CaCl220 μ L，HBS200 μ L，轻柔 混匀后，于室温静置15?30min，随后缓慢滴加到培养液中，轻轻晃动培养盘，使分布均匀。
[0059] 转染12h后，将细胞培养液换为新鲜的DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium)，继续培养12h后，常规收集细胞以用于后续实验。
[0060] 溶液配方：
[0061] HBS ：280mM NaCl, lOmM KC1, 1. 5mM Na2HP04, 12mM Glucose, 50mM HEPES, pH7. 05〇
[0062] 2) Western-blot 检测：
[0063] a.蛋白电泳：
[0064] 取20?40μ g蛋白样品，加等体积4XSDS样品缓冲液，95°C煮沸5min，于不连续 SDS-PAGE胶中电泳，电压100V，待样品进入分离胶后将电压调为150V。
[0065] b.电转移：
[0066] 电转液于4°C预冷，切好胶后将同样大小的甲醇预处理的PVDF膜以及滤纸浸于 电转液中；PVDF膜贴于胶后，两面覆盖滤纸，赶尽气泡，按膜朝正极的顺序装于电转槽中， 于一 20°C 电转（100V，60min)。
[0067] c.抗原抗体反应：
[0068] ①封闭：封闭液室温封闭lh ;
[0069] ②一抗反应：封闭后膜与相应一抗于室温孵育1?3h ;
[0070] ③二抗反应：TBST洗3次，每次5min，之后加入相应的二抗，于室温孵育1?3h。
[0071] d.ECL 检测：
[0072] TBST洗3次，每次lOmin。ECL的A液和B液以1 : 1 (V/V)混和，滴加于膜表面， 孵育lmin后曝光。
[0073] 试验结果如下：
[0074] 如图1及图2所示，；Smurfl野生型（SmurflWT)可以有效降低RhoB的蛋白水平， 而其E3连接酶失活体（Smurf 1CA)却对RhoB的蛋白稳定性无影响。同样，用两种特异干涉 细胞内Smurfl的干涉RNA(sh-Smurfl_l，sh-Smurfl-2)可以提高RhoB蛋白的稳定性。
[0075] 试验结果表明，Smurf 1可以调经细胞内RhoB蛋白的稳定性。
[0076] 实施例2
[0077] 用GST融合蛋白沉降技术（GST-Pulldown)检测Smurfl和RhoB的结合。
[0078] 试验方法如下：
[0079] 1)蛋白的体外表达及纯化
[0080] 首先将目的DNA片段克隆到合适的细菌表达载体中，正确的质粒转化 E. coliBL-21或DH-5 α细胞，在LB/氨苄青霉素平板上选择转化子，接种到适量的LB/amp 培养基中，37°C摇动培养过夜。第二天以此为种子，以1 : 100的比例接种到大体积的LB/ amp培养基中，37°C摇动培养到0D_大约为0. 6,加入IPTG到终浓度为lmmol/L以诱导融 合蛋白的表达，20°C低温诱导以减少包涵体的形成，继续培养6h以上。对于不同的载体或 不同的蛋白，最佳的的诱导前细菌浓度，诱导所需的IPTG浓度和诱导的温度、诱导的时间 均不同。
[0081] 蛋白表达完成后，离心收集菌体，用适量预冷的裂解缓冲液（lysis buffer)重悬 菌体，用超声破碎仪破碎菌体，超声前加入蛋白酶抑制剂PMSF到终浓度为lmmol/L。超声破 碎的功率及时间根据不同的细菌浓度和不同大小的蛋白而不同。破碎后的菌体以12000r/ min的转速，4°C离心10min，上清转移到新的管子中。加入预先洗好的GST beads,在4°C的 旋转混合仪上混合3h以上。亲和有蛋白的GST beads用预冷的裂解缓冲液洗几次后，得到 相对较纯的融合蛋白。
[0082] 2)蛋白质体外GST pull down实验
[0083] 利用谷胱甘肽S-转移酶（GST)基因融合载体体外表达纯化出GST、GST-RhoB和 GST-Smurf 1CA融合蛋白，其中，GST-RhoB蛋白用TEV酶将GST标签去除，得到RhoB蛋白。 按图2所示加入相应量的纯化蛋白。旋转摇床4?孵育lh，加入20 μ L4X loading buffer 终止反应，加热至95°C，5min。样品进行SDS-PAGE和Western blot分析。
[0084] 试验结果如下：
[0085] 如图3所示，GST-Smurfl蛋白可以在体外直接和RhoB蛋白相互结合。
[0086] 实施例3
[0087] 通过细胞内泛素化实验检测Smurfl是否影响RhoB的泛素化水平。
[0088] 试验方法如下：
[0089] 以1.5?2X105个/mL的密度接种细胞于10cm细胞培养盘中，待细胞密度达到 40%至50%时，用磷酸钙法转染相应组合的质粒。转染24h后换液同时加药，10 μ M MG-132 处理细胞，加药的目的是抑制已经被不同程度泛素化的底物蛋白通过溶酶体途径降解，转 染后36h收集细胞，用含有PMSF和ΝΕΜ的ΤΝΤΕ (0. 5 % ) buffer进行裂解。从得到的lmL细 胞裂解液中，取45 μ L作为 total lysate加入 15 μ L4X loading buffer用于Western blot 分析，剩余955 μ L用于第一次IP。第一次IP时细胞裂解液中加入lyL Flag-抗，旋转摇 床4°C孵育2h，加入30 μ L预先封闭好的proteinA/G，旋转摇床4°C孵育2h。用TNTE (0· 1 % ) buffer洗涤3次，加入60 μ L的1 % SDS，加热至95°C，5min，使被IP下来的各种处于结合 状态的蛋白质相互分离。取上清，用TNTE(0. 1% )buffer稀释至500μ L的体积，进行第二 次ΙΡ，步骤同上。制备好的样品用于Western blot分析，其中用ΗΑ抗体检测检测底物蛋白 的泛素化情况。
[0090] 试验结果如下：
[0091] 如图4及图5所示，Smurfl野生型（Smurf 1WT)可以有效提高RhoB泛素化水平， 而其E3连接酶失活体（SmurflCA)却对RhoB的泛素化水平无影响。而干涉细胞内Smurf! 后RhoB的泛素化水平明显降低。
[0092] 实施例4
[0093] 采用体外泛素化实验检测Smurfl是否影响RhoB的泛素化水平。
[0094] 试验方法如下：
[0095] 体外表达纯化出泛素活化酶E1，泛素结合酶E2,泛素连接酶E3, RhoB蛋白，泛素 Ubiquitin。根据图6加入相应量的纯化蛋白。室温孵育15min，使底物蛋白RhoB和E3泛 素连接酶充分结合，然后加入E1启动泛素化反应，室温孵育45min，等体积的2% SDS加热 至95°C，5min。取上清用ΤΝΤΕ0. 5扩大体积，加 Flag抗体和protein A/G4°C孵育过夜，样 品进行 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。
[0096] 试验结果表明，如图6所示，Smurfl野生型（SmurflWT)而非其E3连接酶失活体 (SmurflCA)可以有效的提高RhoB泛素化水平。
[0097] 实施例5
[0098] 化合物XM01对HeLa细胞中RhoB蛋白稳定性的影响。
[0099] 实验方法如下：
[0100] 利用实施例1采用的细胞培养及免疫印迹方法用不同浓度的化合物XM01处理 HeLa细胞24h，按常规收集细胞，然后进行免疫印迹实验（Western blotting)检测细胞裂 解液中RhoB的蛋白水平。
[0101] 实验结果表明，如图7所示，随着化合物XM01浓度的升高，HeLa细胞中RhoB蛋白 的稳定也逐步提高，表明XM01是潜在的抑制Smurfl泛素化降解RhoB的化合物。
[0102] 实施例6
[0103] 免疫印迹方法检测化合物XM01对Smurfl泛素化降解RhoB能力的影响。
[0104] 利用实施例1采用的细胞培养、细胞转染及免疫印迹方法，用不同浓度的化合物 XM01处理转染后的293T细胞，24h后按常规收集细胞，然后进行免疫印迹实验（Western blotting)检测细胞裂解液中RhoB的蛋白水平。
[0105] 实验结果表明，如图8所示，随着化合物XM01浓度的升高，293T细胞中Flag-RhoB 蛋白的稳定也逐步提高，表明XM01是潜在的抑制Smurfl泛素化降解RhoB的化合物。
[0106] 实施例7
[0107] 体外泛素化方法检测化合物XM01对Smurfl泛素化降解RhoB能力的影响。利用 实施例4采用的体外泛素化方法检测用不同浓度的化合物XM01在体外系统中对Smurf 1对 RhoB泛素化能力的影响。根据图9加入相应量的纯化蛋白及不同浓度的XM01，反应后进行 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。
[0108] 实验结果表明，如图9所示，随着化合物XM01浓度的升高，Smurfl在体外系统中 对RhoB泛素化能力逐渐减弱，表明XM01抑制Smurfl泛素化降解RhoB。
[0109] 实施例8
[0110] 流式实验及裸鼠成瘤实验检测化合物XM01对肿瘤生长的抑制效果。
[0111] 利用实施例1采用的细胞培养方法检测用不同浓度的化合物XM01对HeLa细胞凋 亡程度的影响。根据图10加入不同浓度（对照，10 μ M，20 μ M)的化合物XM01，24h后收集 细胞进行流式细胞仪检测。
[0112] 实验结果表明，如图10所示，随着化合物XM01浓度的升高，HeLa细胞的凋亡程度 也随之升高，表明XM01可以通过引起细胞凋亡抑制肿瘤生长。在图10中，图（a)为对照组， 凋亡比率为2.7%，图（b)为ΧΜΟΙΙΟμΜ，凋亡比率为37.6%，图（c)为ΧΜ0120μΜ，凋亡比 率为64. 7%。
[0113] 利用实施例1采用的细胞培养方法检测化合物ΧΜ01对裸鼠成瘤能力的影响。将 HeLa细胞以5Χ 106的密度接种于裸鼠后腿腿根的侧皮下，四周后用化合物ΧΜ01处理右侧 皮下肿瘤，对照溶剂DMS0处理左侧皮下肿瘤，一周后再观察肿瘤大小。
[0114] 实验结果表明，如图11所示的两只裸鼠，化合物XM01显著抑制了肿瘤细胞在裸鼠 体内的生长。
【权利要求】
1. 一种抑制E3泛素连接酶Smurf 1泛素化降解其底物RhoB的检测方法，其特征在于选 自但不限于细胞分子生物学检测方法或化学生物学检测方法，所述细胞分子生物学检测方 法包括但不限于免疫共沉淀方法、免疫印迹、体内和体外泛素化及流式细胞技术检测细胞 凋亡；所述化学生物学检测方法包括但不限于荧光滴定法、BIAcore方法。
2. -种抑制E3泛素连接酶Smurfl泛素化降解其底物RhoB在用于抑制Smurfl泛素化 降解RhoB为靶点的抗肿瘤药物的筛选中应用。
3. -种以抑制Smurfl泛素化降解RhoB为靶点的抗肿瘤药物筛选的方法，其特征在于 包括以下步骤： (a) 将候选化合物与物质实体接触； (b) 观察候选化合物对所述一种抑制E3泛素连接酶Smurf 1泛素化降解其底物RhoB 的检测结果的影响，所述候选化合物若能够使细胞内的检测结果发生负向改变，即表征 Smurfl泛素化降解RhoB的能力减弱，则表明该候选化合物是抗肿瘤的潜在药物。
4. 如权利要求3所述一种以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB为靶点的抗肿瘤药物筛选的 方法，其特征在于在步骤（a)中，所述物质实体选自细胞或体外表达纯化的蛋白质。
5. 如权利要求3所述一种以抑制Smurfl泛素化降解RhoB为靶点的抗肿瘤药物筛选的 方法，其特征在于在步骤（b)中，所述表明该候选化合物是抗肿瘤的潜在药物后，进一步选 择能提高癌细胞中RhoB蛋白含量的化合物。
6. 如权利要求5所述一种以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB为靶点的抗肿瘤药物筛选的 方法，其特征在于所述进一步选择能提高癌细胞中RhoB蛋白含量的化合物的具体方法为： (1) 将候选化合物与不同类型的肿瘤细胞接触； (2) 观察候选化合物对不同类型的肿瘤细胞中RhoB蛋白含量的影响。
7. 如权利要求6所述一种以抑制Smurfl泛素化降解RhoB为靶点的抗肿瘤药物筛选的 方法，其特征在于在步骤（2)中，所述观察候选化合物对不同类型的肿瘤细胞中RhoB蛋白 含量的影响后，对筛选出的且能够提高不同肿瘤细胞中RhoB含量的潜在化合物进行进一 步的细胞凋亡实验和裸鼠成瘤模型实验，以选出有效抗肿瘤的药物。
【文档编号】C12Q1/02GK104101714SQ201410335052
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】王洪睿, 郭磊, 王梅林, 曾涛玲, 林琦 申请人:厦门大学