川藏高原冰葡萄酒三级复合发酵菌剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种川藏高原冰葡萄酒三级复合发酵菌剂的制备方法，以Pichia?manshurica(菌种保藏编号:CGMCC?No.6867)、Pichia?anomala(异常毕赤酵母，菌种保藏编号:CGMC?No.C6866)、Saccharomyces?cerevisiae和Saccharomyces?chevalieri为主要发酵菌，采用现代生物技术和微囊制剂制备技术，制成川藏高原冰葡萄酒前期沉酿-中期快速启动-后期发酵三级复合发酵菌剂，为冰葡萄酒标准化生产提供了核心技术，填补国内生产空白，这将对我国葡萄与葡萄酒行业中高端产品的发展和适应市场消费需求起到积极的促进作用，符合了现实的地方特色产业发展需要。
【专利说明】川藏高原冰葡萄酒三级复合发酵菌剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及复合发酵制剂，尤其涉及的是一种川藏高原冰葡萄酒前期沉酿-中期 快速启动-后期发酵三级复合发酵菌剂制备方法。
【背景技术】
[0002] 我国川高原藏区冰葡萄酒产区的发现和冰葡萄酒产业项目的建设，将会把地域性 极强的不可替代不可复制的自然资源优势转化为市场竞争优势，促成具有国际竞争力的地 方特色产业和支柱产业的形成。冰葡萄酒作为葡萄酒中的贵族，酒香自然甜润醇美，澄澈清 亮，口感隽永，品质上乘。同时，冰葡萄酒中营养成分丰富，几乎包含了人体所必需的数十种 酶和氨基酸，具有养颜、美容、保健等生理功能，是不可多得的上乘佳酿。冰葡萄酒现已成为 世界葡萄酒市场上高端产品的代表。但是，由于受到科学认识的限制，冰葡萄酒一直处于家 庭作坊式和小产业生产，利用自然发酵酿造冰葡萄酒，产业发展速度极为缓慢。其生产依旧 维持在自然接种、自然发酵阶段，其销售仅囿于县域覆盖范围之内，因此，对传统冰葡萄产 业进行技术升级和标准化生产关键技术的研究开发已迫在眉睫。而冰葡萄酒标准化生产的 关键在于冰葡萄酒专用复合发酵菌剂的开发，市场所售的果酒等发酵剂容易使冰葡萄酒原 有的风味淡化，失去当地特色和独特的风味，不能满足四川高原藏区冰葡萄酒发酵。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种川藏高原冰葡萄酒 前期沉酿-中期快速启动-后期发酵三级复合发酵菌剂及其制备方法。
[0004] 本发明的技术方案如下：
[0005] -种川藏高原冰葡萄酒三级复合发酵菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0006] (1)酵母菌的扩大培养：将保藏编号：CGMCC6867的酵母菌Pichia manshurica、保 藏编号：CGMCC6866的Pichia anomala接种于培养基中，然后将其置于25°C的摇床中培养 24h，至活菌数为108cfu/mL，即制得复合酵母菌菌悬液；将扩大培养的混合菌种离心浓缩， 离心转速为4000r/min，时间为lOmin，得到离心浓缩物1号备用；
[0007] (2)酿酒酵母菌的扩大培养：将酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae和薛瓦酵 母Saccharomyces chevalieri接种于培养基中，然后将其置于25°C的摇床中培养24h，至 活菌数为108cfu/mL，即制得复合酵母菌菌悬液；
[0008] (3)将去籽后的冰葡萄果渣经高温灭菌后，按果渣重量的5% -13%添加所述离心 浓缩物1号和2号，离心浓缩物1号和2号重量比例为：3:2?5:4,放入20-28°C发酵箱中快 速发酵l〇-18h，-45?-30°C超低温冰箱中冷冻10-16h后或者采用二氧化碳干冰瞬间快速 冷冻后，取出放入真空冷冻干燥机中，在冷阱温度-45?-30°C、物料仓温度为-30?-35°C 条件下，真空度为〇. 90-0. 95MPa条件干燥24h后取出，经高速粉碎机粉碎后，即得到冰葡萄 酒前期沉酿发酵菌剂1号备用；
[0009] (4)中期快速发酵启动菌剂制备方法：取所述菌种离心浓缩物1号和2号按比例 混合，离心浓缩物1号和2号重量比例为：3:5?4:7,与占离心浓缩物1号和2号混合物量 的7%?10% (W/V，以下百分比皆为W/V)的水溶壳聚糖，3%乳清浓缩蛋白，10%的多孔淀 粉混合而成的包埋剂；或与占离心浓缩物1号和2号混合物量的20%的壳聚糖，8%的乳清 浓缩蛋白，10%的葡萄糖混合而成的包埋剂，即得到冰葡萄酒中期快速启动发酵菌剂2号 备用；
[0010] (5)后期发酵菌剂制备方法：取所述菌种离心浓缩物1号和2号共15?18g和3? 5g的多孔淀粉加入到pH值为5. 0?6. 5的水溶液中，离心浓缩物1号和2号重量比例为： 4:1?2:1 ;振荡1. 5?2. 5h后加入6?8g的海藻酸钠后搅拌0. 5?1. 5h，再将5?10mL 的2. 5% CaCl2溶液逐滴加入，固化25?35min后过滤，然后将其加入含有3?7%的醇溶 玉米浓缩蛋白和4%?6%醇溶小麦蛋白的乙醇溶液中，高速1200r/min搅拌1. 0?1. 5h， 将所得混合物放入喷雾装置内，装置的进口温度为83?87°C，出口温度为61?67°C，所得 后期发酵菌剂3号备用；
[0011] 将所述前期沉酿发酵菌剂1号、中期快速启动发酵菌剂2号和后期发酵菌剂3号 按照1:3:1. 5?1:5:3得重量比混合，或者将前期沉酿发酵菌剂1号单独真空小包装，中期 快速启动发酵菌剂2号和后期发酵菌剂3号按照3:2?5:4的重量比混合后真空小包装， 并将二个小包装经真空大包装即成为川藏高原冰葡萄酒前期沉酿-中期快速启动-后期发 酵三级复合发酵菌剂。
[0012] 所述的制备方法，所述步骤（1)中，所述的培养基成分为：1. 8%?2. 3%蛋白胨、 1. 9%?2. 2%葡萄糖、0· 9%?1. 1%酵母粉，ρΗ6· 8?7. 2。
[0013] 所述的制备方法，所述步骤（2)中，所述的培养基中包括4.5?5.5° Β?麦芽汁 1. 0L，琼脂14. 5?15. 5g，自然pH。将扩大培养的菌种离心浓缩，离心转速为4000r/min，时 间为lOmin，得到离心浓缩物2号备用。
[0014] 本发明以 Pichia manshurica (菌种保藏编号：CGMCC6867)、Pichia anomala (异 常毕赤酵母，菌种保藏编号：〔6]\〇^6866)、33(^1131'01115^68〇6^￥18136(酿酒酵母，购买自 中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC1450)和Saccharomyces chevalieri (薛瓦酵母， 购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC1424)为主要发酵菌，采用现代生物技术和 微囊制剂制备技术，制成川藏高原冰葡萄酒前期沉酿-中期快速启动-后期发酵三级复合 发酵菌剂，为冰葡萄酒标准化生产提供了核心技术，填补国内生产空白，这将对我国葡萄与 葡萄酒行业中高端产品的发展和适应市场消费需求起到积极的促进作用，符合了现实的地 方特色产业发展需要。
[0015] 本发明的主要特点：（1)采用前期沉酿-中期快速启动-后期发酵三级复合发酵 菌剂使川藏高原冰葡萄酒可以实现工业化生产，填补国内生产空白。（2)该三级复合发酵菌 剂所使用的主要菌种是从传统冰葡萄酒发酵过程中分离出来的主要功能菌，采用该三级复 合发酵菌进行冰葡萄酒的发酵，保持了传统川藏高原冰葡萄酒的风味和特征。（3)采用不同 性能的材料作为复合菌剂的包埋壁材，从而实现前期沉酿-中期快速启动-后期发酵的三 级发酵。（4)采用该三级复合发酵菌剂使川藏高原冰葡萄酒发酵时间缩短25%-35%，生产 效率提高80 % -100%，填补国内生产空白。
【具体实施方式】
[0016] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0017] 从阿坝州理县采摘成熟的威代尔冰葡萄进行榨汁处理，用虎红培养基从葡萄汁中 筛选出生长旺盛且特征明显的2株菌，通过平板划线分离出该株菌的单菌落，挑取单菌落 在液体PDA培养液中培养后用甘油保存菌株，放置在_20°C备用。取分离得到的酵母菌株划 线接种于WL培养基，28°C培养5d，观察菌落的颜色、形态、表面是否光滑、边缘是否整齐等 菌落特征。同时，在显微镜下观察酵母的细胞形态。以此对分离到的酵母菌株进行初步的形 态分类。在形态分类的基础上，选不同形态的2株酵母菌（XHU410和XHU411)采用18SrDNA 序列分析法对分离出的菌种进行分子鉴定，测序结果与数据库NCBI Blast比对后，再通 过Clustal XI. 8将代表序列与数据库中所得序列进行完全比对，确定该两种酵母菌分别 为 Pichia manshurica(XHU411)和 Pichia anomala(XHU410)，并于 2012 年 11 月 22 日送 交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路中国科学 院微生物研究所）保藏，保藏信息分别为：XHU411，分类命名Pichia manshurica，保藏编 号：CGMCC6867 ;XHU410,分类命名：异常毕赤酵母Pichia anomala，保藏编号：CGMCC6866)。
[0018] 酵母菌的扩大培养：将上述两株酵母菌Pichia manshurica(菌种保藏编 号：CGMCC6867)、Pichia anomala (菌种保藏编号：CGMCC6866)接种于培养基中，然后将其 置于25°C的摇床中培养24h，至活菌数为108cfu/mL，即制得复合酵母菌菌悬液；所述的培 养基成分为：1. 8%?2. 3%蛋白胨、1. 9%?2. 2%葡萄糖、0. 9%?1. 1%酵母粉，pH6. 8? 7. 2。将扩大培养的混合菌种离心浓缩，离心转速为4000r/min，时间为lOmin，得到离心浓 缩物1号备用。
[0019] 酿酒酵母菌的扩大培养：将Saccharomyces cerevisiae (酿酒酵母菌，购买自中 国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC1450)和Saccharomyces chevalieri (薛瓦酵母，购 买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC1424)接种于培养基中，然后将其置于25°C 的摇床中培养24h，至活菌数为108cfu/mL，即制得复合酵母菌菌悬液；所述的培养基中包括 4. 5?5. 5° Β?麦芽汁1. 0L，琼脂14. 5?15. 5g，自然pH。将扩大培养的菌种离心浓缩，离 心转速为4000r/min，时间为10min，得到离心浓缩物2号备用。
[0020] 川藏高原冰葡萄酒前期沉酿-中期快速启动-后期发酵三级复合发酵菌剂中，前 期沉酿发酵菌剂制备方法：将去籽后的冰葡萄果渣经高温灭菌后，按果渣重量的5% -13% 添加上述离心浓缩物1号和2号（离心浓缩物1号和2号重量比例为：3:2?5:4)，放入 20-28°C发酵箱中快速发酵10_18h，-45?-30°C超低温冰箱中冷冻10_16h后或者采用二 氧化碳干冰瞬间快速冷冻后，取出放入真空冷冻干燥机中，在冷阱温度-45?-30°C、物料 仓温度为-30?-35°C条件下，真空度为0. 90-0. 95MPa条件干燥24h后取出，经高速粉碎机 粉碎后，即得到冰葡萄酒前期沉酿发酵菌剂1号备用。
[0021] 中期快速发酵启动菌剂制备方法：取上述菌种离心浓缩物1号和2号按比例混合 (离心浓缩物1号和2号重量比例为：3:5?4:7)，与占离心浓缩物1号和2号混合物量 的7%?10% (W/V，以下百分比皆为W/V)的水溶壳聚糖，3%乳清浓缩蛋白，10%的多孔淀 粉混合而成的包埋剂；或与占复合酵母菌悬液总量的20%的壳聚糖，8%的乳清浓缩蛋白， 10%的葡萄糖混合而成的包埋剂，即得到冰葡萄酒中期快速启动发酵菌剂2号备用。
[0022] 后期发酵菌剂制备方法：取上述菌种离心浓缩物1号和2号（离心浓缩物1号和 2号重量比例为：4:1?2:1)15?18g，3?5g的多孔淀粉加入到pH值为5.0?6. 5的水 溶液中，振荡1. 5?2. 5h后加入6?8g的海藻酸钠后搅拌0. 5?1. 5h，再将5?lOmL的 2. 5% CaCl2溶液逐滴加入，固化25?35min后过滤，然后将其加入含有3?7%的醇溶玉 米醇溶浓缩蛋白和4%?6%醇溶小麦蛋白的乙醇溶液中（乙醇含量为15?18% )，高速 1200r/min搅拌1. 0?1. 5h，采用低温喷雾干燥法，将上述所得混合物放入喷雾装置内，装 置的进口温度为83?87°C，出口温度为61?67°C，所得后期发酵菌剂3号备用。
[0023] -种川藏高原冰葡萄酒前期沉酿-中期快速启动-后期发酵三级复合发酵菌剂及 其制备方法：
[0024] 将上述前期沉酿发酵菌剂、中期快速启动发酵菌剂和后期发酵菌剂按照 1:3:1. 5?1:5:3 (重量）混合，或者将前期沉酿发酵菌剂单独真空小包装，中期快速启动发 酵菌剂和后期发酵菌剂按照3:2?5:4 (重量）混合后真空小包装，并将二者经真空大包装 即成为一种川藏高原冰葡萄酒前期沉酿-中期快速启动-后期发酵三级复合发酵菌剂及其 制备方法。
[0025] 本发明的采用不同性能的材料作为复合菌剂的包埋壁材，所使用的主要菌种是从 传统冰葡萄酒发酵过程中分离出来的主要功能菌，采用先进的现代技术，制备出了前期沉 酿-中期快速启动-后期发酵三级复合发酵菌剂，从而实现前期沉酿-中期快速启动-后 期发酵的三级发酵，并保持了传统川藏高原冰葡萄酒的风味和特征，使冰葡萄酒发酵时间 缩短25 % -35 %，生产效率提高80 % -100 %，该复合菌剂使川藏高原冰葡萄酒可以实现工 业化生产，填补国内生产空白。
[0026] 应用实例：
[0027] 本发明另一方面提供了一种前期沉酿-中期快速启动-后期发酵三级复合发酵菌 剂生产冰葡萄的酿造工艺。具体工艺流程分为四个阶段，（1)冰葡萄原料预处理；（2)加入 复合发酵菌剂；（3)启动三级发酵；（4)后加工处理。
[0028] 冰冻葡萄一采摘、分选一压榨一葡萄原汁添加 5-7%复合发酵菌剂一沉酿一澄清 -启动发酵一冷冻一后期发酵一过滤除菌一灌装一成品冰酒。
[0029] 1)采摘分选
[0030] 延缓葡萄采收期至严冬，让葡萄经过几次冰冻和解冻的过程。检测葡萄汁中含糖 量以及总酸含量，当葡萄汁含糖量约为320-360g/L(以葡萄糖计），总酸约为8. 0-12. 0g/ L(以酒石酸计）时进行采摘。采摘分选冰葡萄在_7°C _9°C下进行，采摘过程必须用手工小 心仔细采摘，选择无生青、病腐果立即压榨。
[0031] 2)压榨
[0032] 在压榨过程中，采用分级控温连续压榨机组进行压榨，使压榨温度严格控制在 在-7---iTC。同时，压榨汁按80mg/L计算添加亚硫酸。
[0033] 3)三级发酵
[0034] 3. 1菌剂加入
[0035] 在已经压榨好的冰葡萄原汁中，添加5-7wt%复合发酵菌剂，启动前期沉酿过程。
[0036] 3. 2三级发酵
[0037] 采用三级低温发酵方式进行发酵，一级沉酿发酵：发酵温度为7°C _8°C，发酵时 间为4-6天，在粉碎的葡萄果皮（可以带果皮发酵）下沉的过程中，添加的发酵菌剂中 的前期沉酿专用的发酵菌剂，能够在果皮等沉淀物的下沉过程中启动发酵，并每隔2-3h
【权利要求】
1. 一种川藏高原冰葡萄酒三级复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 酵母菌的扩大培养：将保藏编号：CGMCC6867的酵母菌Pichia manshurica、保藏编 号：CGMCC6866的Pichia anomala接种于培养基中，然后将其置于25°C的摇床中培养24h， 至活菌数为108cfu/mL，即制得复合酵母菌菌悬液；将扩大培养的混合菌种离心浓缩，离心 转速为4000r/min，时间为lOmin，得到离心浓缩物1号备用； (2) 酿酒酵母菌的扩大培养：将酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae和薛瓦酵母 Saccharomyces chevalieri接种于培养基中，然后将其置于25°C的摇床中培养24h，至活 菌数为108cfu/mL，即制得复合酵母菌菌悬液； (3) 将去籽后的冰葡萄果渣经高温灭菌后，按果渣重量的5% -13%添加所述离心浓缩 物1号和2号，离心浓缩物1号和2号重量比例为：3: 2?5:4,放入20-28°C发酵箱中快速 发酵10-18h，-45?-30°C超低温冰箱中冷冻10_16h后或者采用二氧化碳干冰瞬间快速冷 冻后，取出放入真空冷冻干燥机中，在冷阱温度-45?-30°C、物料仓温度为-30?-35°C条 件下，真空度为0. 90-0. 95MPa条件干燥24h后取出，经高速粉碎机粉碎后，即得到冰葡萄酒 前期沉酿发酵菌剂1号备用； (4) 中期快速发酵启动菌剂制备方法：取所述菌种离心浓缩物1号和2号按比例混合， 离心浓缩物1号和2号重量比例为：3:5?4:7,与占离心浓缩物1号和2号混合物量的 7 %?10% (W/V，以下百分比皆为W/V)的水溶壳聚糖，3%乳清浓缩蛋白，10%的多孔淀粉 混合而成的包埋剂；或与占离心浓缩物1号和2号混合物量的20%的壳聚糖，8%的乳清浓 缩蛋白，10%的葡萄糖混合而成的包埋剂，即得到冰葡萄酒中期快速启动发酵菌剂2号备 用； (5) 后期发酵菌剂制备方法：取所述菌种离心浓缩物1号和2号共15?18g和3? 5g的多孔淀粉加入到pH值为5. 0?6. 5的水溶液中，离心浓缩物1号和2号重量比例为： 4:1?2:1 ;振荡1. 5?2. 5h后加入6?8g的海藻酸钠后搅拌0. 5?1. 5h，再将5?10mL 的2. 5% CaCl2溶液逐滴加入，固化25?35min后过滤，然后将其加入含有3?7%的醇溶 玉米浓缩蛋白和4%?6%醇溶小麦蛋白的乙醇溶液中，高速1200r/min搅拌1. 0?1. 5h， 将所得混合物放入喷雾装置内，装置的进口温度为83?87°C，出口温度为61?67°C，所得 后期发酵菌剂3号备用； 将所述前期沉酿发酵菌剂1号、中期快速启动发酵菌剂2号和后期发酵菌剂3号按照 1:3:1. 5?1:5:3得重量比混合，或者将前期沉酿发酵菌剂1号单独真空小包装，中期快速 启动发酵菌剂2号和后期发酵菌剂3号按照3:2?5:4的重量比混合后真空小包装，并将 二个小包装经真空大包装即成为川藏高原冰葡萄酒前期沉酿-中期快速启动-后期发酵三 级复合发酵菌剂。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)中，所述的培养基成分 为：L 8%?2. 3%蛋白胨、L 9%?2. 2%葡萄糖、0· 9%?L 1%酵母粉，ρΗ6· 8?7. 2。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)中，所述的培养基中包 括4. 5?5. 5° Β?麦芽汁1. 0L，琼脂14. 5?15. 5g，自然pH。将扩大培养的菌种离心浓缩， 离心转速为4000r/min，时间为10min，得到离心浓缩物2号备用。
4. 根据权利要求1或2所述的制备方法制备的川藏高原冰葡萄酒三级复合发酵菌剂。
【文档编号】C12N1/18GK104120087SQ201410363460
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2013年10月17日
【发明者】邢亚阁, 许青莲, 车振明, 罗建峰, 尹燕, 唐渝成, 刘平, 蒋丽, 孙丛珊, 曹东, 张丽珠 申请人:西华大学